Culture Explant neurali di Xenopus laevis

Lo scopo di questa procedura è quello di coltivare i coni di crescita di Xenopus Lavis per la successiva analisi delle immagini ad alta risoluzione. Ciò si ottiene iniettando prima nelle rane femmine l'ormone per stimolare la produzione di uova. Il secondo passo consiste nel raccogliere e fecondare gli ovuli, quindi iniettarli con mRNA o altri costrutti di interesse.

Il giorno successivo, gli embrioni vengono sezionati e i tubi neurali vengono isolati, tagliati e piastrati su vetrini. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare gli assoni e i coni di crescita in uscita. In definitiva, la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione può essere utilizzata per mostrare i cambiamenti nella localizzazione delle proteine nei coni di crescita nel tempo.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le dissezioni del tubo neurale possono essere difficili da apprendere leggendo una sezione del metodo senza osservare la tecnica in prima persona. Ottenere uova da rane femmine precedentemente iniettate con 400 unità di gonadotropina corionica da 12 a 14 ore prima. Raccogli le uova in una soluzione di suoneria modificata con segni X.

Quindi fertilizzare l'X raccolto in vitro con i mince testicoli come descritto in precedenza e aggiungere 0,1 XMMR dopo almeno 20 minuti. Rimuovere il terreno e incubare gli embrioni in cisteina al 2% in un XMMR a pH 7,8 per tre-cinque minuti per rimuovere il rivestimento gelatinoso dell'embrione. Quindi versare gli embrioni in un becher.

Successivamente, lavare gli embrioni con 0,1 XMMR o 0,1 x soluzione salina da bagno modificata da tre a cinque volte dopo il lavaggio finale. Conservare gli embrioni in XMMR 0,1 a temperatura ambiente fino all'iniezione o se lo si desidera. Posizionare gli embrioni a una temperatura compresa tra 14 e 18 gradi Celsius per rallentare lo sviluppo prima dell'iniezione.

Diluire l'RNA tappato precedentemente preparato a una concentrazione finale di 50-200 picogrammi di litro di banana con doppia distillazione, quindi conservare in ghiaccio fino alla micro iniezione. Successivamente, preparare l'ago per iniezione tirando un capillare di silicato bo utilizzando un estrattore di suter o uno strumento simile. Quindi, al microscopio, utilizzare una pinza per rompere la punta dell'ago ad angolo per generare una forma simile a una penna d'oca e riempire l'ago con 0,5-un microlitro della soluzione di RNA diluita.

Montare l'ago sul micromanipolatore In questo caso viene utilizzato l'iniettore PLI 100 PICO di un sistema medico. Ora, metti gli embrioni fecondati allo stadio da una a quattro cellule in un piatto di plastica contenente il 5% di fol in 0,1 XMMR. Calibrare il volume di iniezione per ogni nuova micropipetta utilizzando un micrometro radicale o da tavolino.

Quindi impostare l'iniettore pico in modo che fornisca la quantità desiderata di RNA per ogni iniezione. Qui viene utilizzato un volume di iniezione di un nanolitro. Tenere gli embrioni con una pinza o, se si preferisce, posizionarli su una piattaforma di supporto e iniettare il volume desiderato nei blaster per animali.

Distribuire le iniezioni in diverse posizioni in tutto l'embrione per ottenere una distribuzione uniforme dell'RNA. Vengono effettuate da una a due iniezioni in ogni blaster per un embrione in stadio di quattro cellule, mentre da due a quattro iniezioni vengono utilizzate per un embrione in stadio di due cellule. Dopo le iniezioni, trasferire gli embrioni iniettati in una capsula di plastica contenente 0,1 XMMR e lasciarli sviluppare fino allo stadio 20-23.

A seconda della velocità di sviluppo desiderata, gli embrioni vengono incubati a una temperatura compresa tra 14 e 22 gradi Celsius, rivestire le piastre di coltura trattate con PLL con 10 microgrammi per millilitro di laminina in PBS e posizionare le piastre a 37 gradi Celsius per un'ora. Una volta trascorso il tempo di incubazione, lavare le piastre tre volte con PBS facendo attenzione a non lasciare che la superficie rivestita di laminina venga esposta all'aria dopo il lavaggio finale. Sostituire il PBS con i terreni di coltura.

Infine preparare tre piatti rivestiti di agros ricoprendo il fondo di un piatto coltivato con l'1%aros in 0,1 XMMR e lasciandolo indurire. Una volta indurito, riempire un piatto con la variabilità del terreno di Steinberg nell'espressione dell'mRNA iniettato può far sì che gli embrioni mostrino un mosaico di fluorescenza prima di eseguire le dissezioni. Esaminare gli embrioni per la presenza di fluorescenza e identificare quegli embrioni che esprimono la proteina di fusione fluorescente nel tubo neurale.

Quindi trasferire gli embrioni fluorescenti allo stadio da 20 a 23 nel piatto di plastica rivestito di agros contenente i terreni di Steinberg. Posizionare la capsula sotto un microscopio da dissezione e utilizzare una pinza fine per rimuovere la membrana vitellina. Quindi, mentre una pinza tiene l'embrione in posizione, usa la seconda per praticare un'incisione sul lato dell'embrione ed esporre l'interno cavo.

Quindi, usa entrambe le serie di pinze per pizzicare il tessuto tra la metà dorsale e ventrale dell'embrione per tagliare l'embrione a metà e isolare la parte dorsale contenente il tubo neurale. Mettere l'X dorsale explan in una provetta da microcentrifuga contenente due milligrammi per millilitro, collagenasi nel terreno di Steinberg e metterla su un rotatore per 15-20 minuti. Quindi trasferire l'explan dorsale in un piatto rivestito di agro riempito con terreno di Steinberg fresco.

Mentre si lavora al microscopio, sezionare il tubo neurale dall'epidermide dorsale e dal Noor ventrale facendo scivolare la punta della pinza tra l'epidermide e il tessuto sottostante e tirando lentamente indietro l'epidermide. Quindi usa una pinza per trattenere il tessuto e un'altra per rimuovere il tessuto che circonda il tubo neurale. Quindi, trasferire il tubo neurale sezionato in un piatto rivestito di agros riempito con terreni di coltura freschi.

Una volta raccolti diversi tubi neurali, si affilano aghi di tungsteno o pinze per tagliare ogni tubo in circa 20 pezzi. Quindi impiattare i pezzi sui piatti di coltura rivestiti di laminina, distribuendo le melanzane in file uniformemente. Dopo aver placcato i tubi neurali, le piastre non devono essere spostate in quanto ciò disturberebbe l'attaccamento delle cellule.

Incubare l'explan del tubo neurale placcato a 20-22 gradi Celsius. Non è necessario un incubatore per colture cellulari per la coltura dei neuroni XUS lavis da 12 a 24 ore dopo la piastratura dei neuroni dell'immagine e dei coni di crescita a temperatura ambiente. Tieni presente che l'espressione variabile dell'RNA può portare a una gamma di livelli di fluorescenza tra i coni di crescita.

Questa immagine DIC mostra assoni e neuriti che crescono fuori dall'explan X nell'angolo in alto a sinistra del campo visivo. La barra della scala in questa immagine e nelle immagini seguenti rappresenta 10 micron. Questo filmato con ingrandimento più elevato mostra il cono di crescita sulla punta di un assone in crescita.

Infine, questo filmato al microscopio a fluorescenza mostra l'espressione di EB one GFP in un cono di crescita. Mentre qui, forniamo l'esempio dell'imaging, la proteina di fusione della punta più EB una GFP. Questo metodo di espianto neurale può essere applicato a qualsiasi numero di proteine per chiarire i loro comportamenti all'interno del cono di crescita durante la crescita dei neuriti.