플라즈마 단백질 보존을위한 혈액 수집 장비로부터 게놈 DNA를 추출하는 실제적이고 새로운 방법

Biology

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Summary

우리는 플라즈마 / 혈청 수집 전혈로부터 게놈 DNA를 분리하는 새로운 방법을 설명합니다. 혈장 수집 후, 압축 된 혈액은 일반적으로 삭제됩니다. 우리의 새로운 방법은 기존의 방법에 비해 상당한 개선을 대표하고 추가 혈액을 요청하지 않고, DNA와 단일 컬렉션에서 사용할 수있는 플라즈마를 만든다.

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Waters, J., Dhere, V., Benjamin, A., Sekar, A., Kumar, A., Prahalad, S., et al. A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation. J. Vis. Exp. (75), e4241, doi:10.3791/4241 (2013).

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Abstract

실험실 테스트는 혈액의 세포 또는 액체 부분에서 수행 할 수 있습니다. 다른 혈액 수집 관의 사용은 분석 할 수있는 혈액 (전혈, 혈장 또는 혈청)의 부분을 결정합니다. 인간 질환의 유전 적 기초를 공부에 관련된 연구소 게놈 / 유전자 분석을위한 DNA의 소스로 EDTA를 함유 vacutainer에서 수집 된 항 응고 전체 혈액에 의존하고 있습니다. 대부분의 임상 실험실 표현형 결과 조사의 첫 단계로 생화학 적, 혈청 학적 및 바이러스 검사를 실시하고 있기 때문에, 항 응고 혈액은 헤파린 함유 튜브 (플라즈마 튜브)에 수집됩니다. DNA와 플라즈마 게놈과 프로테옴 데이터 모두를 동시에 병렬 분석에 필요한 그러므로 때, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 헤파린 튜브 모두에​​서 혈액을 수집하는 것이 관례이다. 혈액은 하나의 튜브에 수집 혈장과 DNA 모두에 대한 소스 역할을 할 수 있다면, 그 방법은 기존의 마약을 발전 간주됩니다ODS. 혈장 추출 후 압축 혈액의 사용은 이렇게 처리 된 혈액 샘플의 양을 최소화하고 각 환자에서 필요한 샘플 수를 줄여, 게놈 DNA의 대체 소스를 나타냅니다. 이것은 궁극적 시간과 자원을 절약합니다.

혈장 단백질 보존 BD P100 혈액 수집 시스템은 인간의 혈액에서 더 나은 단백질 바이오 마커 발견 및 프로테오믹스 실험을 가능하게 혈액의 단백질 함량을 안정화하기 위해, 이전의 혈장 또는 혈청 수집 관 1 이상 개선 된 방법으로 만들어졌습니다. BD P100 관은 15.8 분무 건조 K2EDTA ㎖의 응고를 방지하고 혈장 단백질을 안정화하는 단백질 분해 효소 억제제의 동결 건조 독점 넓은 스펙트럼 칵테일이 포함되어 있습니다. 또한 원심 분리 후 혈장과 세포 펠렛 사이에 물리적 인 장벽을 제공하는 기계적 분리기를 포함한다. 몇 가지 방법이 응고 혈액 SA에서 DNA를 추출하기 위해 고안되었습니다mples 오래된 플라즈마 튜브에 2-4 모았습니다. 이 방법의 문제는 주로 튜브 (겔 구분) 내부 분리기의 종류와 관련된 응고 혈액을 복구하는 어려움, 단편화 또는 응고 분산의 불편과 분리 겔 응고 추출 방해 하였다.

우리는 새로운 BD P100 튜브에 그려진 혈액에서 게놈 DNA를 추출하고 정화 첫 번째 방법을 제시한다. 우리는 P100 튜브에서 EDTA 튜브에서 그에게 DNA 샘플의 품질을 비교합니다. 우리의 접근 방식은 간단하고 효율적입니다. ) 혈액 수집, 2 기계적 분리기와 자당의 조합을 사용하여 기계적 분리기의 제거 및을 1) 플라즈마 BD P100 (BD 진단, 스파크, MD, USA)의 사용이 관 : 그것은 다음과 같이 네 가지 주요 단계를 포함 멸균 클립 금속 걸이, 3) 백혈구, 4를 포함 버피 코트 층의 분리)에서 게놈 DNA의 분리일반 상업 DNA 추출 키트 또는 유사한 표준 프로토콜을 사용하는 버피 코트.

Protocol

1. 시료 채취

  1. 적절한 동의와 개인의 혈액 샘플을 수집합니다. 각 개인에 대한, P100 튜브 (BD 진단, 프랭클린 호수, NY, USA)에 혈액의 4 ~ 5 ML을 그립니다. 비교를 위해 동시에 EDTA 튜브에 혈액을 수집합니다.
  2. BD P100 관은 15.8 ML 스프레이 건조 K2EDTA 응고를 방지하고 혈장 단백질을 안정화하는 단백질 분해 효소 억제제의 동결 건조 독점 넓은 스펙트럼 칵테일이 포함되어 있습니다. 또한 기계적 분리기가 포함되어 있습니다. 처리가 발생할 때까지 전체 혈액을 수집 한 후, 하룻밤에 60 분 동안 실온에서 모두 튜브를 유지합니다.
  3. 실온에서 15 분 동안 2천5백g에서 BD P100 튜브를 원심 분리기. 마이크로 원심 분리기 튜브에 기계적 분리 위에서 수집 된 플라즈마를 전송합니다.
  4. -80에서 분리 아래 압축 혈액을 포함, P100 튜브를 저장 ° C가 DNA 내선을 시작할 준비가 될 때까지raction.

P100 튜브의 혈액 (P100_DNA)에서 2.1

  1. P100 튜브 -80에 저장됩니다 ° C 혈장 추출 후. 3~4개월에서 5 분 (그림 1A)를위한 물을 욕조에 37 °에서 냉동 및 해동에서 압축 된 혈액을 포함하는 P100 튜브를 검색 할 수 있습니다. 분리 위에 앉아 남아있는 혈장을 제거합니다. 구분 위의 P100 튜브 (그림 1B)의 - 17 % 자당 용액 (게시되지 않은 데이터 집에서 테스트 그라데이션 용액) 2 ㎖를 추가합니다. 2천5백그램에서 20 분 동안 실온에서 튜브를 원심 분리기,이 프로세스는 튜브의 상단에 기계적 분리기를 밀어 버피 코트 (그림 1C) 등 솔루션의 세 가지 레이어를 생성합니다. 수동 steriled 갈고리 금속 클립 (그림 1D)를 사용하여 구분을 추출합니다.
  2. 각 튜브 (그림 1D)에서 기계적 분리기를 검색 한 후, 제거하고 discarD 최고 자당 층. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 버피 코트 (BC) 계층을 나타내는 중간 계층, 전송합니다. 3 ML에 버피 코트 볼륨을 높이려면 인산 버퍼 식염수 (PBS)를 추가합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 Qiagen의 Puregene 혈액 키트의 시약을 사용하여 버피 코트에서 DNA를 추출, 2,500그램의 원심 분리 속도 (대신 2천g의)를 제외하고.
  3. 적혈구 (RBC)를 용해하고 제거하는, 버피 코트 3 ㎖에 RBC 용해의 10 ML을 추가합니다. 각 튜브를 여러 번 반전하고 배양하는 동안 가끔 반전 10 분 실온에서 알을 품다. 5 분 2,500 g에서 각 혼합물을 스핀 다운 및 뜨는 폐기하십시오. 15 초 동안 세포 용해 용액과 소용돌이 3 ㎖ 각 튜브에 남아있는 펠렛을 처리합니다. 1 단백질 침전 용액의 mL를 15 초 동안 소용돌이와 해물을 취급합니다.
  4. 5 분 2,500 g로 원심 분리 포함 신선한 15 ML 원뿔 튜브에 뜨는을 전송100 % 이소프로판올 3 ㎖. 3 분 2,500 g에서 새로운 튜브 10 배와 원심 분리기를 반전. 뜨는을 취소하고 70 % 에탄올 1 ML을 추가합니다. 원뿔 관에게 DNA 펠렛을 이동시키다 씻어 몇 번 반전. 1 분 2,500 g에서 원심 분리기. 펠렛은 상온에서 3 분 (거꾸로 튜브를 배치)에 대한 건조 후 10 분, 미리 표시 1.7 ML의 모세관로 전송하여 37 ° C에서 수분 보충 용액 250 ml의 DNA를 일시 중단 할 수 있습니다. -80에서 튜브를 저장 ° C를 사용하기 전까지.

EDTA Ttube의 피 (EDTA_DNA)에서 2.2

  1. 일상 immunohematology 테스트를위한 전체 혈액 K 2 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 10.8 밀리그램 스프레이 코팅 및 -80 ° C.에 저장 플라스틱 vaccutainer 튜브에 수집 튜브는 기계적 분리기를 포함하지 않기 때문에, DNA 추출은 기계적 분리기 (2.1.1 및 2.1.2)를 포함하는 단계를 포함하지 않습니다.
  2. 혈액 저장, DN의 3~4개월 이내이 물총새 플렉스 (써모 피셔 과학, 보스턴, MA, USA)를 사용하여 추출됩니다. 그것은 자기 입자 기술을 기반으로하고 세포 용해 / DNA 바인딩, 여러 가지 세척 단계와 DNA의 용출로 구성 자동화 DNA 추출 시스템입니다.
  3. DNA 추출에 사용되는 장비는 물총새 플렉스 24 DNA 혈액 키트 (Qiagen의, 독일)입니다.

3. DNA 수량 및 품질 평가

게놈 DNA의 양, 품질, 무결성 picogreen, 분광학 및 전기를 포함 방법의 조합에 의해 평가되었다.

  1. 게놈 DNA의 농도는 Nanodrop 분광 및 picogreen 정량에 의해 결정됩니다.
  2. 순도 Nanodrop 분광 광도계에 280분의 260 비율 측정에서 결정됩니다.
  3. 샘플 (500 NG)도 DNA의 무결성 (저하)를 평가하기 위해 1 % 아가로 오스 겔에로드됩니다.

4. GenotypinG 분석 실험 및 품질 관리

  1. 다섯 P100_DNA와 해당 EDTA_DNA 샘플은 무작위로 지정 Immunochip (면역 DNA 분석 BeadChip)를 사용하여 추가 분석을 위해 선택됩니다. Immunochip는 196,524 다형성을 포함하는 Infinium 유전형 칩과 immunogenetic 연구 5를 위해 디자인된다.
  2. 각 샘플은 DNA 200 NG는, 조각난 증폭 시켰던하고 적절한 하이브리드 버퍼에 재현 탁하고 있습니다.
  3. 변성 샘플은 16 시간의 최소 48 ° C에서 Immunochips에 교배되어 있습니다.
  4. 하이브리드 후에 Immunochips는 단일 염기 확장 반응과 스테인드에 대해 처리됩니다.
  5. immunochips은 다음 Illumina의 Hiscan 비드 어레이 리더 정규화 된 비드 강도 데이터는 Illumina의 GenomeStudio 소프트웨어에로드 유전자형으로 변환을 사용하여 몇 군데 있습니다. 유전자형은 GenomeStudio의 autocalling 알고리즘을 사용하여 호출합니다. 의 품질 관리콜금리 <95 %의 단일 염기 다형성의 배제 (SNPs를)를 volves.
  6. SNP 통화의 환율을 immunochip 분석 효율의 척도로 사용됩니다. 그것은 자동 유전자형 할당을 받기에 충분한 신호 강도 및 품질을 달성 칩 (196524 SNP를 각각의 칩에 인코딩)에 대한 분석의 총 수의 백분율로 계산됩니다. 고품질 DNA는 (260 / 1.8 280 비율 이상 및 열화의 유무) immunochip 분석에 포함 된 HapMap 제어 DNA로 적어도 동일한 통화 비율을 달성 할 것으로 예상된다. 품질 관리는 콜금리 <95 % 각 데이터 세트와 SNP는 제외를 포함한다.

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Representative Results

DNA의 품질 평가 및 농도 측정

P100_DNAs의 수율 EDTA_DNAs (표 1과 2)에 비해 유의하게 낮았다. 그 280분의 260 비율 값으로 표시 DNA 순도 P100_DNA 및 EDTA_DNA 샘플 세트 (테이블 1과 2) 모두 비슷합니다. DNA의 품질은 샘플의 각 집합 일부 저하가 EDTA_DNA 샘플에서 볼 수 있지만, 같은 (그림 2) 빛 번짐으로 표시 내에서 비교적 균일 한 것입니다. 분해의 더 많은 징후를 보여 주었다 EDTA_DNAs도 감소 DNA 농도를 보였다.

유전자형

EDTA_DNAs 및 P100_DNAs 모두 유전자형 통화의 환율을 비교 하​​였다. 그들은 유사한 통화 요금이 나왔고 두 내부 HapMap 제어 DNA (표 3)을 비교 하였다.

그림 1. 버피 코트 격리.

그림 1
표 1. DNA 샘플 수익률 (PicoGreen)와 비 (Nanodrop 분광).

DNA 수익률 DNA 순도
샘플 P100 EDTA P100 EDTA
1 135 340 1.79 1.9
2 119 344 1.85 1.89
3 57 129 1.88 1.88
4 159 640 1.86 1.88
5 140 430 1.86 1.88
6 150 673 1.86 1.9
7 139 425 1.74 1.88
8 118 240 1.87 1.86
9 51 86 1.87 1.83
p 값이 p = 0.00221 p = 0.09836

표 2. 수율 및 순도 비교 (양측, 쌍 표본 t 검정).

순서 = "1">
셀 속도 유전자형
샘플 P100 EDTA
1 97.9 97.5
2 97.9 97.8
4 97.4 97.5
7 97.5 98.2
8 97.9 98
P 값 p = 0.67970

표 3. 유전자형 콜금리 (양측, 쌍 표본 t 검정).

"> P100_06
샘플 레이어 수익률 (μg) 비율 (280분의 260)
버피 코트 150 1.86
RBC 4.13 1.73
P100_07 버피 코트 139 1.74
RBC 1.00 1.70
P100_08 버피 코트 118 1.87
RBC 3.72 1.78
P100_09 버피 코트 51 1.87
RBC 0.23 0.98

부록. 적혈구 (RBC) 층에서 발견 된 DNA의 양을 평가.

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Discussion

많은 인간의 질병은 유전 적 원인을 가지고 인간의 질병의 유전 기초를 탐구하는 것은 증가하고 고품질의 DNA를 요구한다. 유전자 연구에 사용 된 DNA의 가장 일반적인 소스는 전체 혈액 항응고제 있습니다. 대부분의 임상 실험실 표현형 결과 조사의 첫 단계로, 생화학 적 혈청 및 바이러스 검사를 실시하고 있기 때문에, 혈액은 종종 플라즈마 튜브에 수집됩니다. 플라즈마를 수집 한 후, 압축 된 혈액은 종종 무시됩니다. 따라서, DNA가 유전 연구 또는 테스트를 수행하기 위해 필요한 경우, 추가 채혈은 동일한 환자에서 필요합니다. 그것은 백혈구가 들어 있으므로 폐기 압축 혈액 DNA의 잠재적 인 소스를 나타냅니다. 따라서, 플라즈마 튜브의 압축 된 혈액을 사용하면 과잉 혈액을 그리거나 추가 혈액 환자를 호출 할 필요없이보다 효율적으로 수집 된 혈액 샘플을 사용하는 기회를 제공합니다.

예를 다양한 방법압축 또는 응고 된 혈액의 백혈구에서 요로 DNA는 6-10보고되었습니다. 이 방법의 문제의 대부분은 혈장 수집 관의 설계와 관련된했다. 이전 혈장 수집 튜브는 원심 분리하면 혈장 (구분 위에있는)에서 혈액 세포를 (구분 아래에 갇혀) 분리 장벽을 형성 젤 (겔 구분)으로 만든 분리기가 포함되어 있습니다. 젤 물자를 가진 혈액 세포의 오염을 방지하기 위해, 분리가 먼저 조심스럽게 튜브 (11)에서 제거해야합니다. 이 효율적인 DNA 추출을 보장하는 혈액 응고의 조각옵니다. 분열 과정은 종종 혈액 샘플의 상당한 손실과 DNA 수율의 감소 결과. 샘플 손실을 최소화하고 프로세스를 개선하기 위해 작은 구멍 메쉬 기계 작은 조각 12로 혈액 응고를 분산하는 데 사용하지만, 분열 여전히 영향을 DNA 수율과 품질 및 E되었다벤 기술자 13 건강 위험을 창설.

BD 생명 과학에서 BD P100 관 다기관 면역 학적 조사 연구 14에서 평가 혈장 수집 관의 최신 세대입니다. 이전 플라즈마 튜브처럼, 그들은 혈장 단백질을 안정화 응고 단백질 분해 효소 억제제를 방지하기 위해 항응고제가 포함되어 있습니다. BD P100 관의 주요 혁신은 각 튜브 내부의 기계적 분리기 (안 젤 분리)에 있습니다. 기계적 분리기는 원심 분리 후 혈장과 세포 펠렛 사이에 물리적 인 장벽을 제공하지만, 젤 분리는 달리, 겔 샘플 오염의 위험을 제공하지 않습니다. 본 연구에서 적용되는 프로토콜은 조각을 포함하지 않으므로 더 건강 위험의 위험이 없습니다.

DNA는 (DNA 추출을 참조) 상용 장비 프로토콜을 사용하여, 버피 코트에서 추출 하였다. BD P100 튜브에 압축 된 혈액 cryop했다DNA 추출하기 전에 3-4개월의 기간 동안 예약. EDTA 튜브 (EDTA_DNA)에서 추출 된 DNA는 해당 P100_DNA의 수율 및 품질 평가에서 대조군으로 사용 하였다. 이전의 연구 12,13,15에서 EDTA_DNA 샘플 수율 이전 플라즈마 튜브의 혈액에서 DNA보다 유의하게 높았다. 본 연구에서는 각 환자에서 수집 한 동일한 금액 전체에 혈액, 압축 혈액의 버피 코트 적은 DNA를 (표 2, p = 0.00221) 굴복. (부록을 참조 새 P100 플라즈마 튜브에 혈액에서 DNA를 추출하는 동안, 버피 해안에서 일부 백혈구는 적혈구 레이어에 손실됩니다 (아래에)하지만, 버피 코트에서 사람에 비해 DNA의 미미한 양을 나타냅니다 테이블). EDTA_DNAs와 본 수율의 변화는 P100_DNA가 종속 샘플입니다 것을 제안과 모방합니다. 높은 볼륨 샘플은 일반적으로 더 많은 DNA와 샘플을 얻을 것이다낮은 볼륨 및 / 또는 약간 저하 DNA 적은 DNA를 얻을 수있다.

아가로 오스 겔 (그림 2)에 대한 분석은 EDTA_DNAs은 해당 P100_DNAs에서 볼 수없는 성능 저하의 징후 (얼룩)를 표시 것으로 나타났다. 특히, 낮은 수율 두 EDTA_DNA 샘플 (EDTA_01053 및 EDTA_06030) 다른 사람보다 더 얼룩을 보여줍니다. 그들의 연구에서, 웡 등. 11 증가 저장 시간 감소 DNA 수율을 보도했다. 우리의 저장소에있는 모든 혈액 샘플은 동일한 스토리지 상태로 실시되었으며 본 연구에서 사용 된 샘플 집합은 무작위로 선정 된 이후, 스토리지의 길이와 상태 P100_DNAs와 EDTA_DNAs 사이의 아가로 오스 겔에 보이는 차이를 고려하지 않을 수 있습니다. 만 EDTA_DNAs 쇼 저하는 EDTA 튜브에 단백질 분해 효소 억제제의 부족과 연관 될 수 있다는 사실.

P100_DNAs 및 EDTA_DNAs의 순도는 유의 한 차이가 없었다 (

사용 된 샘플은 염증성 장 질환의 유전 연구에 모집했다. 따라서 추출 된 DNA 샘플의 성능을 비교하기 위해, immunochip 5 유전자형 테스트 플랫폼으로 선정되었다. immunochip는 면역 유전학 16, 17에 대한 고급 매핑 유전자형 플랫폼으로 사용되었습니다. SNP 유전자형 분석의 게놈 전체의 특성은 DNA의 성능 엄격한 척도로 사용되었다. 모든 DNA 테스트와 HapMap 제어 샘플의 평균 유전자형 전화 요금은 모든 칩에, 혈액 수집 튜브 모두에​​서 DNA의 비교 뛰어난 성능을 보여 각각 97.76 %와 97.4 %였다 (

결론

DNA는 플라즈마 단백질 체학 연구에 그려진 같은 혈액 샘플에서 게놈 테스트를 촉진 BD P100 튜브의 압축 된 혈액에서 분리 할 수​​ 있습니다. 우리의 결과는 P100 튜브의 연구 유틸리티를 확장합니다. P100에서 수집 된 혈액 세포 내용의 DNA는 게놈 분석에 사용할 수 있다는 사실이 프로테옴 게놈 둘 분석이 수행 될 수있는 연구를위한 샘플 수집을 간소화 할 수 있습니다. 따라서 적은 혈액은 각 인간의 피사체 필요와 연구 후원자 및 직원 관련 비용과 노력 절감이 향상됩니다. 설명 몇 가지 장점이 있습니다 :

  • 두 게놈 및 단백질 체학 연구가 수행 될 필요가 때 더 적은 혈액은 인간의 주제 당이 필요합니다. 이 그릴 수있는 혈액의 양에주의 제한을 필요로 질병 상태 환자 (백혈병 등)에 대한 특수 값입니다.
  • 하나의 혈액 튜브는 전체 프로토콜을 단순화, 샘플 수집 및 처리 단계에서 필요합니다.
  • 일상 상용 키트 BD P100 튜브에 수집 된 혈액에서 DNA를 추출에 효율적으로 입증되었습니다.
  • 사용, 획득 한 튜브의 처리와 관련된 비용 절감 효과가 증가합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD P100 tubes BD Diagnostics 366448
EDTA tubes BD Diagnostics 367863
Sucrose Sigma S9378
Paper clip Office product
15 ml tube Corning 430052
Red blood cells (RBC) Qiagen 158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS) Thermo Scientific SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) Qiagen 940054
1.7 ml microtubes Axygen MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit Illumina WG-352-1001
Bead array reader Illumina NA
GenomeStudio Software Illumina N/A

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References

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