عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور على الحمض النووي المزدوج حبلا البروتين كسر إشارة تنشيط ردا على الحمض النووي من التلف وكذلك التوطين خلال الانقسام.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beckta, J. M., Henderson, S. C., Valerie, K. Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins. J. Vis. Exp. (67), e4251, doi:10.3791/4251 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

انقر نقرا مزدوجا حبلا فواصل (DSBs) هي الأكثر ضررا آفات الحمض النووي خلية يمكن أن تواجهها. إذا تركت دون اصلاح، DSBs الميناء إمكانيات كبيرة لتوليد الطفرات والتشوهات الكروموسومية 1. لمنع هذه الصدمة من عدم الاستقرار الجيني تحفيز، لا بد للخلايا للكشف عن DSBs، تنشيط استجابة الحمض النووي من التلف (DDR)، وإصلاح الحمض النووي. عندما حفز، وDDR تعمل على الحفاظ على سلامة الجينوم عن طريق إحداث خلية للسماح اعتقال دورة للإصلاح أن يتم إجبار الخلية أو الخضوع لموت الخلايا المبرمج. الآليات السائدة لإصلاح جهاز تسوية المنازعات من خلال الانضمام تحدث في نهاية امتماثلان (NHEJ) وإعادة التركيب مثلي إصلاح (HRR) (مشاركة في 2). هناك العديد من البروتينات التي يجب أن أنشطة مدبرة بدقة لDDR بشكل صحيح. هنا، نحن تصف طريقة ل2 - و 3 الأبعاد (D) من التصور واحدة من هذه البروتينات، 53BP1.

البروتين P53 ملزم 1 (53BP1) يموضع إلى مناطقDSBs عن طريق الربط بين تعديل الهستونات 3،4، وتشكيل بؤر داخل 5-15 دقائق 5. ويعتقد أن التعديلات هيستون والتوظيف من البروتينات وغيرها من DDR 53BP1 إلى مواقع DSB لتسهيل إعادة ترتيب الهيكلية للونين حول مناطق الضرر والمساهمة في إصلاح الحمض النووي 6. إلى ما بعد المشاركة المباشرة في الإصلاح، وقد وصفت أدوار إضافية ل53BP1 في DDR، مثل تنظيم داخل نقطة تفتيش تابعة لل-S، G2 نقطة تفتيش / M، وتفعيل المصب البروتينات DDR 7-9. مؤخرا، تم اكتشاف أن 53BP1 لا تشكل بؤر ردا على الحمض النووي من التلف الناجم أثناء الانقسام، والانتظار بدلا من ذلك لدخول الخلايا G1 قبل إضفاء الطابع المحلي على مقربة من DSBs 6. تم العثور على البروتينات مثل DDR 53BP1 لربط مع الهياكل الإنقسامية (مثل kinetochores) خلال التقدم من خلال الانقسام 10.

ونحن في هذا البروتوكول وصف استخدام 2 - 3-D والتصوير الخلية الحية لتصورتشكيل بؤر 53BP1 ردا على وكيل camptothecin DNA الضارة (CPT)، وكذلك السلوك 53BP1 خلال الانقسام. Camptothecin هو topoisomerase I المانع الذي يسبب في المقام الأول DSBs خلال تكرار الحمض النووي. لإنجاز هذا، استخدمنا الموصوفة سابقا 53BP1-mCherry انصهار بروتين فلوري بناء يتألف من مجال البروتين 53BP1 قادرة على ربط DSBs 11. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا هيستون H2B-GFP البروتين الانصهار الفلورسنت بناء قادرة على رصد ديناميات ونين في جميع أنحاء دورة الخلية ولكن بشكل خاص خلال الانقسام 12. الحية التصوير خلية في أبعاد متعددة هو أداة ممتازة لتعميق فهمنا لوظيفة البروتينات في الخلايا حقيقية النواة DDR.

Protocol

A. إعداد خلية

  1. تم الحصول على الخلايا الليفية الأولية العادية الإنسان (GM02270) من مستودع خلية Coriell، كامدن بولاية نيو جيرسي، وخلدت مع hTERT 6. كانت تزرع الخلايا وتوسعت في CellStar 6 سم الأطباق في وسائل الإعلام (4 مل)، ويتألف من MEM تستكمل مع مصل بقري جنيني 20٪ (GIBCO) والأحماض الأمينية non-essential/essential والفيتامينات والبيروفات الصوديوم، والبنسلين / الستربتوميسين (HyClone ).
  2. تم الحصول على الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) الخلايا من نوع مجموعة أمريكا الثقافة ونمت وتوسعت في CellStar 6 سم الأطباق. تم الاحتفاظ بها الخلايا في وسائل الإعلام (4 مل)، ويتألف من DMEM تستكمل مع الجنين البقري 10٪ المصل الأحماض غير الأساسية، الأمينية، L-الجلوتامين، والبنسلين / الستربتوميسين.
  3. 53BP1-mCherry (N-53BP1. Myc على WT-pLPC بورو؛ Addgene البلازميد 19836) وH2B-GFP (pCLNR-H2BG؛ 17735 البلازميد Addgene) الانصهار الجينات يبني معربا أيضا بوروميسين أو الجينات المقاومة G418، على التوالي، وtransduced (fibroblaSTS) أو بالنقل (HEK293) باستخدام SuperFect (Qiagene) في الخلايا والحفاظ عليها في إطار اختيار المخدرات. تم فحص دوري صيانة مضان.
  4. 24-48 ساعة قبل الحصول على الصور، وtrypsinized الخلايا في التعليق وحيدة الخلية والمصنف في مناطق ذات كثافة منخفضة 3.5 سم على لوحات FluroDish أسفل الزجاج.

B. إعداد المجهر والحصول على صورة

وقد تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام خلية زايس المراقب SD المجهر القرص الغزل مبائر مجهزة موقفا Z1 AxioObserver، ثنائي قناة Yokagawa CSU-X1A 5000 وحدة القرص الغزل، 2 Photometrics QuantEM 512SC الكاميرات emCCD، وهو 120C HXP الألياف المستندة إلى الضوء، 4 الليزر (أ 100MW Lasos متعدد الخطوط أرغون [458، 488، 514 نانومتر]، 50 ميغاواط الصمام الثنائي نانومتر 405، 40 ميغاواط الصمام الثنائي نانومتر 561، و 30 ميغاواط الصمام الثنائي نانومتر 635) حضانة زايس، AOTF، مرحلة Pecon multiS1 XL نظام الحضانة، وحدات (O 2 S وحدة، وحدة CO 2 S، S TempModule، تدفئة حدة XL S) وقبل شهرtorized XY المرحلة مع إدراج NanoScanZ Z بيزو. للحد من الانحرافات كروية في حين أن الخلايا الحية التصوير المعتمدة في وسط مائي، وC-لامزيغ المياه 63x/1.20 / كور عدسة الهدف وزايس الغمر W Immersol السائل (مع معامل الانكسار ن = 1.334) واستخدمت. ل 2 قناة مبائر التصوير، وهو مرآة مزدوج اللون RQFT 405/488/568/647 وBP525/50 (الخضراء) وBP629/62 (أحمر) واستخدمت المرشحات الانبعاثات. وكان برنامج نظام يستخدم زايس Axiovision (ver. 4.8.2.0) مع AV4 التصوير، Multi-channel/Z/T سريعة، علم وظائف الأعضاء، MosaiX، مارك والبحث، كاميرا مزدوجة، داخل 4D، ضبط تلقائي للصورة وحدات Deconvolution 3-D.

  1. تأكد من أن الغاز CO 2 يعمل على الوحدة 2 CO لنظام الحضانة. إذا كانت مدعومة من قبل المجهر الجدول مضادة للاهتزاز الهواء، تشغيل العرض الجوي (N 2 أو الغاز) للجدول الهواء.
  2. تشغيل الطاقة لموقف المجهر، والغزل وحدة القرص، والكاميرات، وحدات الحضانة، إضاءة HXP، مرحلة الآلية، الأرجونالليزر، وجهاز الكمبيوتر.
  3. بعد 1 دقيقة من وقت الاحماء، أدر مفتاح التشغيل ليزر الأرجون على "On".
  4. في وحدة التحكم لوحة زايس ليزر، تشغيل مفاتيح لخطوط ليزر لاستخدامها.
  5. تبديل التبديل تبديل للتحكم Lasos الليزر الأرجون من "وضع الاستعداد" إلى "تشغيل الليزر" وضبط وحدة تحكم الخفيفة إلى المستوى الأمثل (أي أقل قليلا من النقطة حيث المؤشر الأخضر إلى اللون الأحمر).
  6. بدء البرنامج AxioVision ملاحظة: يمكن تخصيص واجهة المستخدم عن AxioVision مع القوائم والنوافذ هدم-التي هي محددة لمجهر خاص والمكونات التي تسيطر عليها. على هذا النحو، كل نظام يحتوي على واجهة فريدة من نوعها محتملة. لذلك، يتم توفير إرشادات عامة للتلاعب في البرامج الخطوات اللاحقة، بدلا من الاتجاهات لبرنامج Windows محددة، علامات و / أو القوائم المنسدلة.
  7. حوالي 1 ساعة قبل التصوير، في البرنامج، حدد موقع ضوابط لالحاضنة وبدوره على تسخين لمجلس الشيوخ ولوحة المرحلة. تعيين درجة الحرارة إلى 37 ° C. بدوره على التحكم 2 CO وتعيين مستوى في 5٪.
  8. تحديد الهدف عدسة للتصوير. في هذه الدراسة، تم استخدام 63x/1.20 NA-C لامزيغ عدسة الهدف المياه / كور ملاحظة: للحصول على هذه العدسة، هناك حاجة إلى وسيلة الغمر مع معامل الانكسار مماثلة في المياه (زايس الغمر W Immersol السائل).
  9. إذا مواقف منفصلة متعددة لأخذ عينات على مدى فترة طويلة من الزمن، تكون معينة لتطبيق كمية كافية من الغمر المتوسطة لضمان أن يتم تنفيذ ذلك من وظيفة واحدة إلى أخرى.
  10. ضع الطبق على المسرح وتقديم عدسة الهدف حتى في اتصال مع القاع.
  11. باستخدام عناصر التحكم المجهر أو البرنامج، وإدارة الضوء المنبعث إلى العدسات المناسبة وحدد widefield مرشح المحددة للإشارة الفلورسنت ذات الاهتمام (لهذه الدراسة، "الأحمر" تصفية تعيين 53BP1 و "GFP" تصفية تعيين H2B ). </ لى>
  12. عرض من خلال عدسات العين، والتركيز على الصورة، وتحديد موقع حقل مناسبة من الخلايا.
  13. باستخدام البرنامج أو عناصر التحكم المجهر، توجيه الضوء المنبعث بعيدا عن العدسات إلى ميناء مع وحدة القرص الغزل مبائر.
  14. في البرنامج، قم بتشغيل الليزر المناسب (على هذه الدراسة، ليزر 561 نانومتر ل53BP1 والخط نانومتر 488 من الأرجون ليزر لH2B).
  15. لكل قناة، وضبط شدة الليزر عن طريق ضبط صوتية البصرية الانضباطي فلتر (AOTF) السيطرة على مستوى مناسب.
  16. حدد مرآة مزدوج اللون المناسب (RQFT 405/488/568/647) والمرشحات الانبعاثات (BP 629/62 ل53BP1 وBP 525/50 لH2B). فتح مصراع إلى وحدة القرص الغزل.
  17. حدد "لايف" نافذة لعرض الحقل الحالي من الرأي.
  18. في البرنامج، افتح "الكاميرا" التحكم، حدد لاستخدامها في الكاميرا (إذا كان نظام كاميرا مزدوجة) وتعيين وقت التعرض لحوالي 100 مللي. ضبط EM٪ وكسب واللجنة الوطنية للانتخاباتملاحظة ايساري: إن بناء 53BP1-mCherry تبدو قاتمة بعض الشيء. وجدنا أنه من المفيد لزيادة الربح EM.
  19. في البرنامج، افتح التحكم لوحدة القرص الغزل مبائر وضبط سرعة القرص الغزل من خلال إدخال زمن التعرض الكاميرا التي كان من المقرر أن التقاط صورة مناسبة (على سبيل المثال ~ 100 مللي ثانية). انقر فوق "تعيين" لقفل في التغيير.
  20. فتح "متعددة الأبعاد الاستحواذ". حدد علامة التبويب وتحميل قناة / تحديد القنوات المناسبة. لهذه الدراسة، ونحن باستخدام قنوات محددة لdsRed (561 نانومتر ليزر الإثارة وBP 629/62 فلتر للالانبعاثات) وGFP (488 نانومتر ليزر خط الإثارة وBP525/50 تصفية الانبعاثات).
  21. لضمان تسجيل الصور، واستخدم مرآة مزدوج اللون المشتركة (RQFT 405/488/568/647) لكل من القنوات. تعيين البرنامج ل"ضبط تلقائي للصورة" ملاحظة: الذهاب إلى أدوات → إعدادات محرر لضبط إعدادات MDA. ضمان أن يتم تعيين قوة الليزر الكافي ("كافية قوة الليزر" يشير إلى إعداد والتي تمكنكلإثارة fluorophore المناسبة مع تقليل الصور التبييض).
  22. في إطار MDA، حدد علامة التبويب Z-المكدس. حدد "Z-مكدس في موقف التركيز الحالي". تعيين نطاق لميكرومتر 10 ~ Z-كومة واختر "الأمثل" لعدد من الخطوات لضمان أخذ العينات من خلال ملاحظة نايكست Z.: حجم الدقيق للZ-مكدس سيعتمد على ارتفاع الخلايا الخاصة بك. ضبط وفقا لذلك.
  23. 23. (كان على سبيل المثال في هذه الدراسة، المهم أن الصورة نواة بأكملها) انقر على زر "ابدأ" وتحليل الناتج Z-مكدس الصورة لضمان الإعدادات المناسبة لما كنت التحقيق.
  24. حدد "T" (الوقت) التبويب. لدينا تجربة مع camptothecin، وضعنا الفاصلة بين timepoints التصوير ل5 دقائق ومدة الشامل للدورة لمدة 1 ساعة لعنصر تحكم (غير المعالجة الخلايا) الفيديو ملاحظة: للتقليل من الصور تبييض الخلايا، التجربة يجب أن يتم تكوين هذه الفراغات أن AOTF ليزر بين نقاط زمنية التصوير.
  25. Fأو متعددة النقاط التصوير من عدة خلايا في طبق، في إطار MDA، حدد علامة التبويب الموضع. ضمان "تطبيق" الإعداد قبل / بعد نقطة زمنية "في موقف" محددا. حدد "Mark_Find". باستخدام "لايف" عرض، نقل الطبق حول وحدد الحقول المناسبة للعرض.
  26. انقر على زر "ابدأ" في القائمة متعددة الأبعاد لبدء اكتساب التجربة وتسجيل فيديو التحكم (من الخلايا غير المعالجة).
  27. بعد الفيديو التحكم، إضافة العلاج المناسب (في هذه الحالة، 10 ميكرومتر camptothecin). سجلنا التجريبية (المخدرات المعالجة الخلايا) الفيديو على فترات 5-10 دقيقة لمدة 2-4 ساعة ملاحظة: هناك مسألة هامة للنظر هو السرعة التي يحدث تأثير معين بعد العلاج. كما رأينا في الفيديو، 53BP1 البؤر تبدأ في 5 دقائق من ~ بعد إضافة CPT. على الرغم من عملية سهلة نسبيا، مضيفا المخدرات إلى الطبق يدويا وإعادة معايرة المجهر يستغرق وقتا. يجب النظر في هذا عند تصميم التجارب.
  28. لرصد مitosis، وضعنا الفاصلة إلى 7.5 دقيقة وسجلت للموارد البشرية 4-5 (إعدادات محددة تعتمد على خط الخلية المستخدمة وطول دورة الخلية الخاصة به). قد تعديلات يجب القيام بها لمنع الصور تبيض خلال تسجيلات أطول.

C. معالجة الصور وتحليل

وقد تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام برنامج Volocity (PerkinElmer). البرمجيات المستخدمة للحصول على هذه البيانات (AxioVision) أيضا لديه القدرة على معالجة وتحليل الصور. ويتم تشجيع المستخدمين على الاستفادة من البرامج المتاحة لهم، والتشاور الأدب المناسبة فيما يتعلق تطبيقها.

  1. فتح برنامج Volocity. إنشاء وتسمية مكتبة جديدة، واستيراد ملفات الفيديو الخاصة بك.
  2. لعرض الملفات، نجد عادة مفيدة للغاية لاستخدام "الموسع التركيز" الإعداد. هذا تطغى على شرائح Z-مكدس و، لهذا البروتوكول، يتيح لنا أن تصور بؤر 53BP1 في مناطق مختلفة من النواة.
  3. ضبط أشرطة الفيديو حسب الضرورة. فووقد تم تجهيز locity مع مجموعة من الأدوات لتحسين نوعية الصور المكتسبة. من خلال ضمان الإعدادات على المجهر كانت ملائمة، يمكن حفظ الكثير من الوقت في وقت لاحق يوم التحرير. في كثير من الأحيان، فإنه من المفيد أن deconvolve الصور الخاصة بك، وضبط السطوع / التباين. سوف احتياجاتك التحرير محددة تختلف استنادا إلى التجربة.
  4. إضافة طابع زمني نسبي وشريط مقياس.
  5. لمشاهدة الخلايا في D-3، والتحول إلى "3-D التعتيم" الإعداد. هذا يسمح دوران الخلايا 3-D المقدمة في الفضاء، وبالتالي توفير وجهات نظر متعددة من هياكل ذات الاهتمام داخل الخلايا ملاحظة: ومن المفيد لتصور الخلايا في طائرات مختلفة لتحديد هياكل السفر حيث الفائدة. على سبيل المثال، في "التركيز الموسع" الإعداد من الصعب أن نتبين أن 53BP1 لا، في الواقع، فصل من DNA أثناء الانقسام. ومع ذلك، هذا يبدو واضحا في D-3.
  6. يمكن تصدير الأفلام والصور الثابتة إلى مجموعة متنوعة من أنواع الملفات على أساس تفضيل المستخدم. ط>

D. الممثل النتائج

ويرد مثال على تشكيل بؤر 53BP1 ردا على CPT في الشكل 1. الخلايا المعرضة لCPT شكل بؤر داخل 5-10 دقيقة، والحفاظ على هذه البؤر طوال فترة التسجيل. كما هو مبين في الشكل 2، 53BP1 تنأى من لونين في بداية الانقسام، وتشكيل الضباب رقيقة حول الكروموسومات التكثيف. كما يحدث الطور النهائي والانقسام إلى نهايته، 53BP1 مرة أخرى إلى بؤر المجاميع متميزة. بينما لم تتعرض الخلايا لHEK293 CPT، فإنها شكلت مع ذلك، عفوية وفيرة البؤر التي تم إنشاؤها بواسطة 53BP1 إصلاح الحمض النووي من التلف الذاتية. هذه الملاحظة يسمح لنا أن نستنتج أن 53BP1 لا تشكل بؤر خلال الانقسام في وقت مبكر، وذلك تمشيا مع التقرير السابق مما يدل على الأثر المماثل بعد تعرض الخلايا للإشعاع المؤين والمخدرات محاك للإشعاع 5.

لدى عودتهم 1 "SRC =" / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg "/>
الشكل 1. Camptothecin (10 ميكرومتر) يؤدي DSBs و53BP1 بؤر تشكيل الخلايا الليفية في ركوب الدراجات في غضون 30 دقيقة من المخدرات إضافة إلى المتوسط.

الشكل 2
الشكل 2. 53BP1 لا تشكل بؤر خلال الانقسام حتى في telophase/G1 HEK293 الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الحفاظ على سلامة الجينوم هو أمر حاسم لبقاء الخلية. الفشل في الحفاظ على نتائج الجينوم في الشيخوخة المبكرة، التسرطن أو الموت، 8. هناك اهتمام كبير في كيفية عمل المميزين DDR، النابعة من أهميته للبحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. وقد تم تطوير العديد من التقنيات على مدى السنوات للمساعدة في دراسة الخلايا كيف كشف وإصلاح الحمض النووي من التلف. وكانت الطرق التقليدية مثل كيمياء سيتولوجية مناعية والغربية النشاف الدعائم الأساسية في هذا المجال، على الرغم من التطورات الحديثة في التكنولوجيا قد سمحت أساليب متطورة على نحو متزايد في التطور. يعيش التصوير الخلية، كما هو مفصل في هذا البروتوكول، ويسمح لنا لدراسة خصائص DDR تجاهلها من قبل تقنيات أكثر تقليدية.

المركزية إلى استخدام التصوير الخلية الحية هو خلق البروتينات fluorescently المسمى. نحن هنا وصف استخدام بروتين mCherry الموسومة المشاركة في DDR، 53BP1، فضلا عن H2B هيستونGFP-المنتج الانصهار. وتستخدم على نطاق واسع البروتينات fluorescently المسمى في علم الأحياء الجزيئية والخلوية، إلا أنها لا تخلو من حدودها. ربط بنية الرواية إلى البروتين الذاتية يخلق خطر واضح من تغيير الوظيفة الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك، ويبني بعض سيتم التعبير على مستويات مختلفة في خطوط مختلفة من الخلايا، في ظل ظروف مختلفة. لاحظنا مستويات متباينة من الشدة الفلورية في كافة الخلايا المهندسة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة. وبناء 53BP1 المستخدمة في هذا البروتوكول تفتقر معظم المجالات الوظيفية، إلا أنه يحتفظ القدرة على ربط مواقع الحمض النووي من التلف الذي لا يبدو أن تؤثر سلبا على الخلايا 2.

بالإضافة إلى ذلك، فإنه من المهم النظر في طريقة توصيل الجينات. في هذا البروتوكول، كنا طريقتين: تنبيغ lentiviral وترنسفكأيشن مستقرة. وثابت لدينا الفيروسة البطيئة المصابين خلايا transduced مع بناء الفلورية؛ولذلك، فإنها لا تزال في التعبير عن هذه البروتينات إلى أجل غير مسمى. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو أكثر كثيفة العمالة إلى حد ما بالمقارنة مع ترنسفكأيشن وتمليها أي نوع من الخلايا مستهدفون، وبعض الخلايا ليست قابلة للترنسفكأيشن كفاءة. من ناحية أخرى، lentiviruses يستطيعون دخول معظم الخلايا، بما في ذلك الإنسان. ويتم تشجيع المحققين لوزن إيجابيات وسلبيات كل طريقة لعندما يتعلق الأمر تجاربهم الخاصة. كوسيلة ممكنة للتحايل على المشاكل المتأصلة في البروتينات fluorescently المسمى، وقد أبلغ مؤخرا استخدام الخلايا قابلة للاختراق تحقيقات fluorescently المسمى خلية حية للتجارب 10. ومع ذلك، هذه التقنية لم يتم بعد تطويره بالكامل.

من المزايا الرئيسية لخلية حية التصوير هو القدرة على دراسة العلاقات الزمانية المكانية من DDR وإصلاح جهاز تسوية المنازعات. في الواقع، كانت ديميتروفا وآخرون (2008) قادرة على مراقبة الخلايا الحية fluorescently المسمى وتكشف الرواية فيتشكيل المتعلقة 53BP1 ملزمة لالتيلوميرات وكيف يؤثر على ديناميكية لونين. وهذا التحليل يكون أكثر تحديا كبيرا، وإن لم يكن من المستحيل، مع أساليب أخرى. لديها القدرة على رصد DDR في كل من المكان والزمان يسمح لنا أن نستشف الوظائف والعلاقات التي كنا قد نغفل خلاف ذلك.

وخلاصة القول، وذلك باستخدام الخلايا الحية التصوير تمكن الباحثون من رصد حركية تشكيل جهاز تسوية المنازعات وحلها في الوقت الحقيقي، ويسمح التحليل الكمي على مستوى خلية واحدة. بالإضافة إلى التقنية المستخدمة في هذه الدراسة، يمكن استخدام التطبيقات الأخرى من الخلايا الحية التصوير، مثل الحنق وFRAP 3. سوف تكنولوجيا مراقبة الخلايا في الوقت الحقيقي يستمر تحسينها واستخدامها لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

بدعم جزئي من وR01NS064593 R21ES016636 (KV). تم إجراء الفحص المجهري في جامعة فرجينيا كومنولث - قسم البيولوجيا العصبية ومرفق المجهر تشريح، بدعم، في جزء منه، وذلك بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة، مركز NINDS 5P30NS047463 منحة الأساسية. تم شراء القرص الغزل مبائر المجهر مع جائزة NIH-NCRR (1S10RR027957).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CellStar culture dishes Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes World Precision Instruments, Inc.
MEM media GIBCO
Non-essential amino acids GIBCO
Amino acids GIBCO
Vitamins GIBCO
Sodium Pyruvate Invitrogen
Penicillin/Streptomycin HyClone
Fetal Bovine Serum GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;
plasmid 19836
Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735 Addgene
SuperFect Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system Zeiss
AxioVision (release 4.8.2) Zeiss
Zeiss Immersol W Oil Zeiss
Volocity software (version 6.0) PerkinElmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
  2. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  3. Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what's in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
  4. Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
  5. Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
  6. Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
  7. Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
  8. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
  9. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
  10. Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
  11. Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
  12. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
  13. Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
  14. Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
  15. Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).

Comments

2 Comments

  1. Hi

    I think there is a mistake in the protocol. it should be the plasmid http://www.addgene.org/19835/ mCherry-BP1-2 pLPC-Puro from Titia De Lange lab, isn't it?
    the 19836 is N-Myc tagged and not mCherry.


    Reply
    Posted by: Valentine C.
    June 29, 2015 - 11:11 AM
  2. Ah, yes, you are correct. I apologize for missing that.

    Reply
    Posted by: Jason B.
    August 15, 2015 - 2:35 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics