Изучение артериальной гладких мышц KV7 калиевых каналов функцию с помощью Patch Clamp электрофизиологии и давления Миография

Published 9/14/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Измерения KV7 (KCNQ) калиевого канала активности в изолированной артериальной миоцитов (с помощью патча зажим электрофизиологические методы) параллельно с измерениями констриктор / расширитель ответы (с помощью давления миография) могут выявить важную информацию о роли KV7 каналы в гладких сосудистых мышц и физиологии фармакологии.

Cite this Article

Copy Citation

Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Сокращение или расслабление гладких мышечных клеток в стенах сопротивление артерий определяет диаметр артерий и тем самым контролирует поток крови через сосуд и вносит свой вклад в системное артериальное давление. Сокращение процесс регулируется прежде всего цитозольной концентрации кальция ([Ca 2 +] цит), которая в свою очередь контролируется с помощью различных ионных транспортеров и каналов. Ионные каналы являются общими промежуточных сигнальных путей активируется вазоактивных гормонов для осуществления сужение сосудов или сосудов. И ионные каналы зачастую становятся мишенью терапевтических агентов, либо намеренно (например, блокаторы кальциевых каналов используется, чтобы вызвать расширение сосудов и снижение артериального давления) или непреднамеренно (например, чтобы вызвать нежелательные сердечно-сосудистых побочных эффектов).

KV7 (KCNQ) напряжение активированного калиевых каналов в последнее время были вовлечены в качестве важной физиологической и терапевтической ТаргETS для регуляции сокращения гладких мышц. Для выяснения конкретных ролей KV7 каналов, как в физиологическом передачи сигнала и в действиях терапевтических агентов, мы должны изучить, как их деятельность модулированные на клеточном уровне, а также оценить их вклад в контексте интактной артерии.

Артерий крыс брыжеечных обеспечить полезную модель системы. Артерий может быть легко рассеченные, очищают от соединительной ткани и используются для подготовки изолированной артериальной миоциты для патч зажим электрофизиологии, или канюлю и давлением для измерения сосудосуживающие / сосудорасширяющее ответов при относительно физиологических условиях. Здесь мы опишем методы, используемые для обоих типов измерений и привести несколько примеров того, как экспериментальная конструкция может быть интегрирована, чтобы обеспечить более четкое понимание роли этих ионных каналов в регуляции сосудистого тонуса.

Protocol

1. Хирургическое иссечение тонкого кишечника Аркады сосудистой Брыжеечные

  1. Anesthetize 300-400 г Sprague-Dawley крыс с изофлурана (4%) вводят путем ингаляции.
  2. Выполните средней линии лапаротомия, чтобы разоблачить брыжейки тонкого кишечника. Экстериоризироваться тонкой и толстой кишки через разрез брюшной стенки с большой осторожностью, чтобы избежать травм подвергаются кишечника и брыжейки. Осторожно раздуть брыжейки над стерильной марлей.
  3. Хирургически вырезать тонкую кишку и часть толстой кишки, в том числе слепой кишки (кровеносные сосуды аккуратно разрезать вдоль поля и на происхождение от основной ветви верхней брыжеечной артерии / вены).
  4. Передача вырезали ткань в стакан, содержащий ледяной рассекает решения (табл. 1).
  5. После удаления кишечника, крыса должна быть гуманно усыпляют в то время как под наркозом.

2. DissectionD очистки артерий

  1. Передача вырезали кишки и брыжеечных аркада для охлаждения рассекает камеры (4-5 ° C), содержащие рассекает решение. Камера состоит из 100-мм стекло чашки Петри с Sylgard 184 эластомера базы для размещения рассекает контактов; чашки Петри помещают в охлажденный база, которая поддерживается на уровне 4-5 ° С оборотной водой ванну.
  2. Использование хирургических ножниц разрезать примерно 10-12 см сегмента из всего кишечника. Вырезать в каждом конце кишечного сегмента сохраняя свою сосудистой прилагается, а затем удалить неиспользуемые кишечник от камеры оставляя один сегмент с приложением ее сосудистую (брыжеечных аркада) в изоляции.
  3. Придавить сегмента тонкой кишки, распространение брыжейки на ближайшую сторону камеры таким образом, что основной ветвью верхней брыжеечной артерии / вены в центре и последующего порядков излучать ответвления от центра (рис. 1). Pl Туз выводы только на кишечные сегменты (не на кровеносные сосуды).
  4. Различают артерии от вен их относительно ярко-красного цвета, толстые стены и характерный V-формы ветви, а не на П-образной ветви видели в венах.
  5. Визуализация через освещенный рассекает микроскопом, тщательно очистить жировой ткани и соединительной ткани, окружающие 2-го - 4-го порядка артерии близко к кишечника (пунктирная окружность на рисунке 1) с использованием микро щипцы и ножницы. Холдинг соседние вены облегчает очистку жировой ткани и соединительной ткани. Избегайте ненужных растяжении артерий.
  6. Брыжеечные сегментах артерии очищена от соединительной ткани может быть вырезали и используется для выделения клеток (для одно-клеточных исследований патч зажим, разделы 3-4) или канюлю для давления миография (раздел 5). Вырезать сегменты между точками ветвления, как правило, до 1 см в длину.
jove_title "> 3. изоляторе исследований Patch Clamp

  1. Подготовьте 0,5 л Изоляция решение (табл. 1) и разделите его на 2 части перед регулирования рН. Первая часть (обычно 100 мл) должна быть нагрета до 37 ° С и рН должен быть скорректирован до 7,2 при 37 ° C (37 ° C изоляция Solution). Вторая часть изоляции Решение должно быть охлажден до 4 ° С и рН должен быть скорректирован до 7,2 при 4 ° С (Ice холодный раствор изоляция). После рН, осмолярность оба решения должны быть скорректированы до 298 мосм путем добавления соответствующего количества D-глюкозы или H 2 O.
  2. Передача 2 мл 37 ° C изоляция Решение стеклянный пузырек и инкубировать при 37 ° C для использования в шаге 3.4. Добавить в дозе 20 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) до 10 мл 37 ° C изоляция решение, раствориться, разогреть до 37 ° C и корректировки рН до 7,2. К 2 мл этого раствора добавляют 4 мг коллагеназы типа VIII (Sigma, лот 089K8612: 633 Uнит / мг активность коллагеназы, 285 единиц / мг Caseinase деятельности, 1,6 единиц / мг Клострипан деятельности), 0,64 мг эластазы типа IV (Sigma, лот 110M7025V 5,9 единиц / мг, добавить 40 мкл 16 мг / мл акции подготовлены в 37 ° C изоляция Solution) и 2 мкл 1 М DL-дитиотреитол (DTT Sigma); предварительно теплой этого ферментного раствора до 37 ° С в рамках подготовки к шагу 3.5.
  3. Передача 2-3 сегментах брыжеечной артерии в 35-мм ткань культуры блюдо, содержащий 2 мл ледяного Решение изоляции и места блюдо на льду. Вырезать брыжеечной артерии в сегментах 3-4 мм длиной штук.
  4. С помощью пипетки Пастера с огнем полированный наконечник (для предотвращения повреждения артерий) передавать артериальных сегментов в стеклянный флакон (15 х 45 мм, 1 драм), содержащий 2 мл подогретого 37 ° C Решение изоляции и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C.
  5. Через 30 минут тщательно аспирации 37 ° C изоляция Решение с помощью пипетки Пастера, добавить 2 мл теплого раствора фермента и инкубировать в течение 35 минпри 37 ° C.
  6. Сразу же после 35 мин инкубации в растворе фермента, поместить флакон на льду, аспирации раствора фермента и добавить 2 мл ледяного Решение изоляции (стремление повторить и добавлением свежей ледяной Решение изоляция 4 раза). Тогда, в объеме 1 мл ледяной Решение изоляции, осторожно растирают артериальных сегментов с полированной пипетки Пастера в 10-20 раз, чтобы освободить отдельных брыжеечной артерии гладкие мышечные клетки (MASMCs).
  7. Периодически проверять миоцитов внешний вид, поместив каплю суспензии клеток на 35-мм чашку и просмотре под микроскопом. Здоровый MASMCs должны иметь гладкую удлиненный внешний вид. Не все клетки в артериальной стенке будут освобождены. Клеточную суспензию следует хранить на льду.
  8. Другим важным показателем здоровья MASMC является их толерантность физиологических Ca 2 + концентрации. Заполните записи камеры (Bioscience инструменты, # CSC-25L) с ванной сЕШЕНИЕ, содержащей 2 мМ CaCl 2 (рН 7,3 при комнатной температуре (RT), для состава см. Таблицу 1) и положение агар моста (изогнутый стеклянный капилляр заполнен на 2% агара в 2 M KCl, вставляется в электрод (Warner инструмента, REF -3L)) внутри камеры. Использование полированного пипетки Пастера перенести приблизительно 100-200 мкл суспензии клеток в записи камеры и позволяют клеткам придерживаться в течение 15 мин. Неповрежденные клетки не должны сокращаться значительно в 2 мМ CaCl 2-раствор, содержащий (клетки должны по всей видимости, удлиненные или палочковидные, не округляются вверх в шары).
  9. После добавления первой аликвоты суспензии клеток с записью камеры, 0,25 мл ванну раствор, содержащий 2 мМ CaCl 2 следует добавить оставшийся объем клеточной суспензии. Это оставшуюся суспензию клеток могут быть сохранены в этом решении на льду и использовать для исправления зажим для записи до 6 часов.

4.Использование всего клещи Patch сотовых измерить KV7 калиевых токов или мембранные напряжения

  1. После миоцитов придерживаться стекла базу записи камеры (25-мм № 1 раунд покровного стекла, Warner Instruments), инициировать непрерывную перфузию ванной решения (табл. 1). Для записи KV7 токов в отрыве от задержки калия выпрямитель тока Kv1 и KV2 семей, ванны решение должно быть дополнено 100 мкМ GdCl 3.
  2. Изготовление патч пипетки из боросиликатного стекла (Kimax-51, Кимбл Chase) с помощью пипетки съемника и microforge, его сопротивление должно быть 4-5 МОм при наполнении внутреннего решения (табл. 1). Пальто ниже 1/3 от пипетки (~ 1-2 мм выше чаевые) с Sylgard 184.
  3. Для записи KV7 токов в MASMCs, перфорированные патч целом напряжение ячейки метода фиксации должны быть использованы. Использование перфорированных конфигурации патч помогает предотвратить depletioп мембраны фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP 2) и последующего быстрого (в течение 5 мин) краткое изложение KV7 токи, которые обычно наблюдаются с использованием обычного разрыва конфигурации патч. Дополнение внутреннее решение (табл. 1) с 120 мкг / мл амфотерицина: добавляют 3 мкл 2 мг / мл запас Амфотерицин (подготовлен в ДМСО и хранить в замороженном состоянии в небольшие аликвоты и защищенном от света) до 0,5 мл внутреннее решение. Заполните кончик патч пипетки с Амфотерицин без внутреннего решения путем погружения пипетки в Амфотерицин без внутреннего решения, а затем применять всасывающие на другом конце с помощью 10 мл шприца, подключенные через кусок трубы (Tygon R- 3603). Добавить Амфотерицин содержащего раствор пипеткой с верхнего использованием Eppendorf Microloader пипетки до пипетки составляет примерно половину заполнен раствором. Удалите пузырьки воздуха, слегка нажав пипетки. С помощью пипетки сразу.
  4. Вставьте в пипеткув держатель электрода и использовать микроманипулятора снизить пипетки на поверхность удлиненной миоцитов (близко к, но не в верхней части ядра, рисунок 2). Когда сопротивление в пипетку увеличивается до 6-10 МОм, применять всасывающие для достижения гига-уплотнение (> 10 ГОм).
  5. Установить проведения напряжение 0 мВ при ожидании мембраны перфорации. Примените 100 мс напряжение шага до +10 мВ, а затем до -10 мВ, и использовать усилитель для компенсации быстрых переходных емкость пипетки. Одновременно с появлением целой клетки емкости переходных процессов, небольшие устойчивые положительные токи (обычно 2-10 рА) будет свидетельствовать о наличии функциональной KV7 каналов.
  6. Успешное перфорация с Амфотерицин снизит доступ сопротивление до 35 МОм или меньше. Данной записи может быть начато по 5 сек Напряжение шага протокол от -4 напряжения холдинга мВ. Мы используем -4 мВ проведение напряжения для достижения максимальной рядом инактивации других видов задержки RECtifier калиевых токов (опосредовано преимущественно Kv1 и KV2 каналов), которые могли бы загрязнять записи относительно небольшие, не инактивируют KV7 токов. В долгосрочной (5 сек) Напряжение шага протокола необходимо для достижения стационарного активации KV7 каналы, которые демонстрируют медленное напряжение-зависимой активации и дезактивации. KV7 токи не инактивируют в течение устойчивые шаги напряжение.
  7. Для записи KV7 тока напряжением (IV) отношения, применяют 5 сек напряжение шаги для напряжений в диапазоне от -84 мВ, при котором открыты вероятность KV7 каналов минимально, до +16 мВ, при котором открыты вероятность KV7 каналов достигает плато, через 5 сек на каждом испытательном напряжении, чтобы вернуться к проведению напряжения (-4 мВ) на 10 сек. Это займет около 3,5 мин для полной серии испытательных импульсов (рис. 3А). Выполните 2-3 IV управления записями для того, чтобы записанные токи стабильными во времени. Участок среднем конца импульсных токов (в среднемтоков записаны за последние 1 сек) по сравнению с напряжением создать IV кривой (рис. 3D). Контроль ВАХ должна быть примерно накладываются если токи являются стабильными.
  8. Перед применением любых фармакологических препаратов инициировать Протокол время курс предназначен для непрерывной записи ток при -20 мВ. Обеспечить стабильную запись текущей по крайней мере, 5 мин до применения препарата. Применение фармакологических препаратов в течение 5-15 минут или до стационарного достигается (рис. 3), а затем прекратить протокол времени курс и записывать две IV кривых с помощью напряжения шага протокола. Вымывание наркотиков и записывать время курс лекарственной вымывания, после записи двух дополнительных кривых IV.
  9. В конце эксперимента применяется linopirdine 10 мкм и 10 мкм XE991, необратимые ингибиторы KV7 каналов; эти препараты должны полностью подавлять токи записан при напряжении отрицательных до -20 мВ (рис. 3D).

5. Использование неповрежденном сегменты артерии для давления Миография

  1. Давление в системе миографа приобрести датские Мио Technology (DMT A / S, Дания, модель 110P) используется для эксперимента миография давления. Установите артерии сегмента в камеру из нержавеющей стали, вставляя горизонтально зафиксировано левой канюли стекло в один конец и подвижной правой канюли стекло в другом конце. Два датчиков давления (P1 справа и P2 на левой стороне) встроены в мониторинг давления в артерии просвет. Жидкость с правой канюли стекло будет использоваться для регулировки давления внутри артерии своим приближенным физиологическом уровне. Для начала, предварительно заполнить открытые 10 мл шприц (выступающей в качестве давления колонки подачи тяжести), с просветом решения (табл. 1). Поднимите шприц, чтобы подтолкнуть решениения с помощью полиэтиленовых труб в правом канюли стекло, стараясь избежать пузырьков воздуха в трубку или канюлю. Левая канюли должны быть предварительно заполнены просвет решение по 1 мл шприца. Заполните давления в камере миографа с 10 мл раствора судна ванну (табл. 1). Свободно приостановить два готовых тонких нейлоновых нитей с каждой стороны примыкает к стеклянной канюлей.
  2. Тщательно передачи расчлененный сегменте брыжеечной артерии (обычно 3-го или 4-го порядка сегмент, около 200 - 350 мкм в диаметре, с шагом 2,6) от рассечения камеры в камеру миографа давление держится на одном конце отрезка с помощью микро щипцы.
  3. Визуализация через освещенный рассекает микроскопом, удерживая один конец артерии сегмента и осторожно сдвиньте ее над левой канюли стекла и закрепления конца помощью нейлоновой нити. Аккуратно промойте полость жидкости через установленный сосуд для удаления крови и грязи внутри сосуда.Клапан в левом шприце должна быть закрыта, так что эта сторона представляет собой статическую столба жидкости, против которых давление регулируется с правой стороны.
  4. Использование микроманипулятора, положение подвижной правой канюли стекла ближе к артерии сегмента и потяните правый конец отрезка над ним, наконец, закрепив его с нейлоновой нити. Клип излишки темы шва.
  5. Установите устройство давления миографа на сцене над микроскопом миографа давления. Установите крышку над камерой миографа давления. Крышка для камеры содержит входной superfusion и всасывающей трубы прилагается к нему. Подключите superfusion входе в коллектор, чтобы superfusion номера Температура ванны или 60 мм раствора хлорида калия в камере давления миографа под действием силы тяжести. Тест вещества, такие как наркотики или гормоны, которые находятся в измерениях патч зажим повлиять на KV7 функцию канала, как правило, наносится непосредственно на ванну решения, а не через ванну вирerfusion или в растворе просвет. Superfusion ванны решения будут использованы, чтобы смыть раствор KCl. Прикрепить всасывающей трубы с вакуумной системой для удаления избытка superfusate. Вставьте датчик температуры в ванну раствор через отверстие в крышке камеры миографа.
  6. Подключите устройство давления миографа в мио-интерфейс системы, аппаратные средства, которые позволяют связи миографа блока к программному обеспечению myoview (DMT).
  7. Откройте myoview программного обеспечения на компьютер. В окне параметров, установить целевую температуру до 35 ° C при температуре допуск 1 ° C, целевые поступления давление 80 мм рт.ст. и целевой отток давления до 80 мм рт. Загрузите файл калибровки и калибровки судна наружный диаметр, так что изменения в артерии диаметром записываются точно в микронах. Настройте контрастность при необходимости включить хороший вид смонтированной сегменте на фоне. Подробное описание того, как использовать программное обеспечениепредусмотрено в руководстве по DMT.
  8. Постепенно повышайте 10 мл шприц (выступающей в качестве давления колонки подачи тяжести) в течение 15 мин, пока датчик давления P1 читает 80 мм рт. В то время как повышение давления, колонки, проверьте, нет ли течи в судне. Если есть утечка, отказаться от сегмента и подключите другой артерии сегмента (повторите шаги от 5,2). Отрегулируйте расстояние между канюлей, когда это необходимо. Расстояние должно быть отрегулировано таким образом, что под давлением сегмента артерии составляет около прямой (но не растягивается) и образует плечо, как-шаблон, в котором связей сделаны (рис. 4а).
  9. Включите отопление в камере миографа давления через контроль в мио-интерфейс системы. Разрешить ванну решение, чтобы нагреть постепенно, пока не достигнет 36-37 ° C.
  10. Используйте XYZ корректировка целей в DMT микроскопа, когда это необходимо для поддержания судна в центре внимания и облегчения точного отслеживания чAnges с внешним диаметром сосуда.
  11. Проверка жизнеспособности судна установлен переходный superfusion (~ 30 сек) с 60 мМ KCl. Жизнеспособной судна сужает быстро на добавление KCl и расширяет сразу же после вымывания из 60 мМ KCl (переливать примерно 60 мл ванны решение, чтобы смыть KCl). После этого испытания, скорректировать объем ванны решение ровно 10 мл. Температура воды в ванне снижается во время теста KCl и вымывания, потому что эти решения при комнатной температуре, но в камере нагревателя будет восстанавливать температуру до 36-37 ° C в течение нескольких минут.
  12. Разрешить артерии, чтобы уравновесить по крайней мере, 30 минут (диаметр должен быть стабильным в течение по крайней мере последних 10 минут этот период). Добавить концентрированного исследуемого вещества в ванну раствор непосредственно и пипетировать взад и вперед осторожно вблизи краев камеры для смешивания исследуемого вещества в ванне решение, уступая соответствующие конечной концентрации в 10 мл объема камеры. ChanГЭС в следующем диаметр сосуда того испытуемого вещества (ы) можно наблюдать в видеоизображение, а также наметил в окно анализа изображений в то время как эксперимент продолжается.
  13. После завершения эксперимента, хранящихся данных (*. Мио-файл) можно открыть файл электронной таблицы для последующего анализа.

6. Представитель результаты

Результат показан на рисунке 3 иллюстрирует типичные записи KV7 токи от брыжеечной артерии миоцитов при напряжении протокол шаг, прежде чем (рис. 3А, Б черные следы) и во время лечения KV7 канал активатора Zn пиритион (ZnPyr, 100 нм; 3А, Б красные следы). Похожие напряжения шага данным от 3 ​​клетки были усреднены для подготовки тока напряжением (IV) участки показаны в 3D рис. Конечно время представитель повышение амплитуды тока (измеряется постоянное напряжение зажима при -20 мВ) Даринаг лечение с 100 нМ Zn пиритион показан на рисунке 3C рисунок 4B иллюстрирует ход времени влияния ZnPyr на брыжеечной артерии наружный диаметр измеряется с помощью давления миография;. судно было предварительно суженной с 100 пМ аргинин-вазопрессин (AVP) до Помимо 100 нМ ZnPyr. Усредненная доза-реакция данные для ZnPyr вызванных брыжеечных расширение артерии показано на рисунке 4С.

Рисунок 1
Рисунок 1. Изображение брыжеечных аркада в анатомическом театре камеры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Изображение миоцитов с патчем пипеткой на его поверхности.

Рисунок 3
Рисунок 3. Оригинальные следы KV7 токов, время курс препаратов Приложение, IV кривые. А. Семья последовательных текущих следов (нижняя панель), записанный в ответ на напряжение шага (верхняя панель) до лечения (контроль, черные) и последующей стабилизацией в присутствии 100 нМ ZnPyr (красный) в одном MASMC. B. Представитель текущего следы (как показано стрелками) для управления (черный) и 100 нМ ZnPyr (красный). Серые бары указывают на временной интервал, когда усредненная амплитуды тока были измерены вольт-амперных (IV) участков. Шаг напряжения указано справа на наконечники для стрел. C. Время ходе KV7 текущего повышение на 100 нМ ZnPyr измеряется с непрерывным зажим напряжения при -20 мВ (бар). D. Средний IV кривых (п = 3), полученные из KV7 плотностях тока, записанные до (контроль, черные кружки), при лечении 100 нМ ZnPyr (кружки), и во время лечения с 10 мкМ XE991 (заполненные треугольники). Неспецифические токи утечки были вычтены как описано Passmore и соавт. 1.

ных "> Рисунок 4
Рисунок 4. ZnPyr индуцированной релаксации брыжеечной артерии предварительно суженной с 100 AVP пМ. А. Фотография брыжеечной артерии установлен в давлении миографа настройки. B. Время хода изменений в наружный диаметр сосуда в ответ на применение 100 пМ AVP (открытый бар) с последующим применением 100 нМ ZnPyr (заполненный бар). C. Гистограмма подводя итоги 100 нМ ZnPyr вызванных vasodilaion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы и экспериментальных подходов, описанных здесь довольно надежная и может производить четкие и воспроизводимые результаты при применении с тщательным вниманием к деталям. Хорошо электрофизиологических записей и сужение / расширение артериальных сегментов зависит от здоровья клеток и артерий сегментов, соответственно. Сотовые препараты могут меняться изо дня в день, даже используя тот же протокол. Изоляция Решения могут быть использованы на срок до 2 недель, но если качество клеточный препарат низкой на двух последующих дней нового решения Изоляция должна быть подготовлена. Мы обнаружили, что активность ферментов меняться от партии к партии, и поэтому изоляция условиях (время инкубации и концентрации ферментов) требуют оптимизации с каждой новой партией ферментов. Мы также обнаружили, что протокол изолятор описано здесь для крыс брыжеечной артерии не является оптимальным и для других сосудистых кровати или других видов, которые могут иметь различные смеси или притоныности компонентов внеклеточного матрикса. Каждый сосудистый препарат требует своей оптимизации для определения условий, которые производят здоровые клетки. Критерии, которые мы находим наиболее полезны в выявлении здоровые клетки являются: 1) морфологии клеток: гладкие, вытянутые, но слегка суженные внешний вид после растирания MA сегментов в изоляции раствор, содержащий 50 мкМ Са 2 + и сохраняя то же изображение передается на 2 мМ Ca 2 +-содержащих внешние решения. Не все клетки сохраняют свою почти полностью расслабилась удлиненной формы, но только почти полностью расслабилась миоцитов должны быть использованы для электрофизиологических записи; 2) Клетки должны быть оптически плотной, что свидетельствует нетронутыми неповрежденной мембраны; 3) Отдыхая напряжение мембраны здоровых миоцитов используется для запись калиевые токи или ток зажима записи мембраны напряжение должно быть более негативными, чем -40 мВ (обычно в диапазоне от -45 мВ до -56 мВ при ионных условиях де-описанными в нашем протоколе здесь).

Для обеспечения успешного электрофизиологических записей, решение ванны и решения пипеткой (для композицию см. Таблица 1) должны быть подготовлены в день эксперимента. Очень важно, чтобы регулировать осмотическое давление как внутренние, так и ванну решения идентичны (298-299 мосм).

Изобарический измерения артериального функции, сделанные в мелких артерий (<500 мкм) с использованием давления миография более тесного приближения к физиологическим условиям, чем изометрические измерения силы производится с помощью проводов миографа. Суда в давлении миографа, как правило, более чувствительны к сосудосуживающим агонисты 2-4, более тесно аппроксимирующего чувствительности измеряется в 5 VIVO, 6. Повышенная чувствительность к низким концентрациям агонистов позволила выявить механизмы передачи сигнала индуцированной физиологически соответствующие пикомолярных концентрации AVP7, 8.

Давление миография сохраняет геометрию сосуда и поддерживает целостность эндотелия. Эндотелий-опосредованных эффектов лекарств можно отличить от гладких мышц-опосредованных эффектов путем проведения параллельных измерений в неповрежденном и эндотелия сосудов оголенные 9. Преднамеренное нарушение эндотелия может быть достигнуто путем физического повреждения эндотелия (например, путем передачи человеческого волоса и обратно через просвет) или перфузии воздуха через просвет артерии. Потеря функции эндотелия (но не сосудистую гладкой функции мышц) должна быть подтверждена путем измерения пониженной эндотелий-опосредованной сосудорасширяющее ответ на ацетилхолин в сосудах предварительно суженной с агонистом 9.

Параллельные измерения ионного тока / напряжения мембраны миоцитов в брыжеечной артерии с помощью патч зажим методы и артериальной сужение / расширение мезентериальных arteriES с помощью давления миография можно включить выяснение роли конкретных ионных каналов в обоих физиологические сигнальные каскады и в действиях терапевтических агентов. Процедуры, направленные на конкретные классы ионных каналов или конкретные промежуточные передачи сигнала могут быть применены аддитивно или в последовательности, чтобы обеспечить механистического информацию о роли этих каналов в регуляции функции миоцитов на клеточном уровне и сужение / расширение интактных артериях. Конвергентный результаты лечения, которые усиливают или подавляют определенные типы ионных токов с соответствующими воздействие на артерии диаметром обеспечивают более надежную интерпретацию, чем можно получить с помощью этих методов сам по себе. В идеале, концентрация зависимость агентов по исследованию должны быть определены в обеих системах. Для оценки физиологической или терапевтической значимости, испытанных концентрациях должны быть связаны с Концентрации, измеренные в физиологической среде оГ достигается при клинической терапии. Примеры этих типов экспериментальных подходов можно найти в наших предыдущих публикациях 8-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась за счет гранта от Национального института сердца, легких и крови институт (NIH R01-HL089564), чтобы KLB и предварительно докторской стипендии Американской ассоциации сердца (09PRE2260209) и Артур Дж. Шмитт Фонд BKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
  2. Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  3. Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
  4. Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
  5. Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
  6. Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
  7. Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
  8. Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
  9. Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
  10. Patch Clamp Technique. Kaneez, F. S. Intech. (2012).
  11. Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats