Summary

Изучение артериальной гладких мышц KV7 калиевых каналов функцию с помощью Patch Clamp электрофизиологии и давления Миография

Published: September 14, 2012
doi:

Summary

Измерения KV7 (KCNQ) калиевого канала активности в изолированной артериальной миоцитов (с помощью патча зажим электрофизиологические методы) параллельно с измерениями констриктор / расширитель ответы (с помощью давления миография) могут выявить важную информацию о роли KV7 каналы в гладких сосудистых мышц и физиологии фармакологии.

Abstract

Сокращение или расслабление гладких мышечных клеток в стенах сопротивление артерий определяет диаметр артерий и тем самым контролирует поток крови через сосуд и вносит свой вклад в системное артериальное давление. Сокращение процесс регулируется прежде всего цитозольной концентрации кальция ([Ca 2 +] цит), которая в свою очередь контролируется с помощью различных ионных транспортеров и каналов. Ионные каналы являются общими промежуточных сигнальных путей активируется вазоактивных гормонов для осуществления сужение сосудов или сосудов. И ионные каналы зачастую становятся мишенью терапевтических агентов, либо намеренно (например, блокаторы кальциевых каналов используется, чтобы вызвать расширение сосудов и снижение артериального давления) или непреднамеренно (например, чтобы вызвать нежелательные сердечно-сосудистых побочных эффектов).

KV7 (KCNQ) напряжение активированного калиевых каналов в последнее время были вовлечены в качестве важной физиологической и терапевтической ТаргETS для регуляции сокращения гладких мышц. Для выяснения конкретных ролей KV7 каналов, как в физиологическом передачи сигнала и в действиях терапевтических агентов, мы должны изучить, как их деятельность модулированные на клеточном уровне, а также оценить их вклад в контексте интактной артерии.

Артерий крыс брыжеечных обеспечить полезную модель системы. Артерий может быть легко рассеченные, очищают от соединительной ткани и используются для подготовки изолированной артериальной миоциты для патч зажим электрофизиологии, или канюлю и давлением для измерения сосудосуживающие / сосудорасширяющее ответов при относительно физиологических условиях. Здесь мы опишем методы, используемые для обоих типов измерений и привести несколько примеров того, как экспериментальная конструкция может быть интегрирована, чтобы обеспечить более четкое понимание роли этих ионных каналов в регуляции сосудистого тонуса.

Protocol

1. Хирургическое иссечение тонкого кишечника Аркады сосудистой Брыжеечные Anesthetize 300-400 г Sprague-Dawley крыс с изофлурана (4%) вводят путем ингаляции. Выполните средней линии лапаротомия, чтобы разоблачить брыжейки тонкого кишечника. Экстериоризироваться тонкой и толстой кишки чере…

Discussion

Методы и экспериментальных подходов, описанных здесь довольно надежная и может производить четкие и воспроизводимые результаты при применении с тщательным вниманием к деталям. Хорошо электрофизиологических записей и сужение / расширение артериальных сегментов зависит от здоровья к…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась за счет гранта от Национального института сердца, легких и крови институт (NIH R01-HL089564), чтобы KLB и предварительно докторской стипендии Американской ассоциации сердца (09PRE2260209) и Артур Дж. Шмитт Фонд BKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
  2. Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  3. Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
  4. Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
  5. Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
  6. Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
  7. Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
  8. Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
  9. Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
  10. Brueggemann, L. I., Kaneez, F. S. . Patch Clamp Technique. , (2012).
  11. Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).

Play Video

Cite This Article
Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

View Video