Patch clamp inspelningar i Inre celler öronhår isolerad från Zebrafish

Neuroscience
 

Summary

Syftet med denna video är att visa förfaranden för att erhålla friska, intakta hårceller från innerörat organ vuxen zebrafisk och sedan använda dem för studier patch clamp syftar karakterisera de biofysikaliska egenskaperna hos de spänningskänsliga kanaler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Einarsson, R., Haden, M., DiCiolli, G., Lim, A., Mah-Ginn, K., Aguilar, K., Yazejian, L., Yazejian, B. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. J. Vis. Exp. (68), e4281, doi:10.3791/4281 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Patch clamp analyser av spänningskänsliga kanaler i sensoriska hårceller isolerade från olika arter har beskrivits tidigare 1-4 men denna video är den första tillämpningen av dessa tekniker för att hårceller från zebrafisk. Här visar vi en metod för att isolera friska, intakta hårceller från alla innerörat-end organ: saccule, Lagena, utricle och båggångarna. Vidare visar vi mångfalden i håret cellstorlek och morfologi och ge ett exempel på vilka typer av inspelningar patch clamp som kan erhållas. Fördelen med att använda denna zebrafisk modellsystem framför andra härrör från tillgången på zebrafisk mutanter som påverkar både hörsel och balans. I kombination med användning av transgena linjer och andra tekniker som använder genetisk analys och manipulation, cell isolering och elektrofysiologiska metoder presenteras här bör underlätta ökad insikt i den roll hårcellerna plåg vid mediering dessa sensoriska modaliteter.

Protocol

1. Pre-experimentella preparat

  1. Bered sex lösningar (se tabell 1 för kompositioner): (a) 100 ml NZR (normal zebrafisk Ringers), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (lågt Ca 2 + lösning), (e) 10 ml Locas + papain, (f) 100 ml K +-intern lösning. Lösningar (a), (b), (d) och (f) kan förvaras i upp till en månad vid 4 ° C. Lösningar (c) och (e) bör utarbetas dagen för experiment. Alla lösningar ska vara rumstempererade innan experiment.
  2. Etikett och fylla fyra 35 mm Petriskålar ungefär halvvägs med lösningar (a), (c), (d) och (e).
  3. Gör en dissekera maträtt genom att fylla en 60 mm petriskål med Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) och sedan skära ett hålrum i den som gör att en fisk sitta upprätt utan att välta.
  4. Bered minst två verktyg cellisolering genom limning follikeln änden av en hund hår till slutet av en glasPasteurpipett med superlim, vilket håret att sträcka sig förbi änden av pipetten med ca 0,5 cm. Håren från mjuk päls hundar som Labrador retriever och Weimaraner fungerar bra.

2. Isolering av hörsel och vestibulär Labyrinth

  1. Offra en vuxen zebrafisk genom nedsänkning i en bägare innehållande NZR + Tricaine. Visuellt övervaka gälarna tills alla opercular rörelser har upphört. Vänta ytterligare tio minuter innan du tar bort fisk och sköljning med färsk NZR. Dessa förfaranden har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) i Pepperdine University, men godkännande bör erhållas från din egen institution.
  2. Nåla fisken till dissekera skålen ryggsidan uppåt genom införande en vanlig sömnad rak stift (ca 2,5 cm lång) genom varje ögonhålan och ett tredje stift genom den dorsala-ventrala axeln ungefär en tredjedel till hälften av avståndet från huvudet till svans som illustreras iFigur 1A.
  3. Under en zoom (0,62-5x) stereo dissekera mikroskop utrustat med 10x okular, använd vår sax (skön Science Tools katalognummer 15.000-02) att exponera hjärnan och ett kort segment av ryggmärgen genom att ta bort skallen taket vid en punkt cirka 0,5 cm kaudalt om nivån av gälarna framåt till näsan av fisken. Skär ryggmärgen och lyft hjärnan med fin pincett (skön Science Tools katalognummer 11.251-30) samtidigt minska spinal nerver och andra bilagor, ta bort hjärnan och kassera (Figur 1B).
  4. Den ventrala delen av skallen kapsel som återstår bildar en "skål" som innehåller de inre örat organen. Observera de framstående, vita, ogenomskinliga otoliter i lagenas och sacculi ligger symmetriskt i kaudala änden av varje innerörat och sidled placerade otoliter utricle mer rostrally (figur 1C och 4A).
  5. Ta bort skålen av ben genom att skära alla ventrala och laterala attachments, medan du försiktigt lyfter den ur huvudet med fin pincett. Placera den i petriskål innehållande Locas (figurerna 1D och 4B).
  6. Med hjälp av två par av fin pincett, spricka sönder skålen vid dess mittlinjen genom att antingen ta tag sidokanter benet och dra dem isär eller alternativt, separera de högra och vänstra halvor genom att infoga punkter tången i centrum och bända halvorna isär. Ta bort de två labyrinter från benet med fin pincett (Figur 2).
  7. Inspektera labyrinter för att identifiera hörsel-och vestibulära end-organ: de halvcirkelformade kanaler, utricles, sacculi och lagenas (Figur 4C). De rosafärgade områden under varje Otolith är maculae innehåller hårcellerna. Likaså identifierar en remsa av rosa inuti ampuller av båggångarna den Cupula där hårcellerna finns.
  8. Ta försiktigt bort otoliter från Lagena och utricle hjälp av fin pincett (

3. Hår cellisolering

  1. Med hjälp av en plast överföringspipett (Fisher Scientific katalognummer 13-711-9:00), flytta ändorgan till skålen innehåller Locas + papain minimera mängden överförd vätska.
  2. Inkubera dessa strukturer i denna lösning under 30 minuter vid rumstemperatur.
  3. Vid slutet av inkubationsperioden, flytta strukturerna till skålen innehållande NZR + BSA och inkubera i denna lösning i minst 30 minuter. Hårceller förblir friska i denna lösning i upp till fyra timmar, men kommer att försämras efter 1-2 timmar efter isolering (se nästa steg).
  4. Som förberedelse för cellisolering flyttar en av slut-organ till skålen innehåller NZR.
  5. För lagenas och utricles, använd en hund hår att försiktigt lyfta bort de maculae-ark rosa epitelial tissue som innehåller hårcellerna (Figur 3A). Den maculae kan öste ut (med en hund hår) från under otoliter i sacculi och cupulae från sina platser inuti ampuller av båggångarna.
  6. Med hjälp av två verktyg cellisolering framställts i steg 1,4, triturera en makula eller Cupula att alstra en vrakfältet som innehåller hårcellerna (Figur 3B). Låt cellerna i minst fem minuter för att lösa på botten av skålen innan du flyttar den.
  7. Flytta skålen till stadiet av ett inverterat mikroskop utrustat med faskontrastoptik. Observera celler under 40X förstoring och notera mångfald i morfologi. Många celler är avokado-formade medan andra är långa och tunna. Förekomsten av apikala hår buntar identifierar dem som hårceller och fas-ljusstyrka garanterar deras hälsa. Mikrofotografier av isolerade hårceller visas i figur 5.

4. Patch Spännvidd zebrafisk hårceller

  1. Som en förberedelse för perfonominellt patch inspelningar 5,6, förbereda amfotericin innehållande intern lösning enligt följande: Placera 5 mg amfotericin B (Sigma A4888) i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och fyll med 100 pl DMSO. Omedelbart vortexa denna lösning i 10-20 sekunder tills allt amfotericin upplöses. Därefter, pipett 625 pl K +-intern lösning i ett andra mikrocentrifugrör. Tillsätt 10 pl av amfotericin lösningen till K +-intern lösning och vortexa som ovan. Beståndet amfotericin lösningen varar flera timmar, men kassera den slutliga lösningen efter en timme.
  2. Fabricera patch pipetter från BF 150-86-10 borosilikatglas (Sutter Instruments) med en etappvis avdragare (Sutter P-1000). Pipetter borde ha tips diametrar på ungefär 2 | im och kommer att ha resistanser av 1-3 MQ med lösningarna i tabell 1. Inställningarna på avdragaren som fungerar väl är följande: Heat = Ramp minus10, Pull = 0, hastighet = 18, Fördröjning = 1, tryck = 600. Formen påspetsen av en pipett bra framgår av fotografiet i insättningen c i figur 5. Blunt "bullet-formade" pipetter är att föredra eftersom de erbjuder minst tillgång motståndet under elektrofysiologiska inspelningar.
  3. Använd en 28 gauge Microfil spruta nål (MF28G-5, World precisionsinstrument) för att fylla en inspelning elektrod halvvägs med amfotericin-innehållande K +-intern lösning.
  4. Fäst elektroden till huvudsteg en patch clamp förstärkare. Applicera -10 mV, 10 ms spänningssteg vid 10 Hz och upprätthålla övertryck i elektroden när den manövreras genom luft / lösning gränsytan och ned till botten av inspelningen skålen nära cellerna.
  5. Placera elektroden vinkelrätt till en hälsosam ser cell. När elektroden är nära nog till cellen så att det börjar röra sig bort från den utströmmande lösningen, snabbt vända trycket, applicera ett lätt vakuum till elektroden tills cellen "hoppar" på den. Omedelbart upphöra sug på the elektrod och tillämpa en hållpotential av -70 mV till insidan av elektroden. Inom några sekunder en gigaohm tätning bildas.
  6. Beakta kapacitiva strömtransienter vid början och uppsägning av spänningssteg som visas strax efter säl bildas. Fortsätta att övervaka perforering av membranet under elektroden genom amfotericin genom att titta som transienter växer i storlek till sin maximala storlek (i ungefär tio minuter).
  7. För att bekräfta upprättandet av hela celler (perforerad) konfiguration i en frisk cell, framkalla passiv K + strömmar genom att hyperpolarisering och depolariserande steg spänningen. De flesta hårcellerna har framträdande yttre strömmar (se figur 6).

5. Representativa resultat

Figur 4 visar bilder tagna under stegen cellisolering. I panel A kan otoliter associerade med lagenas, saccluli och utricles ses through det tunna skiktet av ben som ligger över dem. Dessa ogenomskinliga strukturer ger praktiska landmärken till stöd i säker borttagning av änd organ från djuret under de efterföljande stegen i dissektion. Panel B visar "skål" av ben som innehåller de intakta labyrinter och de framstående otoliter i utricles, lagenas och sacculi. Panel C visar en labyrint som har tagits bort från benet. Notera den stora Otolith med bågad kant i Lagena, det istapp-formade Otolith i saccule och bönformade Otolith i utricle. Några av mångfald i storlek och morfologi ses i celler isolerade från Lagena illustreras i Figur 5. En frisk cell lätt identifieras som fas ljus med en skarp omkrets. Cellformer kan grovt indelas i två klasser: avokado-formade (AVO) och långa och smala (THN) även om storleken på cellerna i varje grupp kan variera kraftigt (jämför till exempel AVO 1 och AVO 3). Infälld a visar ett kluster avtre celler som inte var helt isolerade från varandra. Den svarta färgen och granulärt utseende av cellen i infälld B identifierar lätt denna cell som död. Infälld c visar spetsen på en patch-pipett som illustrerar formen och dimensioner lämpliga för inspelning från dessa celler.

De nuvarande spår som visas i figur 6 erhölls som svar på hyperpolarisering och depolariserande steg av potential som ställs på en Lagena cell liknande AVH 2 som visas i fig 5. Aktuella svar i celler av olika storlekar och former kan variera inom vida gränser tyder mångfald i komplementet av spänningskänsliga kanaler.

Figurerna 1-3: Cartoons illustrerar steg i isoleringen av hårceller.

Figur 1
Figur 1. Avlägsnande av skallen capsule innehållande innerörat labyrinter från zebrafisk. A. PIN offrade zebrafisk ryggsidan upp till dissekera skålen.. B Öppna skallen, ta bort och kassera hjärna. C. Observera otoliter i utricles, lagenas och sacculi. D. Ta ventrala delen av skallen kapsel innehåller labyrinter.

Figur 2
Figur 2. Borttagning av labyrinter från skallen kapsel. A. Spricka isär skalle kapsel vid mittlinjen. B. Ta labyrinter från ben. C. Ta bort otoliter från lagenas och utricles med pincett.

Figur 3
Figur 3. Isolering av hårceller från labyrinter. A. Lyft försiktigt bort maculae med en hund hår. B. Finfördela maculae med två hund hår. C. Använd isolerade hårceller för patch clamp.

Figur 4
Figur 4. Bilder tagna under steg i isolering av enskilda celler. A. Efter avlägsnande av hjärnan, kan otoliter associerade med de två lagenas och sacculi (pilar) och utricles (pilhuvuden) visualiseras. Efter avlägsnande av den ventrala B. del av skallen kapsel som innehåller innerörat organ från djuret. Den tecknade i den högra halvan av B identifierar platser i vänstra utricle, Lagena och saccule. Den streckade linjen visar den ungefärliga positionen av den vänstra labyrint. C.. Rätt labyrint (medial vy) D: Cartoon ritning illustrerar viktiga delar av labyrint i C. a: främre halvcirkulär kanal, b: horisontella kanal, c: bakre kanal, d: utrikulära Otolith, e: saccular Otolith, f: lagenal Otolith. Skala bar i D representerar 1 mm för A och B, 0,5 mm för C och D.

Figur 5
Figur 5 isolerade, friska celler från Lagena visar mångfalden av morfologi, AVO:. Avokado formade celler, THN: långa, tunna celler. Sätt i en: kluster av tre ofullständigt isolerade celler, infälld b: död cell, infälld c: spets lappelektrod används i elektrofysiologiska inspelningar från zebrafisk hårceller. Skala bar = 20 um gäller de viktigaste siffran och alla inläggningar.

Figur 6
Figur 6. Strömmar inspelade i en patch fastklämd hår cell. Genomsnittsberäknade svar i en cell (t liknandeO AVO 2 i figur 5) till tre presentationer av spänningssteg tillämpas i 10 mV steg från -140 mV till 70 mV från en anläggning potential -70 mV. Observera inaktiverande ström som visas vid mer depolariserade potentialer. Spänningssteg magnituder visas bredvid några av spåren.

Discussion

Noggrann dissektion av änd organ och skonsam behandling av cellerna är avgörande för en framgångsrik isolering av friska, intakta och fysiologiskt aktiva hårceller. Håll dig till följande tips kommer att försäkra framgång:

  1. Det är lättare att erhålla friska celler från mindre fiskar (2-2.5 cm i längd). Större fiskar har många mer fett droppar som dunkla visualisering under dissektion processen.
  2. Man måste vara försiktig när du tar bort otoliter, som ligger över hårcellerna. Undvik att röra vid cellerna när ta tag i otoliter med pincett.
  3. De bästa resultaten erhålles när maculae och cupulae lyfts bort som ark och cellerna triturerades ur epitelet.
  4. Vi finner användandet av en hund hår att triturera celler vara överlägsen andra metoder, inklusive användning av mänskliga ögonfransar 7 som inte är lika avsmalnande och mindre flexibel.
  5. Under plåster fastspänning, applicering av positivt tryck till than elektrod när den passerar genom luft / lösning gränsytan är viktigt att hålla spetsen ren. Frisättningen av det positiva trycket att aktivera cellen att "hoppa" på elektroden är också viktigt. Denna metod rensar en liten volym av amfotericin-innehållande lösningen från spetsen, vilket ökar sannolikheten för att bilda en tätning gigaohm med cellen. I våra experiment använder vi den perforerade tekniken patch inspelning i stället för den mer traditionella helcells-konfiguration på grund av skörhet av cellerna. Försök att "go helcell" resulterar ofta i förlust av tätningen gigaohm.

Den metod som beskrivs här kommer att ge hundratals friska hårceller per djur. Tekniken kan utföras vid rumstemperatur och kräver ingen speciell utrustning utöver ett dissektionsmikroskop. En tidigare rapport i JUPITER beskriver dissektion i innerörat i zebrafisk med en ventral tillvägagångssätt 8. Dessa författare visar disseInsatser av hela, paraformaldehyd-fixerade innerörat organ. Vi uppmuntrar läsaren att titta på den här videon för jämförelse med våra metoder. En fördel med de metoder som presenteras här är erhållandet av levande celler användbara för fysiologiska undersökningar. Förutom deras användning i försök patch clamp att studera spänningskänsliga kanaler (som visas här) användning av dessa celler kan utökas för att studera celler resonans 9,10, övervaka neurotransmitterfrisättning genom att kapacitansmätningar 11,12, undersöka neuromodulering inducerad av aktivering av ligand gated kanaler 13 samt utnyttja den rikedom av information som kan samlas ihop från att använda mutanter som påverkar både hörsel och balans 14.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Finansierat av NSF (0.854.551).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(a) NZR (Normal Zebrafish Ringer's) (in mM) 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na+-HEPES, pH 7.35.
(b) NZR + Tricaine NZR + 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester methane sulfonate (Sigma A5040).
(c) NZR + BSA NZR + 0.4% Bovine Serum Albumin (Sigma A2153).
(d) LoCaS (Low Ca2+ Solution) (in mM) 100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl2, 0.05 MgCl2, 3 Glucose, 30 Na+-HEPES, pH 7.35.
(e) LoCaS + papain LoCaS + 0.05% L-cysteine (Sigma C1276) + 0.2% papain (Sigma P3375).
(f) K+-internal solution (in mM) 52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7.3.

Table 1. Solutions.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells. Nature. 304, 538-5341 (1983).
  2. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. J. Physiol. 385, 207-242 (1987).
  3. Sugihara, I., Furukawa, T. Morphological and functional aspects of two different types of hair cells in the goldfish sacculus. J. Neurophysiol. 62, 1330-1343 (1989).
  4. Lee, S., Briklin, O., Hiel, H., Fuchs, P. Calcium-dependent inactivation of calcium channels in cochlear hair cells of the chicken. J. Physiol. 583, 909-922 (2007).
  5. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).
  6. Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access perforated patch recordings using amphotericin B. J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).
  7. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 92, 10297-10301 (1995).
  8. Liang, J., Burgess, S. M. Gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (Danio rerio). J. Vis Exp. 27, e1211 (2009).
  9. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 237-274 (1988).
  10. Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana. J. Physiol. 400, 275-297 (1988).
  11. Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells. Neuron. 13, 875-883 (1994).
  12. Kim, M. -H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices. J. Vis Exp. 59, e3345 (2012).
  13. Housley, G. D., Ashmore, J. F. Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea. Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).
  14. Nicolson, T. The genetics of hearing and balance in zebrafish. Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics