Author Produced

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

Bioengineering
 

Summary

Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Grossmann, G., Meier, M., Cartwright, H. N., Sosso, D., Quake, S. R., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. J. Vis. Exp. (65), e4290, doi:10.3791/4290 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kök bitkinin fiziksel çapa olarak fonksiyonları ve bu tür bitkilerin topraktan edindiğiniz azot, fosfor, sülfat ve eser elementler olarak su ve mineral besin alımı sorumlu bir organdır. Biz yüksek mahsul üreten sürdürülebilir yaklaşımlar geliştirmek istiyorsak, daha iyi kök besinlerin geniş bir spektrum kaplıyor ve simbiyotik ve patojen organizmalar ile etkileşime, nasıl geliştiğini anlamak gerekir. Bu hedefleri gerçekleştirmek için, biz dakika gün arasında değişen süreler içinde mikroskobik ayrıntılı köklerini keşfetmek gerekiyor.

Tabanlı mikro cihaz, görüntüleme 1 (Şekil 1) için hazırlık sırasında köklerine herhangi bir fiziksel stres kaçınarak bize Arabidopsis fidecilikten büyümeye ve görüntü kökleri sağlar - Biz RootChip, bir polidimetilsiloksan (PDMS) geliştirdi. Cihaz sıvı akışını yönlendirmek için mikromekanik vanalar featuring çatallı kanal yapısı içerençözeltisi girişlerden itibaren sekiz gözlem odalarına 2 her birine. Bu perfüzyon sistemi kök mikro kontrollü ve kesinlik ve hız ile değiştirilmiş izin verir. Odalarının hacmi dolayısıyla testi çözümün sadece az miktarda gerektiren, yaklaşık 400 nl olduğunu.

Burada gerçek zamanlı çözünürlüklü görüntüleme tabanlı yaklaşımlar kullanılarak RootChip kök biyolojisi çalışmaları için ayrıntılı bir protokol sağlar. Kökler time lapse mikroskobu kullanarak birkaç gün içinde analiz edilebilir. Kökler besin çözümler veya inhibitörleri ile perfüze edilebilir ve sekiz fidan paralel olarak analiz edilebilir. Bu sistem, kimyasal maddeler, gen ekspresyonunun floresans bazlı analizi, ve biyosensör analizi varlığında veya yokluğunda büyüme kök analizi de dahil olmak üzere, geniş bir uygulama alanı için potansiyele sahip, örneğin nanosensors 3 FRET.

Protocol

Not: steril koşullar altında tüm adımları hazırlık adımları gerçekleştirin.

1. Tohum Çimlenmesi Plastik Konileri hazırlanması

  1. 5 mm arasında bir kalınlığa kadar% 1 agar içeren büyüme medyumu ile bir 10 santimetrelik bir petri tabağına doldurun. Biz Hoagland orta 4 değiştirilmiş bir buçuk gücü, ancak orta kompozisyon bireysel deneysel gereksinimlerine uygun olarak seçilmelidir.
  2. Orta halen sıvı iken, Petri gelen orta 5 ul ile 10 ul pipet uçları doldurmak için bir çok kanallı pipet kullanın.
  3. Orta katı kadar daha sonra dik katı büyüme ortamı içeren Petri içine 4 mm uzunluğunda plastik huni ve yere kesip, pipet ucu kutusu dolu ipuçları saklayın.

2. Tohum Çimlenmesi ve Fide Büyümesi

  1. 5 dk için% 5 NaOCI tohum sterilize yüzey, steril su ile üç kez yıkanır daha sonra, orta-dolu konik her birinin üstünde tek bir tohum yerleştirmeks.
  2. 4 at Micropore bandı (3M) ve mağaza ile çanak Seal ° C çimlenme senkronize etmek.
  3. Üç gün sonra, çimlenme başlatmak için bir büyüme kabine plakaları aktarın. Bizim büyüme koşulları 16h yüksek light/8h karanlık döngüsü az 23 ° C (100 μE m -2 s -1 Işık yoğunluğu) vardır.
  4. 5 ve 7 gün çimlenme sonrası arasında, fidan RootChip transfer için hazır olmalıdır. Bu zamanda, kök uçları plastik koni alt çıkış yakın olması gerekir. Bir mikroskop altında fide sağlık, kök uzunluğu ve, varsa, bir floresan işaretleyici ifade edin.
  5. Yonga üzerine transfer için tek tek fidan işaretleyin. Durumda birinde on kadar fidan seçin aktarımı sırasında zarar görmüş.

3. RootChip üzerine Fidan Transferi

  1. Uzun vadeli deneyler için RootChip sterilize edilmesi, sarmakkağıt mendil, bir cam petri yer ve otoklavda cihaz.
  2. RootChip soğuduktan sonra, sıvı besi ile örtün. RootChip tamamen daldırılmış gerekir, ancak sıvı seviyesini RootChip yüzeyi üzerinde en fazla 3 mm arasında olmalıdır.
  3. 20 ul pipet ile, orta ile gözlem odasına doldurmak için kök giriş ve çıkış haznesi ile orta çekin.
  4. Tak plastik konileri RootChip girişleri içine adım 2.5 seçili. Konileri koylarda rahatça oturmalıdır. RootChip optik cam ince bir tabaka üzerine monte edildiğinden, çip çok fazla baskı uygulamayın.
  5. Sıvı bir ortamda gece RootChip inkübe edin. Kayan önlemek için, yonga üzerine iki cam slaytlar yerleştirin. Bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve çanak kapatın.
  6. Bir manyetik karıştırıcı ile montaj aktarın ve hafifçe orta ajitasyon.
  7. RootChip Kullanıcı girişleri li normal cihaza 30 ° açıyla kanallar kesişirkanalları (Şekil 1A) içine kök büyümesi litate. Daha fazla istenen yönde büyümeyi desteklemek için, çıkışlarının çip ters tarafında Petri altında bir cam slayt koyarak biraz montaj eğin.
  8. Bir zamanlayıcı bağlı: aydınlık / karanlık döngüsü korumak için, bir halka lamba (100 μE m -2 s -1 Işık yoğunluğu) ile fide aydınlatır.

4. Taşıyıcının RootChip Bağlanması

  1. Ertesi gün, sıvı besi (Şekil 1B) ile yapışmalı, basınçlandırılabilir şişe doldurun.
  2. Yonga taşıyıcı ters çevirin ve düz bir yüzeye yerleştirin. Sıvı ortamdan RootChip çıkarın ve çip taşıyıcı alt diyafram içine PDMS tarafı aşağı yerleştirin. Orient çip, böylece kontrol tabakası içeren girişler yan taşıyıcı yan duvarda basınç borusu bağlayıcı yan karşı karşıyadır.
  3. Kapağı cam kurulayınhafifçe kağıt mendil ile blotting tarafından çip alt. Bant ve doğru montaj ile tüm taşıyıcı RootChip sabitleyin.
  4. Boru bağlantı 5 cm uzunluğunda parçalar halinde esnek plastik microbore boru (Tygon, 0.20 "ID x 0,060" OD) kesme ve paslanmaz çelik borular microbore (New England Küçük Tüp, 0.025 "OD x 0.013" ID x 0.75 "bağlayarak yapılır uzunluğunda). çip üzerindeki ilgili kontrol katmanı girişine, bir şırınga ve fişi her tüp konnektörü kullanılarak su ile boru bağlantı doldurun. su daha sonra kontrol katmanı kanallar dolduracaktır ve mikromekanik vanaları için basınç iletmek için kullanılır.
  5. Medya / çözüm şişe (ler) içine hatlarının uçlarından takın. Hava bir şırınga ile çözüm flakonuna basınç uygulayın. Çözüm flakon içinde artan hava basıncı çizgileri içine sıvı zorlar.

5.. Mikroskop de RootChip Montaj

  1. Microsc üzerine yerleştirmek taşıyıcıope aşamasında. Odada titreşimleri nedeniyle deney boyunca değişen montaj olasılığını azaltmak için, taşıyıcı sahne ucun çentikler içine tam olarak oturmalıdır.
  2. Çip ile çipi vanalar ve orta akışını hava basıncı tarafından kontrol edilir. Düzenleyicileri ile iki çizgi, bir ana basınç hattının kapalı dallı edilmektedir - one kanallardan orta akışını kontrol etmek için kullanılır ve diğer kontrol tabakasının itme-up valf harekete solenoid vantuzlardan bağlanmıştır. Selenoid vana vana USB denetleyicisi (Rafael Gomez-Sjöberg, Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı tarafından geliştirilen) ile bilgisayardan işletilmektedir. Çip bağlamadan önce hem basınç regülatörleri kapatın.
  3. Derlemenin içinde nemi yüksek tutmak için taşıyıcı rezervuarlarının su birkaç ml ekleyin. Bu adım kurumasını bitkileri korumak için uzun süre deney boyunca tekrarlanmalıdır. T en aza indirmek için hacim düşük tutunmikroskop dökülmüş olabilir sıvı o miktarı. Uzun vadeli deneyler için, çip çıkışlarından çıkış microbore boru (adım 4.4) ile rezervuar için çip çıkışları bağlayarak taşıyıcının rezervuarların içine yönlendirilmesini edilebilir. Alternatif olarak, yonga yüzeyi üzerinde biriken çıkış pipet ile toplanabilir.
  4. Levha koruyucular gelen şeffaf plastik (C-Line) kare yaprak hazırlayın. Toplama yüksek nem korumak için çift taraflı bant ile taşıyıcıya şeffaf plastik Fix.
  5. Çip üzerinden halka ışık yerleştirin ve aydınlık / karanlık döngüsü korumak. Halka ışık direkt aydınlatma resim koleksiyonu engel olacak şekilde, floresan işaretleri kullanan herhangi bir deney başlamadan önce kapatılmalıdır.

6. LabView Arayüzü kullanarak RootChip İşletim

LabView yazılım platformu için RootChip denetleyici arayüzü yapabilirsinizweb sitemizden indirilebilir http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

  1. Çip üzerinde vanalar selenoid hava vanaları açarak bu durumda, kontrol katmanı basınç uygulanarak kapatılır. Denetleyici arabirimi vana sayısı aşağıdaki butona tıklayarak vanaları harekete izin verir. Parlak yeşil bir çip vanası (Şekil 2B) basınç ve kapama uygulamaları gösterir. Basınç regülatörleri açmadan önce kontrol arayüzü her üç çözüm emme supabı etkinleştirin. Not: kontrol arayüzü sistemin durumunun izlenmesi sağlayan bir geri besleme döngüsü sahiptir. Bu özellik kontrol arayüzü "Readback" butonuna basarak aktif edilebilir.
  2. Kontrol katmanı için basınç regülatörü açın ve başlangıçta 15 psi ayarlayın, ardından akışı katman için düzenleyici açın ve başlangıçta 5 psi olarak ayarlayın. Bağımlıarzu edilen akış oranı rı, daha sonra basınç ayarlanabilir.
  3. Orta odaları temizlemek için tercih edilen besi için giriş vanasını açın.
  4. Mikroskop altında akış yolları kontrol edin. Tipik olarak, hava akışı kanal içinde tutulur ve çıkarılması gerekir. Ayrıca, kontrol tabakasının kanalları hala tüp konnektörleri (çıkmaz dolum) gelen su ile zorla ve değiştirilmesi gerekir hava içerir. Her iki işlem tüm hava PDMS içine kanalları ("gaz giderme") zorla kadar sekiz odalarına her birkaç kez (5 psi) püskürtülerek elde edilir. Not: denetleyici arabirimi deneyler otomatikleştirmek için programlanabilir. Bu tür rutinleri gazdan arındırmak çip da kullanılabilir.

7. Temsilcisi Sonuçlar

RootChip asal amacı, entegrasyon yüksek seviyesi ile tek bir cihazda bir görüntüleme platformu ve perfüzyon sisteminde birleştirmektir. Manipülasyonu göstermek içinköklerin mikroçevresinin biz koyu gıda boyası (hidroponik orta 1:4 dilüsyon) ile odaları temizlendi ve odaların içinde sıvı değişimi ölçülür. 5 psi önerilen basınç anda yaklaşık 1.5 ul / dk (Şekil 3) hesaplanan bir akış hızında 10 saniye içinde tam bir değişim ölçülür.

Biz de bu durumda karanlıkta yetiştirilen ve harici bir enerji kaynağı (Şekil 4) olarak 10 mM glukoz ile birlikte olarak, fidelerin kök gelişimi gözlenmiştir. Gibi hafif ve orta bileşimi olarak büyümeyi koşullarına bağlı olarak, bitkiler üç gün için RootChip kadar görülebilir.

RootChip Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) 5-7 dayalı genetik olarak kodlanmış nanosensors ifade kökleri hücre içi glukoz ve galaktoz düzeyleri izlemek için kullanılır olmuştur. Yonga Roots glukoz veya galaktoz solüsyon kare darbeleri ile perfüze edildi (

Şekil 1
Şekil 1.. RootChip ilkesi.

  1. RootChip köklerin büyüme ve görüntüleme için sekiz gözlem odaları bulunmaktadır. Tohumlar ilk plastik konileri filizlenmeye - plastik pipet uçları imal - hangi katı ortam ile doldurulur. Kök ucu ortam içinden geçerek sıvı ortamın büyür ve sürekli bir akış odası içinde sabit tutar koşulları haznesi ulaşır. Mikromekanik vanalar (kırmızı) akışını kontrol. Çip bir optik cam kapak üzerine monte edilmiştir.
    Ölçeksizdir çizimi. (Grossmann ve ark., 2011 Bitki Hücre izniyle uyarlanmıştır.)
  2. Schdiyafram (kırmızı) ile bir basınçlandırılabilir çözeltisi şişeden eme.

Şekil 2
Şekil 2. Bağlama ve RootChip montaj.

  1. Tam olarak bağlı RootChip ve taşıyıcı üstten görünümü bir inverted mikroskop üzerine monte edilmiş.
  2. Programı valving sistemi ve kontrol arabirimi gösteren. Tek bir odaya sıvı akışı yönlendirmek için bir ayar vanası için bir örnek gösterilmiştir. Iken vanalar 4 tek vanalar, gruplar halinde 3 fiiller sonucu vana 0 olarak 8 fiiller sonucu. Bu sistem ile tek bir vana odasının bir kombinasyonu aktive tarafından ele alınabilir.

Şekil 3
Şekil 3. Gözlem ch çözümleri değişimiamberleri. boya çözeltisi kullanılarak bir gözlem odasında sıvı alışverişi Görselleştirilmesi. Görüntü parlak alan ve boya sinyalin yanlış renkli yoğunlukta bir kaplama olduğunu.

Şekil 4
Şekil 4. On-chip kök büyümesi. Gözlem bir floresan ifade eden bir tek büyüyen kök 20h boyunca glikoz / galaktoz için nanosensor FRET. Zaman formatı: ss: dd; ölçek çubuğu: 100 mikron.

Şekil 5,
Şekil 5. Ile ölçülmesi hücre içi şeker düzeyleri nanosensors FRET.

  1. Sensörünün miktarı kök ucu içinde sitrin yoğunluğu (sol) olarak gösterilir. Hücre içi arasında tepki glikoz veya galaktoz çözeltisinin uygulanması için nanosensor oranlı metrik görüntüler olarak gösterilir FRET. (Grossmann ve ark izniyle uyarlanmıştır., 2011 Plant Hücre) Ölçek çubuğu:. 100 mikron.
  2. Takip üç tekrarlanan kare glikoz bakliyat (yeşil) ve galaktoz (kırmızı) bir tepki olarak oran değişiklikleri FRET.

Discussion

Klasik büyüme yöntemleri üzerinde RootChip başlıca avantajları mikroskopi için minimal invaziv hazırlanması, geri dönüşümlü ve tekrar tekrar kök çevrelerini değiştirme yeteneği ve birkaç gün bir süre içinde gelişimsel olarak yetkili ve fizyolojik sağlıklı doku sürekli gözetim için, kapasitesi vardır. Daha önce, fide jölelenmişti medya dikey yetiştiği ve sadece bir kez 8 de tek kök ölçüm izin deney, hemen önce bir perfüzyon sistemine aktarılabilir. Mikroakışkan araçları Arabidopsis için değil, düşük entegrasyon seviyesi 9 veya perfüzyon kontrolü 10 görülmemiştir. RootChip hassas akış rehberlik yoluyla deneyler otomatikleştirmek yeteneği ile bütünleşme yüksek düzeyde birleştirir. Tüm mikroakışkan cihazlar 11 karakteristik özelliği, bu platform, diğer bir avantajı, bu sıvı, sadece minimum miktarda gerekli somun ile kök talep edilen birHatta birkaç gün süren deneyler için rients. RootChip şu anda tek kullanımlık bir cihaz olarak tasarlanmış, ancak fişleri üretim maliyetleri düşük olduğundan, tüketilen reaktif küçük miktarlarda hala çok düşük maliyetli yonga yapar.

Fide sağlığı garanti etmek için alınması gereken birkaç önemli adım vardır:

Plastik koni içinde hacim havaya maruz kaldığında kurumaya başlayacak sadece 3-4 ul vardır. Dolayısıyla konileri hızlı yonga üzerine aktarılır ve kökler yeterli su ile tedarik edecek gözlem odaları, ulaşana kadar nem oranının yüksek tutulması önemlidir. 4,2-4,5 adımlar hızlı ve fide kurumasını önlemek için kesintisiz yapılmalıdır.

Adımlar 3,5-3,8 kökleri gözlem odalarına büyümeye sırasında sıvı ortamda çip kuluçka açıklar. Bu adım c içine çip monte edilerek atlanabilirarrier hemen ve büyüme ortamı ile sürekli perfüzyon başlıyor. Bazı avantajları vardır Ancak, biz, gece büyüme ortamında iliklerine tavsiye: filizlere gözlem odasına büyüdükçe kurumuş olma ihtimali daha azdır bu yüzden nemli bir ortam oluşturur 1); 2) çip sıvı içinde kalıyor, bu yüzden Gaz alma (adım 6.4) daha hızlı olacaktır.

Düşük solüt konsantrasyonu ile medya kullanmak önemlidir. Daha konsantre solüsyonlar çip birkaç gün içinde kullanıldığında, özellikle çökelmesi ve kanalları tıkayabilir.

Cihaz, hava basıncı hattına bağlı sonra, orta akışı vanalar hidrolik basınç değiştirerek kontrol edilir. Mikromekanik vanalar doğru kapatılması sağlamak için, akış basıncı yaklaşık üç kat daha fazla kontrol basıncı seçmek önemlidir. Sıvı kök girişlerinin basılmış olacaktır gibi akış basıncı 15 psi geçmemelidir. Yüksek basınç may da çip kullanılamaz hale getirmektedir çip, bir delaminasyon neden olur.

RootChip bir sınırlandırma PDMS gözenekli ve hidrofobik olmasıdır. Malzeme sulu çözeltiler pratik olarak eylemsiz iken, organik bileşikler 12 absorbe edebilir. Bu organik bileşikler, bu bileşiğin besleme girişinde durduruldu da malzemenin akabilir gibi çözeltilerin hızlı bir değişim ile karışabilir. Porozite nedeniyle, organik çözücüler kullanılarak PDMS 12 şişmesine neden olabilir.

Biz ürün bitkilerinin kökleri ile RootChip optimize ve örneğin, kendi programını genişletmek için devam etmektedir. Biz tedavi ve gözlem için kök erişimi iyileştirerek, RootChip gibi mikroakışkan araçları root araştırma yeni ufuklar açacaktır inanıyorum.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz sensörleri oyma ifade bitki hat sağlanması için video hazırlama ve Bhavna Chaudhuri yardım için Philipp Denninger teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (MCB 1.021.677), WBF, Ulusal Sağlık Enstitüleri Enerji Departmanı (DE-FG02-04ER15542) ve SRQGG ile Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden hibeleri tarafından desteklenen bir EMBO Uzun tarafından desteklenmiştir dostluk vadeli. MM Alexander von Humboldt Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chip carrier, software and other information. Carnegie Institution - DPB CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website.
RootChip Stanford Foundry Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/
Chip controller Home-built The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grossmann, G. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
  2. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  3. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells. Annu. Rev. Plant Biol. (2012).
  4. Loqué, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wirén, N., Frommer, W. B. A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake. Nature. 446, 195-198 (2007).
  5. Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).
  6. Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).
  7. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).
  8. Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants. J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).
  9. Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip. Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).
  10. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).
  11. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  12. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).

Comments

2 Comments

  1. How can I get a chamber like that, can I buy it? where to ask for it?...Thanks a lot,
    Luis Cardenas

    Reply
    Posted by: luis c.
    September 3, 2012 - 5:28 PM
  2. Hi,
    chips can be ordered from the Stanford Microfluidics Foundry ( http://www.stanford.edu/group/foundry/). Select custom-made PDMS chips and refer to "RootChip Vs1". To set the system up in your lab you also need valves and controller for the pressure line. Instructions how to build these can be found under the links given in the article. Please feel free to contact me by email for further details.

    Guido

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2012 - 5:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics