Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

Published 10/12/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine.

Cite this Article

Copy Citation

Trish, E., Dimos, J., Eggan, K. Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.. J. Vis. Exp. (1), e49, doi:10.3791/49 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine. Menselijke embryonale stamcellen zijn artefacten van celkweek, en hebben de neiging om karyotypic afwijkingen te verwerven met een hoge populatie verdubbelingen. De juiste passage is essentieel voor het behoud van een gezonde, ongedifferentieerde, karyotypisch normale TINTEN menselijke embryonale stamcellen cultuur. Eerste, een groeiende cultuur wordt gewassen in PBS om de resterende media en celresten te verwijderen, dan cellen bedekt met een minimaal volume van warme 0,05% trypsine-EDTA. Trypsine is links op de cellen voor maximaal vijf minuten, dan cellen voorzichtig losgemaakt met een 2 ml serological pipet. De celsuspensie wordt verzameld en gemengd met een groot volume van tinten media, dan cellen zijn verzameld door zacht centrifugeren. Het geïnactiveerde trypsine media mengsel wordt verwijderd, en cellen opnieuw gesuspendeerd in voorverwarmde TINTEN media. Een passende verdeling ratio wordt berekend (over het algemeen 1u10-01u20), en cellen opnieuw uitgeplaat op een 1-2 dagen oude plaat met een monolaag van bestraalde muis embryonale fibroblasten feeder-cellen. De nieuw geplaatste TINTEN cultuur plaat is laat men het gedurende 48 uur, dan is de media wordt elke dag daarna. Het is belangrijk om niet naar beneden trpsinize tot een enkele celsuspensie, want dit verhoogt het risico van de invoering van karyotypic afwijkingen.

Protocol

Algemeen

We raden aan het ontdooien niet meer dan een monster op een gegeven moment om eenvoudige bediening zorgen. De handler moet ervoor zorgen niet te laten culturen op kamertemperatuur en een lage CO2 voor langere tijd. Alle centrifugeren van levende cellen gebeurt op 500 tot 600 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

MEF (muis embryonale cellen Feeder)

  1. Pre-warm MEF media tot 37 ° C. Verwijder de MEF flacon van -80 ° C en onmiddellijk onder water de onderste helft van de buis in een 37 ° C waterbad. Het duurt ongeveer 30-45 seconden voordat de cellen zijn 80% ontdooid (klein links diepvries gedeelte).
  2. Snel de buis te brengen om de laminaire flow kap, spray neer met 70% alcohol, en overdracht cellen voorverwarmde media.
  3. Aspireren van de gelatine-oplossing van borden eerder voorbereid.
  4. Aliquot 2 ml van MEF oplossing in een druppelsgewijs wijze in elk van de zes waterputten. Zorg ervoor dat u gelijkmatig te verdelen over de MEF de put. De datum waarop de MEF plaat, en plaats in een 37 ° C incubator 's nachts te laten MEFs te hechten aan bord.
  5. Na 6 uur MEFs zal worden gehecht aan de plaat. Het is het beste om te gebruiken MEF platen 24-48 uur na plating. Gebruik GEEN een MEF plaat die meer dan 4 dagen oud.
  6. Pre-warme tinten media en 0,05% trypsine / EDTA tot 37 ° C onder de motorkap, prelabel een steriele 50 ml conische buis.
  7. Zorgvuldig aspireren de tinten media van de cultuur te worden gesplitst. Voorzichtig Was de putjes met 2 ml 1X fosfaat-gebufferde oplossing (PBS) per well. Zuig het PBS. Voeg 0,75 ml 0,05% trypsine / EDTA naar de waterput.
  8. Vervanging van het deksel, en observeer de cellen onder 4x vergroting. De MEF rond de tinten koloniën moet beginnen terug te trekken. Wanneer de MEF voldoende zijn afgerond en de grenzen van de tinten kolonies zijn ruwe, terug de plaat aan de kap. Dit proces duurt ongeveer 5 minuten, absoluut niet langer dan 10 minuten of je cellen niet opnieuw groeien.
  9. Voorzichtig pipet op en neer, het wassen van de bodem van de put, tot de MEF monolaag volledig vrijstaande (monolaag is kleverig en kan blijven in een stuk).
  10. Breng de celsuspensie om een ​​50 ml conische buis met aanvullende TINTEN media. Spin de buis van de cellen 500xg voor 5 minuten, Aspireer uit de media, wees niet naar de cel pellet te verstoren.
  11. Tot op het bord op een nieuwe plaat van MEF, voeg de juiste wijze bepaald volume van de cellen om extra TINTEN media, en pipet de oplossing 5-7 keer met een automatische pipet.
  12. Verwijder de MEF media vanuit een nieuw plaat van MEFs.
  13. Aliquot de tinten oplossing druppelsgewijs aan elk putje, en zorg ervoor dat de druppels gelijkmatig te verdelen over de put. Zonder het schudden van de plaat, zorgvuldig de cellen 's nachts terug te keren naar een 37 ° C incubator te TINTEN koloniën zaad te laten.
  14. TINTEN cellen uit een splitsing komen moet op dezelfde manier gedragen die coming out van een dooi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In deze video zien we hoe we routinematig passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen in ons laboratorium. Efficiënte en regelmatige splitsen en passage is essentieel voor het behoud van een gezonde menselijke embryonale stamcellen lijn. Trypsine gemedieerde passage is een belangrijk voordeel van tinten cellijnen, is het echter belangrijk om niet meer dan trypsinize culturen of om een ​​groot deel van de afzonderlijke cellen tijdens de re-platting hebben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HuES media 651.5 ml
KO-DMEM 500 ml
PenStrep 6.5 ml
GlutaMAXTM 6.5 ml
NEAA 6.5 ml
2-mercapt–thanol 0.5ul
KO Serum Replacement 65 ml
Plasmanate 65 ml
bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).
  2. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).
  3. Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip. PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).
  4. Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
  5. Pierce, C. G. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).
  6. Lee, M. Y. Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).
  7. Meyerhofer, D. Characteristics of resist films produced by spinning. Journal of Applied Physics. 49, (1978).
  8. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
  9. Chandra, J. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance. Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).
  10. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).
  11. Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases. Mycoses. 53, 208-214 (2010).

Comments

4 Comments

  1. That's very nice clip and  I have some question. Normally, HuES cells are very hard to form colony from single cell state. By treating with trypsin, I think, HuES colony will be dissociated into single cell state or very small colony state. How could you solve this problem? Which HuES cell line your lab are using? Looking forward to your response! Tran Ngoc Tung  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 6, 2009 - 7:15 AM
  2. For Tran Njoc Tung, You are totally correct that HuES, in single cell state, form colonies with great difficulty. The trick to avoid making a single cell suspension is to minimize the time for which you trypsinze. As you put trypsin, observe the cells under the microscope and just when there are small aggregates of HuESC's remaninig add the media. This would not allow the formation f single cell suspension. It totally works for me. Hope it dŒs for you.   Sumit Rai

    Reply
    Posted by: Sumit R.
    April 7, 2009 - 4:06 AM
  3. Dear Sir/Madame Unfortunately I can"t see the movie. How can I overcome this problem? Thank you and regards Vitali Shilo vitali.shilo@gmail.com

    Reply
    Posted by: vitali s.
    January 22, 2009 - 8:05 AM
  4. Hello Vitali, Please try the steps on this page: http://www.jove.com/index/page.stp?name=FlashProblems and let me know if you have any trouble. Cheers, Nikita

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2009 - 9:33 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats