Обнаружение белка Palmitoylation в культуре нейронов гиппокампа на Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (ABE)

Neuroscience
 

Summary

Обратимые добавлением пальмитат с белками является важным регулятором внутриклеточных белков торговли. Это представляет особый интерес в нейронах, где много синаптические белки palmitoylated. Мы используем простой биохимический метод для обнаружения palmitoylated белков в культивируемых нейронах, которые могут быть адаптированы для различных типов клеток и тканей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Palmitoylation это пост-трансляционной модификации липидов с участием крепление 16-углеродной насыщенные жирные кислоты, пальмитат, чтобы остатков цистеина субстрата белков через лабильный тиоэфир связь [отзывы в 1]. Palmitoylation подложки белка повышает его гидрофобность, и, как правило облегчает торговлю на клеточные мембраны. Недавние исследования показали, palmitoylation одним из наиболее распространенных липидных модификаций в 1 нейронами, 2, предполагая, что пальмитат оборота является важным механизмом, с помощью которого эти клетки регулируют адресности и торговли белков. Идентификации и обнаружения palmitoylated субстратов может поэтому лучше нашего понимания белка торговли в нейронах.

Обнаружение белка palmitoylation в прошлом был технически затруднено из-за отсутствия консенсуса между подложкой последовательности белков, а также опора на метаболические labeliнг пальмитоил-белки с 3 H-пальмитат, времени биохимического анализа с низкой чувствительностью. Развитие ацил-биотин бирже (ABE) анализ позволяет более быструю и высокую чувствительность обнаружения palmitoylated белки 2-4, и является оптимальным для измерения динамических оборот пальмитата на нейрональных белков. Анализ ABE состоит из трех биохимических этапов (рис. 1): 1) необратимой блокады немодифицированных группы тиоловых цистеина использованием N-ethylmaliemide (NEM), 2) специфическое расщепление и разоблачение тиоловых групп palmitoylated цистеина путем гидроксиламина (HAM), и 3) селективная маркировки palmitoylated цистеина помощью тиоловых-реактивного биотинилирование реагента, биотин-BMCC. Очистка тиол-биотинилированных белков после ABE шаги были различны, в зависимости от общей цели эксперимента.

Здесь мы опишем метод, чтобы очистить palmitoylated белка в первичном гиппокампадр. нейронов начальной иммунопреципитации (IP) шаг, используя антитела, направленные против белков, а затем с помощью анализа ABE и западных промокательной непосредственно измерить palmitoylation уровня этого белка, который называется IP-ABE анализа. Низкая плотность культур эмбриональных нейронов гиппокампа крысы были широко используется для изучения локализации, функции и торговли нейронов белки, что делает их идеально подходит для изучения нейронных palmitoylation белка использованием IP-ABE анализа. IP-ABE анализа основном требуется стандартный IP и западных промокательной реагентов и ограничивается только наличием антител против целевой подложки. Этот анализ может быть легко адаптирована для очистки и обнаружения трансфицированных palmitoylated белков в клеточных культурах гетерологичного, первичных нейронов культур, полученных из различных тканей мозга мыши и крысы, и даже первичная ткань мозга сама.

Protocol

1. Добыча целевого белка из культивируемых первичных нейронов гиппокампа

  1. Перед уборкой эндогенного белка из первичных клеток гиппокампа, подготовить буфер для лизиса (LB; табл. 1) с ингибиторами протеазы. К 10 мл буфера для лизиса, добавить 0,1 мл phenylmethanesulfonyl раствор фторида (PMSF) до конечной концентрации 10 мМ, и добавить 1 ингибитора протеазы коктейль таблетки.
  2. Подготовка N-этилмалеимид (NEM) решения (табл. 1) из лиофилизированного порошка. Мягко растворить в 100% этанола при комнатной температуре (RT). Всегда готовьте свежее решение NEM на день эксперимента.
  3. Далее объединить буфера для лизиса и NEM. Добавить 0,5 мл 2М раствора NEM в свежем 50 мл коническую трубку. Добавить 20 мл LB над верхней, и быстро месту LB + NEM (конечная концентрация 50 мМ) на качающейся платформе при 4 ° С, чтобы полностью перемешать в течение 5 мин. Всегда добавляйте NEM / EtOH решения первой и второй LB, чтобы правильно смешивать два.
  4. Удалить культивируемых нейронов из инкубатора и место на льду *. Аккуратно удалите сотовой средства массовой информации, и осторожно мыть дважды с холодным фосфатным буферным раствором (PBS) 1x. Добавить 300 мл LB + 50 мм NEM в первую лунку нейронов гиппокампа, а также лом клеток с использованием одноразовых спортсмена клетки. Сбор клеточный лизат, а затем разрядить лизат в следующий же этой группы. Очистите клеток в течение второго и использовании ячейки спортсмена, собирать, и повторить с помощью третьей хорошо, если это необходимо для дальнейшей концентрации лизата.
  5. Сбор клеточный лизат в предварительно охлажденную (на льду), 1,5 мл трубки микроцентрифуге. Повторите шаг 1,4 с использованием 100 мкл LB + 50 мм NEM собрать оставшиеся лизат клеток. Передайте общего лизат клеток через 26 ½ калибровочного шприца 5-6 раз, чтобы помочь в механическую лизис, будьте осторожны, чтобы не пускать мыльные пузыри в раствор. Можно вместо разрушать ультразвуком в течение 15 секунд на льду, если оборудование. Клеточный лизат колебаться в течение ≥ 30 мин при 4 ° C.
  6. Уточнить клетки ЛысаяТе центрифугированием при 16000 мкг / 30 мин для того, чтобы гранулы не-лизированных клеток и моющих средств нерастворимого материала.
  7. Сбор очищены клеточный лизат (супернатанта) в новом предварительно охлажденный 1,5 мл пробирку на льду. Повторить урожай протокол для всех групп клеток. Измерение концентрации белка во всех лизатов образцов с использованием BCA анализа и нормализации объема всех лизатов образцов из группы клеток, чтобы в точности равна общего белка, рекомендуется не менее 500 мкг. Долить все образцы с LB + 50 мм NEM до 500 мкл общего объема.
  8. Добавить 1-5 мкг первичного антитела, направленные против белка-мишени для каждой из лизата образца. Кивать антитело-лизат смешанных образцов в течение ночи при 4 ° C.

* Первичная гиппокампа крыс нейроны должны быть культивировали при плотности около 250.000 клеток / лунку в 6-луночных блюдо, в бессывороточной среде, содержащей B27 нейронов добавки, как описано выше 5, и выращивали в течение желанияD отрезка времени, обычно 14-16 дней, в пробирке (DIV), чтобы достичь зрелости. Не менее 500 мкг общего белка рекомендуется успешно иммунопреципитации и biotinylate целевой нейронов белки, которые обычно требуется 2-3 скважины 6-а блюдо.

2. Осадки из антиген-антитело белка-мишени

  1. Перед осаждения и иммобилизации белка-мишени, готовить 50% суспензии белка или белка G-покрытием бисера сефарозе. В частности, добавить ≥ 60 мкл сефарозе бисера на пробу в пробирки на 1,5 мл, убедившись, что все образцы имеют равное количество бусин. Магнитные шарики также подходит, если оборудование.
  2. Добавить равный объем 50% суспензии для каждого антитела лизата образца, и колебаться в течение ≥ 1 ч при 4 ° C.

3. Ацил-биотин Exchange: гидроксиламина (HAM) Расщепление

  1. При выполнении шага 2.2, подготовить ряд труб с буфером для лизиса (LB) диfferent рН. РН является очень важным для этих шагов и всегда должны быть скорректированы с помощью рН-метра. Подготовьте 2 мл LB рН 7,2 на пробу, и 0,5 мл буфера Строгие в образце (табл. 1). Также подготовить 0,5 мл LB + 10 мМ NEM на образец, как в шагах 1.1-1.3. Добавить PMSF и таблетках ингибитор протеазы для всех лизис буфера, как в пункте 1.1.
    1. Гидроксиламина (HAM) является мощным восстановителем, которые расщепления пальмитат из цистеина необходим для биотинилирование (рис. 1), и бездействие HAM расщепления служит в качестве отрицательного контроля. Сплит каждого образца из бисера на два образца, один опуская HAM шаг расщепления (-HAM), в том числе и один HAM шагом (+ HAM). Для нормализации для деградации белка вызвано HAM лечения, следует разделить каждую пробу в третьих, с 1/3 из бусин используются для управления-HAM, а оставшиеся 2/3 используется для лечения HAM +.
    2. Подготовить дополнительные 1.5 мл труб на льду, помечены как HAM-контроль для каждого образца. Следующим шагом 2,2, мягко центрифуги бисер всех образцов "на уровне 0,5 мкг / 1 мин при 4 ° C (центрифуг на такой скорости, продолжительности и температуры для всех остальных шагов, если не указано иное), разместите трубы на льду, удалить супернатант, и повторно приостанавливать бисером в 600 мкл LB + 10 мМ NEM.
  2. После повторного приостановления образцы "бусины в буфере для лизиса + NEM 10мм, немедленно собрать 200 мкл лизатов-шарик суспензии образца, и разряд в эту образца-HAM пробирку на льду. Добавить дополнительные 300 мкл LB + 10 мМ NEM к образцу-HAM, и дополнительно 100 мкл на образец + HAM на общую сумму в 500 мкл каждого образца. Инкубировать пробирки в течение 10 минут на льду.
  3. Повторное приостановить (мыть)-ХАМ и образцы + HAM мягко 0,5 мл строгие буфера, на пробу. Выполните этот шаг быстро, так как больше SDS инкубации приведет к удалению связанного антитела сбисером.
  4. Осторожно промыть все образцы три раза в 0,5 мл / образец LB рН 7,2, и спином вниз между промывками, как в шаге 3.2b.
  5. При выполнении шага 3.5, подготовить HAM буфера (табл. 1). Добавить соответствующий объем раствора гидроксиламина в новую пробирку, для достижения конечной концентрации 1 М в объеме 0,5 мл LB рН 7,2, в + HAM образца. Всегда готовьте HAM буфера свежей в течение дня эксперимента. Добавить 0,5 мл / образец LB рН 7,2 для всех-HAM образцов и 0,5 мл / образец HAM буфер для всех образцов + HAM.
  6. Кивать всех образцов в течение 1 часа при комнатной температуре (RT). Не превышать 1 час.

4. Ацил-биотин Exchange: биотин-BMCC маркировки

  1. При выполнении шага 3.6, подготовить 2 мл LB рН 6,2 в образце (табл. 1), как и в шаге 3.1. Поместите LB рН 6,2 на льду пока нет необходимости. Также приготовьте раствор из биотин-BMCC (табл. 1) непосредственно перед использованием. Взвесить exacTLY 2,1 мг Биотин-BMCC, собирают в 1,5 мл трубки и аккуратно растворить в 0,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО), поместив на качающейся платформе при комнатной температуре, чтобы достичь концентрации 8 мм (не используйте пипетку, чтобы разбить порошок ).
  2. После шагом 3,6 завершена, аккуратно мыть раз в бисер рН 6,2 буфере для лизиса, чтобы удалить остатки буфера HAM. Удалить супернатант и поместить образцы на льду.
  3. Биотин-BMCC является maliemide сопряженной молекуле биотина, который имеет высокое сродство к бесплатным тиоловых групп цистеина (рис. 1). При выполнении шага 4.2, подготовить 0,5 мл Биотин-BMCC буфера (табл. 1) в образце, в рабочей концентрации от 0,5 до 5 мкм. Концентрациях, превышающих 5 мкм, скорее всего, насыщать белка-мишени 6, и, как правило, не должны превышаться, однако это может отличаться в зависимости от желаемого целевого белка. Добавить 0,5 мл Биотин-BMCC буфера для каждого образца, и кивать ровно 1 ч при 4 &град; C. Не превышать 1 час.

5. Элюирование Биотин-сопряженных белка-мишени и SDS-PAGE

  1. После шагом 4,3 завершена, аккуратно вымыть всех образцах один раз в LB рН 6,2. Храните образцы на льду между стирок. Удалить 2x SDS буфера для образца, не восстановителей (табл. 1) от -20 ° C хранения и медленно таять на льду.
  2. Осторожно промыть Образцы три раза в LB рН 7,5 + PMSF / ингибиторы, и сохранить образцы на льду между стирок.
  3. Удалить супернатант третьего мытья, оставив гранулированный бусины в виде суспензии с остальными буфера в нижней части трубы. Опустите пипетку с малым диаметром наконечника (чаевых гель погрузки или кончиком пипетки P2 достаточно) в самой нижней части трубы через суспензию, и быстро собрать оставшиеся буфера, будучи осторожным, чтобы не занимать любые бусы.
  4. Дополнение 2x образец SDS буфера с DL-Dithiothreitol (DTT) для достижения конечной концентрации 5 мм. Добавлять40-50 мкл 2х буфера для образцов + 5 мМ DTT для каждого образца. Если необходимо, вихрь бисера, чтобы полностью смешать с буфером для образца, и сразу же центрифуги на высокой скорости, чтобы собрать все бусины в гранулах, погруженная в образце буфера.
  5. Варить все образцы в течение 10 мин при 75-80 ° C. Пусть образцы охлаждают до комнатной температуре в течение ≥ 10 мин на скамейке сверху, и центрифуге при 16000 мкг / 3 мин, чтобы полностью гранул бисера.
  6. Добавить полном объеме Элюированную белка (супернатант) из каждого образца к одной полосе в полиакриламидном геле подходит для вестерн-блоттинга, используя SDS-PAGE 7. Организовать все образцы, так что-HAM элюента контроля и элюента + HAM для одного образца выполняются непосредственно примыкающих друг к другу во время SDS-PAGE (рис. 2). После SDS-PAGE, передать PVDF или нитроцеллюлозные мембраны.

6. Вестерн-блоттинга и выявление Palmitoylation целевого белка

  1. После шагом 5,6 завершена, мыть мембраныДважды в трис-буферном растворе (TBS 1x) в течение 10 мин на качающейся платформе при комнатной температуре.
  2. Подготовка блокирующего буфера, чтобы блокировать неспецифические маркировки путем взвешивания бычьего сывороточного альбумина (БСА), чтобы достичь 3% веса в объеме TBS 1x + Твин-20 0,05% (TBS-T), что является достаточным, чтобы полностью погрузиться мембраны . Для стрептавидин блоттинга, всегда блокировать с BSA, а не сухое молоко. Блок мембраны в течение 1 часа при комнатной температуре на качающейся платформе.
  3. Подготовка антитела решения TBS-T + 0,3% BSA. Добавить стрептавидин-HRP антител восстановленного в дозе 1 мг / мл в дистиллированной воде, разбавленной в 1:5,000-1:10,000. После шагом 6,2 завершена, мыть мембраны раз в TBS-T в течение 10 мин, затем инкубировать мембраны в раствор антител Стрептавидин на качающейся платформе либо в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C.
  4. Вымойте мембраны три раза в TBS-T в течение 10 мин на качающейся платформе. Для того, чтобы обнаружить palmitoylation сигнал, подвергать люминесценции HRP использованием химическихiluminescent Комплект подложки.
  5. Для того, чтобы нормализовать palmitoylation уровней на сумму интерес белка, который был иммунопреципитировали, лишить мембраны использованием вестерн-блот зачистки буфера в течение 5-10 мин на качающейся платформе при комнатной температуре. Повторите шаги 6,1 - 6,4 с использованием первичных антител против белка интереса, который изначально использовался для иммунопреципитации.
  6. Количественная palmitoylation белка интереса с использованием программного обеспечения для анализа изображений, нормализуют palmitoylation уровней на сумму иммунопреципитации белков.

Representative Results

IP-ABE анализа конкретно определяет тиол-palmitoylation остатков цистеина вдоль подложки белков, и могут быть использованы для обнаружения palmitoylation из иммунопреципитации нейронов белки таким образом, изображенной на рисунке 1. Лечение иммунопреципитации нейронов белки с ветчиной (рис. 1) расщепляет тиоэфир связь между пальмитат и тиоловой группы цистеина, что позволяет для конкретного включения биотин-BMCC на вновь доступны тиоловых групп, которые могут быть впоследствии обнаружены с помощью вестерн-блоттинга. Бездействие HAM (минус-HAM) расщепления предотвращает включение биотин-BMCC и функций в качестве отрицательного контроля для конкретных пальмитоил-биотинилирования плюс-HAM образца, и поэтому должны всегда работать рядом с плюс-HAM образцом для западных блоттинга на SDS-PAGE (рис. 2).

В оптимизированных эксперимента (рис. 2а), palmitoylationСигнал нейронов белки δ-катенина 2 может быть легко обнаружен блоттинга для биотин-BMCC в концентрации 1 мкМ, с помощью стрептавидин сопряженных с HRP, против параллельной минус-и плюс-HAM образцов. Определенный сигнал palmitoylation для δ-катенина появляется на его предсказать размер 160kD, только в плюс-HAM образца. Специфика этот сигнал был подтвержден reprobing для δ-катенина с конкретными антитела, которые изначально предназначался для иммунопреципитации его, в результате чего сигнал в обоих HAM лечения, в то же предсказал размер. Оптимизация IP-ABE анализа (рис. 2A) приведет к западной промокательной профиль минус-HAM образца, который легко отличить от плюс-HAM образца, и обладает минимальным, чтобы не palmitoylation сигнала.

Концентрация биотина BMCC используется для обозначения palmitoylated цистеина требует тщательной оптимизации, и если супер-насыщающей концентрации биОтин-BMCC используется в химии ABE шагов (рис. 2В), чрезмерные фон и неспецифические сигналы будут видны. Линейную кривую ответа на биотинилирования palmitoylated нейронов белки, α7 никотинового рецептора ацетилхолина, используя биотин-BMCC ранее были определены 6, и показывает почти полное насыщение при концентрации 5-10 мкМ. Хотя оптимальная концентрация биотина BMCC будет несколько отличаться в зависимости от нейронов белка-мишени, лечение с биотин-BMCC в концентрации более 5 мкм, скорее всего, супер-насыщения белка-мишени, и в результате западной профиль пятно с видимым фоном и неспецифические сигналы. Концентрации 0,5 мкМ для биотин-BMCC был ранее использован для обнаружения palmitoylation других нейронов белки, включая SNAP-25, гентингтина, АМРА подразделений GluA1 и GluA2, и paralemmin 8, и определение оптимальной концентрации для романабелка-мишени может быть достигнуто путем проб и ошибок в линейном порядке, начиная в диапазоне 0.5-5 мкм, что мы описываем здесь. В результате стрептавидин вестерн-блот профилей среди минус-и плюс-HAM образцов для δ-катенина palmitoylation кажутся похожими, когда обрабатывали 4 мкМ биотин-BMCC (рис. 2В), с дополнительными сигналами фона в различных размерах, что свидетельствует о нарушении биотинилирование произошло.

Гидроксиламин является мощным восстановителем, что приводит к ограниченной деградации белка-мишени, в дополнение к его эффективному расщеплению тиоэфир связи. Следовательно, оптимизация ABE химии требует от одного до нормализации количества иммунопреципитации белков используются для минус-и плюс-HAM образцов (шаг 3,2 - 3,3). Нормализация требует использования двойного количества иммобилизованного белка-мишени в плюс по сравнению с минус-HAM образца, который фактически приводит к неотличимы западныйп-блоттинга профили для белка-мишени, как показано на δ-катенина (рис. 2A, B). Однако, если количество иммобилизованного белка-мишени не нормируется между минус-и плюс-HAM образцов, полученный западной сигнал пятном для целевого белка в плюс-HAM образцы могут быть потеряны, как показано на δ-катенина при равных количествах белки были использованы в обоих HAM лечения (рис. 2).

Специфика ABE химии для маркировки palmitoylated белки очень чувствительна и требует оптимизации. Распространенных ошибок, возникших в ходе IP-ABE анализа включают суб-оптимальные результаты показаны на рис 2Б и 2В, и деградации белка-мишени, независимо от HAM лечение, которое, как правило, вызваны старше реагентов и буферов, и неправильный рН. Для того, чтобы избежать этих ошибок и исправлять неоптимальной химии ABE, свежести и концентрации реагентов, необходимых длябуферы приведены в таблице 1 всегда должно быть рассмотрено, и рН настройки все буферы всегда должны быть проверены перед запуском эксперимента.

Буфер Рабочая концентрация Комментарии
Буфера для лизиса (LB) В дистиллированной H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5 150 мМ NaCl, 10% глицерина N / A Подготовка перед экспериментом и хранить при 4 ° C
Решение NEM В 100% EtOH: NEM лиофилизированный порошок 2 M Подготовить свежие, непосредственно перед применением.
Строгие буфера В LB: 10 мМ MEM 0,1% SDS N / A Подготовка непосредственно перед использованием, держать на льду.
LB рН 7,2 В LB: Отрегулируйте рН до 7,2 раз N / A Использование рН-метра для регулирования рН непосредственно перед употреблением.
HAM буфера В LB рН 7,2: Фото со HAM решения 1 M (конечная концентрация HAM) Подготовка непосредственно перед употреблением.
LB рН 6,2 В LB: Отрегулируйте рН до 6,2 раз N / A То же, что и для LB рН 7,2
Со биотин-BMCC решение В ДМСО: 2,1 мг Биотин-BMCC решения 8 мМ Подготовка непосредственно перед употреблением.
Биотин-BMCC буфера В LB рН 6,2: Добавить биотин-BMCC решения 1 - 5 мкМ (конечная биотин-BMCC концентрации) Подготовка непосредственно перед употреблением.
2х SDS буфера для образца, не восстановителей В дистиллированной H 2 O: 5% SDS 5% глицерина 125 Трис-HCl, рН 6,8 0,01% Bromophenol синий N / A Подготовка перед экспериментом, и хранить при температуре -20 ° С до использования. Дополнение 5 мМ DTT перед использованием.

Таблица 1. Буферы и реагенты, необходимые для IP-ABE анализа. Многие из лизис буфера могут быть подготовлены до начала эксперимента, однако рН должна быть проверена и скорректирована непосредственно перед использованием с помощью рН-метра, чтобы обеспечить успех химии ABE. Большинство фондовых решения должны быть подготовлены свежей для каждого эксперимента, непосредственно перед применением. Многие из буфера требует реагентов, общих для большинства лабораторий, оснащенных для биохимии и специальных реагентов с поставщиком информации, перечисленные в таблице реактивов и оборудования.


Рисунок 1. Схема Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (IP-ABE) анализа для очистки и обнаружения palmitoylation нейронов белки. Искусственный нейронов гиппокампа лизируются, (1) белка-мишени, затем очищают, используя мишень-специфических антител, иммобилизованных на сефарозе гранул, покрытых белком G и А. очищенной целевой белок является то (2) обрабатывают N-ethylmaliemide (NEM) необратимо связывается и блокирует свободный тиол (-SH) группы по немодифицированных цистеина (С). Белка-мишени, затем (3) подвергались лечению с гидроксиламин (HAM), в результате специфического расщепления тиоэфир облигаций на palmitoylated цистеина и разоблачение бесплатно palmitoylated тиоловой группы (-SH). Далее, белка-мишени (4) treateD с тиол-реактивных молекул биотин, биотин-BMCC, в результате конкретной биотинилирования palmitoylated цистеина. И, наконец, (5) биотинилированного белка-мишени вымывают и удаляют из антитела и шарик. Белка-мишени с palmitoylated цистеина (ы) с тегом биотин сейчас подходят для SDS поли-акриламида гель-электрофореза (SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга с стрептавидином для обнаружения palmitoylation очищенной нейронов белки. Нажмите, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Обнаружение palmitoylation нейронных белка δ-катенина использованием IP-ABE анализа. Первичная гиппокампа крыс нейроны были выращены в качестве предварительногоviously описал 5, при плотности 130 клеток / мм 2 до погашения в 14DIV, затем лизируются, и подвергаются IP-ABE анализа для выявления palmitoylation из недавно идентифицированных нейронов palmitoylated подложки, δ-катенина 2. Очищенный иммунопреципитатах (КП) из δ-катенина (белка-мишени) были выделены с использованием 5 мкг δ-катенин антитела в образце (лабораторий BD Transduction), а затем подвергали SDS-PAGE в параллельном минус-и плюс-гидроксиламина (HAM) образцам. Palmitoylation был обнаружен вестерн-блоттинга (ВБ) со стрептавидин-HRP (palmitoylation), и мембрана была раздета и подвергают reprobe ВБ для δ-катенина. (A) оптимизированный представителя IP-ABE результат для palmitoylated δ-катенина (стрелки) обрабатывают 1 мкМ биотин-BMCC, иллюстрирующие специфику ABE химии для обнаружения тиол-palmitoylated белков из IP образцов. (B) неоптимальной предтель IP-ABE результат для δ-катенина, где избыточной концентрации 4 мкМ биотин-BMCC был использован, в результате неспецифических сигналов и фона в обоих минус-и плюс-HAM образцов (стрелки). (C) Еще один неоптимальной представителя IP-ABE ВБ для δ-катенина, где чрезмерная 4 мкМ концентрация биотина BMCC был использован, и количество белка, используемого для плюс-HAM IP выборка не была нормирована для HAM-опосредованной деградации белков, в результате чего потери сигнала в reprobe ВБ для δ-катенина. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Discussion

IP-ABE анализа, представленные здесь, простой и очень чувствительный метод для обнаружения palmitoylated белков в культивируемых первичных нейронов гиппокампа, который обычно используется для стандартных биохимических методов. Это делает анализ легко адаптируется для лабораторий уже оснащены западных промокательной материалов. IP-ABE анализа сочетает в себе стандартный протокол иммунопреципитации, чтобы изолировать и обездвижить своего белка-мишени, а затем описанной ранее ABE химии 2-4 для быстрого выявления уровня пальмитата на подложке белка. Техника ABE имеет широкий спектр применения для изучения palmitoylated белков в различных тканях и клеточных линий, в том числе крупномасштабных пальмитоил-протеомных скрининг глобальных профилей palmitoylation, и быстрое обнаружение palmitoylation уровня одного белка-мишени.

Предыдущее описание ABE химии использовали различные методы лизис клетки и моющие средства извлечения нейронов прот2 Eins, 9, свободный тиол-блокады 10, 11, биотинилирование и очистки целевого белка 4, в зависимости от применения эксперимента. Кроме того пальмитата в нейронных результаты белки в их таргетинг на клеточные мембраны, и обнаружение palmitoylated доля белка-мишени будет требовать его извлечения из этих мембран. Ранее описанный ABE методологии использовались различные ионные 9 и неионные детергенты 8 до извлечения желаемого белков-мишеней, а также использование конкретного моющего средства зависит от белка-мишени и ее известные мембраны с торговлей людьми. Здесь мы используем неденатурирующем и неионогенных моющих средств IGEPAL CA-630 для извлечения palmitoylated белки, которые мы утверждена для добычи и обнаружения palmitoylated нейронов белки δ-катенина (рис. 2). Структура IGEPAL CA-630 включает в себя громоздкой и жесткой неполярных головной группы, которые ненарушать нативную конформацию белка или взаимодействий, но позволяет его связь с гидрофобными участками мембранных белков, связанных, тем самым присвоении смешиваемость с ними и позволяет их добычи. Многие нейронов белки локализованы в постсинаптической мембраны или пост-синаптические плотность синапсов должны быть извлечены при помощи IGEPAL CA-630, однако некоторые из них не может полностью растворить, и может потребовать использования различных неденатурирующем моющих средств, как Тритон Х-100, который имеет ранее использована для ABE химия 2, 8.

Несколько описаний ABE химии также используются различные тиол-реактивного биотинилирование реагента от молекулы мы описываем здесь, называется биотин-HPDP (Thermo Scientific), которая также требует различных способов очистки белков 4. Биотин-HPDP другой тиол-реактивный, maliemide конъюгированных биотин молекула, которая содержит дисульфидные связи в maliemide руку компоновщик, структурно-Differentiating его из биотин-BMCC, которые не содержат этот дисульфидных связей. После тиол-биотинилирования бесплатно или palmitoylated цистеина белка по биотин-HPDP, в результате дисульфидные связи между белком-мишенью и группа биотина может быть расщеплены за счет сокращения реагентов, чтобы освободить биотин группы и регенерации белков в его исходной форме, что делает биотинилирование Биотин по-HPDP переходных и обратимы. Таким образом, использование этого реагента биотинилирование требует очистки целевого белка авидина иммобилизованных реагентов, таких как покрытых стрептавидином шарики. Тем не менее, тиол-биотинилирования целевого белка биотин-BMCC, как мы описываем здесь, является стабильной и относительно постоянной, и требует очистки целевого белка антитела, направленные против цели, и иммобилизованными на сефарозе бисера. Оба ABE методы были ранее использованы для крупномасштабного экраны, и обнаружение palmitoylation одного белков 2, 8-10, 12 иIP-ABE анализа мы опишем здесь является оптимальной для быстрого обнаружения palmitoylation одного нейрона белки-мишени.

Подавляющее большинство сотовых palmitoylation связано с обратимой добавлением пальмитата в тиоловой группой цистеина (называется S-palmitoylation, которые мы обобщаем как «palmitoylation» в этом протоколе), однако очень ограниченная группа белков подвергается необратимым palmitoylation на глицин и остатков цистеина посредством формирования стабильной амидных связей, называемых N-palmitoylation 13. Одним из ограничений ABE химии является ее неспособность обнаружить N-palmitoylation благодаря стабильности амидной связи, и поэтому показ новой белка-мишени для palmitoylation должно быть подтверждено с помощью 3Н-пальмитат метаболических маркировке 1.

Как упоминалось ранее, IP-ABE анализ может быть легко адаптирована для изучения palmitoylation в белковых экстрактов из различных источников, в том числе переходsfected гетерологичных клеточных линий, основной ткани и первичных нейронов культур из различных областей мозга. IP-ABE анализа была использована для изучения palmitoylation достаточности мутировал цистеин-на-серин белков для определения местоположения palmitoylated цистеина по белку-мишени 8, для изучения динамической оборот пальмитата в синаптических белков в культивируемых нейронов в базальных условиях 10, и изменения в palmitoylation уровне нейронов белки после индукции нейронной активности 9. Чувствительность и адаптируемость IP-ABE анализа делают его идеально подходящим для изучения palmitoylation профилей нейронов белки, оптимальные для выявления динамических изменений в palmitoylation.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами от Канадского института исследований в области здравоохранения MOP-восемьдесят одна тысяча сто пятьдесят-восемь.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
  2. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, 904-909 (2008).
  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
  6. Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. Assays of protein palmitoylation. Methods. 40, 127-134 (2006).
  7. Eslami, A., Lujan, J. W. estern Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  8. Huang, K., et al. Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity. FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).
  9. Noritake, J., et al. Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95. J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).
  10. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  11. Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking. Neuron. 64, 213-226 (2009).
  12. Ho, G. P., et al. S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95. Neuron. 71, 131-141 (2011).
  13. Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling. Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).

Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics