Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

Neuroscience
 

Summary

Proteinlere palmitat arasında reversibl Ayrıca hücre içi protein ticaretinin önemli bir düzenleyicisidir. Bu birçok sinaptik proteinlerin palmitoylated edilir nöronların özel bir ilgi alanıdır. Biz birden fazla hücre tipleri ve dokuları için adapte edilebilir kültürü nöronlar içinde palmitoylated proteinleri tespit etmek için basit bir biyokimyasal yöntem kullanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brigidi, G. S., Bamji, S. X. Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE). J. Vis. Exp. (72), e50031, doi:10.3791/50031 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Palmitoylation labil bir tioester bağı ile alt tabaka proteinlerin sistein artıkları için bir 16-karbon doymuş yağ asidi, palmitat, ve eki içeren post-translasyon lipit modifikasyonu [1 gözden]. Bir alt tabaka proteininin Palmitoylation onun hidrofobik arttırır, ve tipik olarak hücresel membranlarda doğru olan ticareti kolaylaştırır. Son çalışmalar, palmitat devir bu hücrelerin proteinlerin hedefleme ve ticareti kontrol eden önemli bir mekanizmadır geldiğini gösteren, nöron 1, 2, en sık lipit modifikasyonları biri olduğu palmitoylation göstermiştir. Palmitoylated yüzeylerin belirlenmesi ve tespiti dolayısıyla nöronların protein kaçakçılığı anlayışımızı daha iyi yapamaz.

Geçmişte protein palmitoylation saptanması teknik olarak bağlı olarak alt tabaka proteinler arasında bir uzlaşma dizisi olmaması nedeniyle çok ve metabolik labeli bağımlılığın olmuştur3 H-palmitat, düşük hassasiyet ile zaman alıcı bir biyokimyasal test ile ng Palmitoyl-proteinler. Açil-Biotin Borsası (ABE) Testin Geliştirilmesi palmitoylated proteinlerin 2-4 daha hızlı ve yüksek hassasiyet algılama sağlar ve nöronal proteinler üzerinde palmitat dinamik ciro ölçmek için en uygunudur. Abe tahlil üç biyokimyasal adımda (Şekil 1) oluşur: 1) değiştirilmemiş sisteyin tiyol gruplarının geri dönüşsüz blok N-ethylmaliemide (NEM), 2) spesifik bölünme ve hidroksilamin (HAM) ile palmitoylated sistein en tiyol grubunun kuşkuya kullanarak, ve bir tiol-reaktif biyotinilasyon reaktifi kullanılarak palmitoylated sistein 3) seçmeli işaretlemesi, biyotin-BMCC. Abe adımlar aşağıdaki tiyol-tinile proteinlerin saflaştırılması deney genel amacına bağlı olarak, farklılık göstermektedir.

Burada, birincil hippocamp bir ilgi palmitoylated proteini saflaştırmak için bir yöntem tarifbir ilk immünopresipitasyon (IP) Abe tahlil ve batı direkt olarak IP-ABE tahlil adlandırılır o proteinin palmitoylation seviyelerini ölçmek için kurutma ve ardından protein, karşı yöneltilmiş bir antikor kullanarak, basamak al nöronlar. Embriyonik sıçan hipokampal nöronların Düşük yoğunluklu kültürlerde yaygın IP-ABE deneyi kullanılarak nöronal protein palmitoylation eğitim için onları ideal uygun hale lokalizasyonu, fonksiyon ve nöronal protein ticareti incelemek için kullanılmıştır. IP-ABE tahlil ağırlıklı standart IP ve batı blot reaktifler gerektirir ve yalnızca hedef yüzeye karşı antikor durumu ile sınırlıdır. Bu testte kolaylıkla heterolog bir hücre kültürleri, fare ve sıçan gerekse çeşitli beyin dokusundan türetilmiş birincil nöronal kültürler, ve hatta primer beyin dokusunun kendisi de palmitoylated transfekte edilmiş proteinlerin saflaştırılması ve tespit için adapte edilebilir.

Protocol

1. Kültürlü İlköğretim Hipokampal Nöronlar gelen Hedef Protein Ekstraksiyonu

  1. Proteaz inhibitörleri ile; primer hipokampal hücrelerinde endojen protein hasat öncesinde, bir Lysis Buffer (Tablo 1 LB) hazırlamak. Lizis tamponu 10 ml, 10 mM bir son konsantrasyon için 0.1 ml çözelti fenilmetansülfonil florür (PMSF) ekleyin ve 1 proteaz önleyici kokteyl tablet ekleyin.
  2. Liyofilize toz N-etilmaleimid (NEM) solüsyonu (Tablo 1) hazırlayın. Yavaşça oda sıcaklığında (RT),% 100 EtOH içinde çözülür. Her deney günü taze NEM solüsyon hazırlanır.
  3. Sonraki lizis tamponu ve NEM birleştirir. Bir taze 50 ml konik tüpe 2M NEM çözeltinin 0.5 ml ilave edilir. 20 üstünden ml LB, ve hızlı bir şekilde yer LB Ekle 4 bir sallanan bir platform ° C tam 5 dakika boyunca karıştırmak için + NEM (50mM final konsantrasyon). Her zaman düzgün bir şekilde karıştırmak için iki şekilde, NEM / EtOH çözelti birinci ve ikinci LB ekleyin.
  4. Inkübatör ve buz * üzerine yerden kültürü nöronlar çıkarın. Yavaşça hücresel ortamı çıkarın ve hafifçe soğuk fosfat ile iki kez yıkayın salin (PBS) 1x tamponlu. Tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı ile hipokampal nöronlar, ve kazıma hücrelerinin birinci oyuğa 300 ml LB + 50 mM NEM ekleyin. Hücre lisatı toplayın, o zaman bu grubun iyi bir sonraki içine lizat deşarj. Hücre kaldırıcı kullanarak iyi ikinci olan hücreleri kazıyın, toplamak ve daha lizat konsantre etmek gerekirse, bir üçüncü de kullanarak tekrarlayın.
  5. Bir önceden soğutulmuş (buz üzerinde), 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine hücre lisatı toplayın. Kalan hücre lizat toplamak için LB 100 ul + 50mM NEM kullanarak 1.4 adımı yineleyin. Çözüm içine kabarcıklar darbe için dikkatli olmak, mekanik parçalanma yardımcı olmak için bir 26 ½ göstergesi şırınga 5-6 kez ile total hücre lizatı pas. Ekipman varsa biri yerine, buz üzerinde 15 saniye boyunca sonikasyon yapabilirsiniz. 4 ° C'de 30 dakika süreyle ≥ hücre lisatı Nutate
  6. Hücre lysa Açıkladılarte sipariş pelet un-parçalanan hücreler ve deterjan-çözünmeyen malzeme 16,000 xg / 30 dk santrifüj tarafından.
  7. Buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş 1.5 ml tüp hücre lizat (süpernatant) temizlenir toplayın. Hücrelerin tüm gruplar için hasat protokolü tekrarlayın. Tedbir protein BCA assay kullanarak tüm lizat örneklerinde konsantrasyon ve 500 mcg, önerilen minimum, tam olarak eşit toplam protein olması hücre gruplarının tüm lizat örneklerin hacim normalleştirmek. Tüm örneklerde LB + 50mM NEM ile 500 ul toplam hacmi kadar ekleyin.
  8. Lizat, örneğin her için hedef proteine ​​karşı yöneltilmiş birincil antikor 1-5 ug ekleyin. 4 gecede antikor-lizat karışık numune ° C. Nutate

* Birincil fare hipokampal nöronlar bir nöronal B27 eki ihtiva eden bir serumsuz ortam içinde, / iyi bir 6-çanak içinde yaklaşık olarak 250,000 hücrelik bir yoğunlukta kültür az olmalıdır, daha önce arzu 5 için tarif edilmiştir ve yetiştirilend zaman uzunluğu, olgunluk elde etmek için tipik olarak 14-16 gün-in-vitro (DIV). Toplam protein, 500 ug en az başarılı bir şekilde immunoprecipitate ve tipik olarak 6-çanak 2-3 kuyu gerektiren bir hedef nöronal protein, biotinylate tavsiye edilir.

2. Antikor-Bağımlı Hedef Protein yağış

  1. Bir hedef protein hızlandırıcı ve hareketsizleştirici önce, protein A veya protein G-Sepharose boncuk kaplı% 50 bulamaç hazırlanır. Özellikle, tüm örnekler boncuk eşit miktarda sahip olmasını sağlamak, 1.5 ml tüpler için örnek başına Sepharose boncuk ≥ 60 ul ekleyin. Donanım mevcut olduğu takdirde manyetik boncuklar da uygundur.
  2. Her bir antikor-lisatı numune için en az% 50 bulamaç eşit hacimde bir ekleyin ve 4 ≥ 1 saat boyunca nutate ° C.

3. Açil-Biotin Değişim: Hidroksilamin (HAM) Dilinim

  1. Adım 2.2 gerçekleştirirken, di lizis tamponu (LB) ile tüpler bir dizi hazırlamakfferent pH. PH adımları için çok önemlidir ve her zaman bir pH metre kullanılarak ayarlanmalıdır. LB numune başına pH 7,2 ve numune başına Sıkı Tampon (Tablo 1) 0,5 ml 2 ml hazırlayın. Ayrıca adımları 1.1-1.3 olarak, 0.5 ml LB numune başına + 10mM NEM hazırlamak. Adım 1.1 'de olduğu gibi, her lizis tampon ile PMSF ve proteaz inhibitörü tablet ekleyin.
    1. Hidroksilamin (HAM) olan bölünme palmitat ve sistein dan biyotinilasyon (Şekil 1) için gerekli olan bir kuvvetli indirgeyici madde, ve HAM bölünme ihmal bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Iki örnek, HAM dilinim adım (-HAM) atlayarak biri ve HAM adım (+ HAM) dahil olmak üzere tek bir boncuk her numune Böl. HAM tedavisi neden protein parçalanması için normalize etmek için, bir-HAM kontrolü için kullanılan boncuk 1/3 ile, üçe bölünmüş her bir numune gerekir, ve geriye kalan 2/3 + HAM tedavi etmek için kullanılır.
    2. Ek 1 hazırlayın.Her bir numune için-HAM kontrol olarak etiketlenmiş buz üzerinde 5 ml borular. Adım 2.2 takiben, hafifçe 4 ° C (bu hız, süre, ve aksi belirtilmedikçe bütün geri kalan adımları için sıcaklığında santrifüj) 0.5 xg / 1 dak tüm örneklerde 'boncuk santrifüj, buz üzerinde tüp yerleştirin, süpernatant kaldırmak ve LB + 10mM NEM 600 ul boncuklar tekrar askıya.
  2. Lizis tamponu + NEM 10mM yeniden askıya örnekleri 'boncuklar sonra, hemen buz üzerinde bu numune-HAM tüp içine 200 numunenin lizat-boncuk bulamaç ul ve deşarj toplamak. LB ilave bir 300 ul +-HAM örnek için 10 mM NEM eklendi, ve her bir numune içinde 500 ul toplam + HAM örnek için ilave bir 100 ul ekle. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin.
  3. Yeniden askıya (yıkama)-HAM ve + HAM örnekleri yavaşça 0.5 ml sıkı tampon, numune başına. Daha uzun bir SDS inkübasyon dan bağlı antikor çıkarılması neden olacağı için, hızlı bir şekilde bu adım gerçekleştirmeboncuk.
  4. Yavaşça LB pH 7,2 ve 0,5 ml / numune içindeki tüm numunelerin üç kez yıkayın, ve adım 3.2b gibi Yıkamalar arasında aşağı doğru döndürün.
  5. Adım 3.5 gerçekleştirirken, HAM tamponu (Tablo 1) hazırlayın. 0.5 ml LB pH 7.2, HAM + her numune hacmi içinde 1 M arasında bir nihai konsantrasyon elde etmek için, yeni bir boru ile hidroksilamin solüsyonu uygun miktarda ekleyin. Her deney günü taze HAM tamponu hazırlayın. Tüm-HAM örnekler ve tüm + HAM örnekleri HAM tamponu 0.5 ml / numune LB pH 7,2 ve 0,5 ml / numune ekleyin.
  6. Oda sıcaklığında (RT) 1 saat için tüm örnekler Nutate. 1 saat aşmayın.

4. Açil-Biotin Değişim: Biotin-BMCC Etiketleme

  1. Adım 3.6 gerçekleştirirken, LB pH 2 ml hazırlamak adım 3.1 'de olduğu gibi numune başına 6.2 (Tablo 1). Ihtiyaç kadar buz üzerinde LB pH 6.2 yerleştirin. Ayrıca kullanımdan hemen önce Biotin-BMCC (Tablo 1) bir stok solüsyon hazırlanır. Exac üzerinden tartılırBiotin-BMCC arasında tly 2.1 mg, 1.5 ml tüp içinde toplamak ve yavaşça 8mm konsantrasyon (tozu dağıtmak için bir pipet kullanmayan elde etmek için, oda sıcaklığında bir sallanan platform üzerine yerleştirilerek 0.5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülür ).
  2. Adım 3.6 tamamlandığında, yavaşça rezidüel HAM tampon kaldırmak için, pH 6.2 lizis tamponu kez boncuk yıkayın. Süpernatantı ve buz üzerinde örnekleri yer.
  3. Biotin-BMCC sistein serbest tiyol grupları (Şekil 1) için yüksek bir afiniteye sahiptir, bir maliemide biyotin konjuge bir moleküldür. Adım 4.2 gerçekleştirirken, 5 uM, 0,5 uM arasında çalışan konsantrasyonda, numune başına Biotin-BMCC Tamponu içinde 0.5 ml (Tablo 1) hazırlanması. 5 mcM aşan konsantrasyonlar olasılıkla hedef protein 6 doyurabilecek olacak ve genellikle aşılmamalıdır, ancak bu istenilen hedef protein bağlı olarak değişebilir. Her numune için Biotin-BMCC tamponu 0.5 ml ekleyin ve ve 4 de tam 1 saat nutatedeg; C. 1 saat aşmayın.

5. Biotin-konjuge Hedef Protein ve SDS-PAGE ve elüsyon

  1. Adım 4.3 tamamlandığında, yavaşça LB pH 6.2 'de bir kez tüm örnekler yıkayın. Yıkamalar arasında buz üzerinde tüm örnekler tutun. -20 ° C depolama hiçbir indirgeyici ajanlar (Tablo 1) ile 2x SDS Örnek Tamponu çıkarın ve yavaşça buz üzerinde eritin.
  2. Yavaşça LB pH 7.5 'te örnekleri üç kez yıkayın + PMSF / İnhibitörleri ve yıkar arasında buz örnekleri tutmak.
  3. Tüpün alt içinde kalan tampon ile bir bulamaç içinde peletlenmiş boncuklar bırakarak, üçüncü yıkama süpernatantı. Bulamaç ile tüpün çok dibine küçük çaplı ucu (bir jel yükleme ucu veya P2 pipet yeterlidir) ile bir pipet batırın ve hızlı bir şekilde herhangi boncuk almak için dikkatli olmak, kalan tampon toplamak.
  4. 5 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere DL-ditiyotretol (DTT) ile 2x SDS numune tamponu Supplement. EklemekHer numune için 2x Sample Buffer 40-50 ul + 5mM DTT. Gerekirse, vorteks boncuklar tamamen numune tamponu ile karıştırılması halinde, derhal numune tamponu batırılmış bir pelet tüm boncuk, toplamak için yüksek hızda santrifüj.
  5. 75-80, 10 dakika için tüm örnekler kaynatılır ° C. Tamamen pelet boncuk 16.000 az ≥ 10 tezgah üstüne dk ve santrifüj xg / 3 dk RT serin örnekleri edelim.
  6. Batı SDS-PAGE 7 kullanıyorsanız, kurutma için uygun bir poliakrilamid jel içinde tek şeride her örnekten Elüsyonlanan protein (süpernatant) tam hacmi ekleyin. Tek bir örnek için kontrol-HAM ve çıkarıcı solvent + HAM eluent SDS-PAGE (Şekil 2) boyunca birbirine hemen bitişik çalıştırılır ki bütün test edilen düzenleme. SDS-PAGE takiben, PVDF veya nitroselüloz membrana transfer.

6. Blotting ve Hedef Protein Palmitoylation Algılama Batı

  1. Adım 5.6 tamamlandığında, membran yıkamaİki kez RT de sallanan bir platform üzerinde 10 dakika süreyle Salin (TBS 1x) Tris tamponlu.
  2. TBS 1x bir hacim içinde% 3 ağırlık elde etmek için, (BSA), Bovine Serum Albumin üzerinden tartı ile spesifik olmayan etiketleme engellemek için bir engelleme tampon hazırlanması + tamamen batırmak zar için yeterli olan Tween-20% 0.05 (TBS-T) . Streptavidin kurutma için, her zaman BSA ile bloke değil, süt tozu. Bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat için zar engelleme.
  3. TBS-T +% 0.3 BSA bir antikor çözeltisi hazırlayın. Streptavidin-HRP antikor ekleme 1:5,000-1:10,000 seyreltilmiş distile su içinde 1 mg / ml 'de sulandırılır. Bir kez adım 6.2 tamamlandıktan sonra, 10 dakika için TBS-T içinde bir kere zar yıkayın, sonra 4 ° C de bir gece oda sıcaklığında 1 saat için ya da için bir sallanan platform üzerinde Streptavidin antikor çözeltisi içinde inkübe zar, ya da
  4. Bir sallanan platform üzerinde 10 dakika için TBS-T içinde zar üç kez yıkayın. Palmitoylation sinyali tespit etmek için, bir kimya kullanılarak HRP parlaklık sergilemekiluminescent substrat kiti.
  5. Immunoprecipitated olan ilgili proteini miktarı ile palmitoylation düzeylerini normal etmek için, oda sıcaklığında bir sallanan platform üzerinde 5-10 dakika için western blot sıyırma tamponu kullanılarak membran şeridi. 6.4 aslında immünopresipitasyon için kullanılan ilgili proteini karşı birincil antikor kullanarak - adımlar 6.1 tekrarlayın.
  6. Görüntü analiz programı kullanılarak ilgilenilen proteinin palmitoylation ölçmek ve immunoprecipitated protein miktarı palmitoylation seviyelerini normale.

Representative Results

IP-ABE tahlil, özellikle alt tabaka boyunca proteinlerin sistein kalıntıları arasında tiyol-palmitoylation algılar, ve Şekil 1 'de gösterilen bir tarzda immunoprecipitated nöronal protein palmitoylation tespit etmek için de kullanılabilir. HAM (Şekil 1) ile immunoprecipitated nöronal protein işlenmesi daha sonra Western blotting kullanılarak tespit edilebilir yeni kullanılabilir tiol grubu, üzerine biyotin-BMCC spesifik birleşme sağlayan, palmitat ve bir sistein en tiol grubu arasındaki bağlantı tioester ayırır. Ham (eksi-HAM) bölünme ihmal biyotin-BMCC dahil edilmesi ve artı-HAM örnek spesifik Palmitoyl-biyotinilasyon için bir negatif kontrol olarak işlev önler ve bu nedenle, her zaman için batı artı-HAM örnek bitişik çalıştırılması gerekir SDS-PAGE (Şekil 2) tarafından blotting.

Optimize edilmiş bir deney (Şekil 2A), palmitoylation yılındanöronal protein δ-katenin 2'nin sinyal kolayca paralel eksi ve artı-HAM örnekleri karşı, HRP ile konjüge streptavidin, 1 uM 'lik bir konsantrasyon biyotin-BMCC için blotting ile tespit edilebilir. Δ p-katenin için spesifik palmitoylation sinyali sadece artı-HAM örnek olarak, 160kD onun tahmin boyutta görüntülenir. Bu sinyalin özgüllüğü başlangıçta öngörülen aynı boyutta iki HAM tedavilerinde bir sinyal ile sonuçlanan, bu immunoprecipitate için kullanılan spesifik antikor ile δ p-katenin için reprobing tarafından teyit edilmiştir. IP-ABE assay (Şekil 2A) optimizasyonu artı-HAM örnek kolayca ayırt edilebilir bir eksi-HAM örnek bir batı blot profili neden ve hiçbir palmitoylation sinyal minimal sergiler olacak.

Palmitoylated sissteinler etiketlemek için kullanılır biotin BMCC konsantrasyonu dikkatli optimizasyonu gerektirir, ve eğer bi süper doyurarak konsantrasyonuotin-BMCC ABE kimya adımda (Şekil 2B), aşırı arka plan ve özel olmayan sinyal sırasında kullanılan görünür olacaktır. Biotin-BMCC kullanılarak bir palmitoylated nöronal protein, α7 nikotinik asetilkolin reseptör biyotinilasyon için bir lineer tepki eğrisi önceden belirlenmiş 6, 5-10 uM bir konsantrasyonda komple doyma yakın göstermemektedir. Biotin-BMCC en uygun konsantrasyon hafifçe nöronal hedef protein bağlı olarak sapma olsa da, 5 uM aşan bir konsantrasyonda biyotin-BMCC ile tedavi edilmesi görünür bir arka plan ile western blot profil hedef protein, ve sonuç süper-doyurmak olacaktır ve spesifik olmayan sinyaller. Biotin-BMCC, 0.5 uM'lik bir konsantrasyon önceden SNAP-25, huntingtin, AMPA reseptör alt birimlerinin GluA1 ve GluA2, ve paralemmin 8, ve bir yeni için optimum konsantrasyonu belirlenmesi de dahil olmak üzere diğer nöronal protein palmitoylation tespit etmek için kullanılmıştırhedef protein burada tarif 0.5-5 uM aralığında başlangıç, deneme ve lineer olarak hata ile gerçekleştirilebilir. Farklı boyutlarda, bu uygunsuz biyotinilasyon meydana gösterir ilave arka plan sinyallerini 4 uM biyotin-BMCC (Şekil 2B) ile muamele zaman δ p-katenin için palmitoylation eksi ve artı-HAM örnekleri arasında oluşabilecek streptavidin western blot profilleri benzer görünür.

Hidroksilamin güçlü bir indirgen ajan tioester bağ, etkin bölünme ek olarak hedef proteinin sınırlı düşmesine yol açtığını göstermiştir. Sonuç olarak, ABE kimya optimizasyonu eksi ve artı-HAM numuneleri (- 3.3 adımlar 3.2) için kullanılan immunoprecipitated protein miktarı, normalize etmek için bir gerektirmektedir. Normalleştirme aslında ayırt edilemez Wester sonuçlanan artı-eksi-vs HAM örnek, immobilize hedef proteinin çift miktarda kullanımını gerektirir,n, δ-katenin (Şekil 2A, B) için gösterildiği gibi hedef protein için profiller blotting. Immobilize edilen hedef proteinin miktarı eksi ve artı-HAM örnekleri arasında normalize Bununla birlikte, eğer, artı-HAM örnek olarak hedef protein için sonuç western blot analizi δ p-katenin için gösterildiği gibi, kayıp olabilir, eşit miktarları Her iki protein HAM tedaviler (Şekil 2C) kullanılmıştır.

Palmitoylated proteinler etiketlenmesi için ABE kimya özgüllüğü çok hassastır ve optimizasyon gerektirir. IP-ABE tahlil sırasında karşılaşılan genel tuzaklar sub-optimal Şekiller 2B ve 2C gösterilen sonuçlar, ve tipik olarak büyük reaktifler ve tamponlar neden olduğu HAM tedavisi, ve hatalı pH'sinden bağımsız olan, hedef protein yıkımı içerir. Bu tuzaklardan kaçınmak ve alt-optimal ABE kimya düzeltmek için, reaktiflerin tazelik ve konsantrasyon için gerekliTablo 1'de listelenen tampon her zaman incelenmesi gerektiğini, ve tüm tampon pH düzenlemesi için her zaman, deneme öncesi kontrol edilmelidir.

Tampon Çalışma Konsantrasyon Yorumlar
Lizis Buffer (LB) 1% IGEPAL CA-630, 50 mM Tris-HCI, pH7.5 150mm NaCl,% 10 gliserol: damıtık H2O içinde N / A 4 de deney ve mağaza önce hazırlayın ° C
NEM Çözüm NEM liyofilize toz:% 100 EtOH içinde 2 M Kullanımdan hemen önce taze hazırlayın.
Sıkı Tampon 10 mM MEM% 0.1 SDS: libre N / A Kullanmadan önce kısa bir süre hazırlayın, buz üzerinde tutmak.
LB pH 7.2 LB: tam 7.2 PH ayarlama N / A Kullanımdan hemen önce pH'ı ayarlamak için bir pH metre kullanımı.
HAM Tampon Stok HAM çözüm: LB pH 7,2 olarak 1 M (nihai konsantrasyon HAM) Kullanımdan hemen önce hazırlanır.
LB pH 6.2 LB: tam 6.2 pH ayarlama N / A LB pH 7.2 ile aynı
Stok Biotin-BMCC Çözümü DMSO: 2.1 mg çözelti Biotin-BMCC 8 mM Kullanımdan hemen önce hazırlanır.
Biotin-BMCC Tampon LB pH 6.2 In: Biotin-BMCC çözümü ekle 1-5 uM (biyotin-BMCC nihai konsantrasyon) Kullanımdan hemen önce hazırlanır.
2x SDS Örnek Tamponu, hayır indirgeyici ajanlar % 5 SDS,% 5 gliserol 125mm, Tris-HCl, pH 6.8% 0.01 Bromophenol Blue damıtık H2O içinde N / A Kullanıma kadar -20 ° C'de deney ve mağaza önce hazırlayın. Kullanmadan önce 5 mM DTT ile tamamlayın.

Tablo 1. IP-ABE tahlil için gereken Tamponlar ve reaktifler. Lizis tampon çoğu Abe kimya başarılı olmasını sağlamak için bu deney, ancak pH kontrol edilmesi ve bir pH metre ile kullanımdan hemen önce ayarlanmış, başlamadan önce hazırlanabilir. Stok çözeltileri çoğunluğu, kullanımdan hemen önce, her deney için taze hazırlanmış olmalıdır. Arabellekleri çoğu biyokimya için donatılmış en laboratuvarları ortak reaktifler gerektirir ve satıcı bilgileri ile özel reaktifler reaktifler ve ekipman tabloda listelenmiştir.


Şekil 1. Nöronal protein palmitoylation arındırmak ve tespit etmek için immünopresipitasyon ve asil-Biotin Değişim (IP-ABE) tahlil şematik. Cultured hipokampal nöronlar lize edilir, (1) bir hedef protein daha sonra bir hedef özgü antikor kullanarak saflaştınldı ve Sefaroz üzerinde immobilize edilir, boncuklar saflaştırılmış hedef protein (2) daha sonra geri döndürülemez biçimde bağlanır ve değiştirilmemiş sistein (C) boyunca serbest tiyol (-SH) grupları bloke etmek N-ethylmaliemide (NEM) ile muamele edilir, protein G ya da A ile kaplanmıştır. Hedef protein daha sonra (3) palmitoylated sistein ve bir serbest palmitoylated tiol grubu (-SH) ve kuşkuya da tiyoester bağlarının belirli bir yarılma sonucunda, hidroksilamin (HAM) ile muameleye tabi tutulmuştur. Daha sonra, hedef protein (4) olup treatepalmitoylated sistein spesifik biyotinilasyon ile sonuçlanan bir tiol-reaktif biotin molekül, biyotin-BMCC, d. Son olarak, (5) biyotinile hedef protein elüt ve antikor ve boncuk kaldırılır. Biotin ile etiketlendi onun palmitoylated sistein (ler) ile hedef protein hemen SDS poli-akrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile saflaştırılmış nöronal protein palmitoylation için tespit etmek için streptavidin ile Western blot için uygundur. daha büyük bir şekil görüntülemek için .

Şekil 2,
Şekil 2. IP-ABE deneyi kullanılarak nöronal protein δ-katenin palmitoylation tespiti. Primer sıçan hipokampal nöronlar öncesi olarak yetiştirilmiştirdilmiş, 14DIV olgunluğa kadar 130 hücre / mm 2 'lik bir yoğunlukta, 5 tarif sonra lize edildi ve kısa bir süre önce tanımlanmış palmitoylated nöronal alt tabaka, δ-katenin 2 palmitoylation tespit etmek için IP-ABE tahlil tabi tutulmuştur. Saflaştırılmış (IP) δ-katenin (hedef protein) immunoprecipitates numune başına δ-katenin antikor 5 mikrogram (BD Transduction Laboratories) kullanılarak izole edildi ve daha sonra paralel eksi ve artı-hidroksilamin (HAM) SDS-PAGE tabi tutulmuştur örnekleri. Palmitoylation batı streptavidin-HRP (palmitoylation) ile (WB) blotting ile tespit edildi, ve membran sıyrılmış ve δ p-katenin için bir reprobe WB tabi tutuldu. IP örnekleri tiyol-palmitoylated proteinleri saptamak için Abe kimya özgüllüğü gösteren palmitoylated δ-katenin (ok başı) 1 uM biyotin-BMCC ile muamele edilmiş, (A) için optimize edilmiş bir temsili IP-ABE sonuçlanır. (B) Bir alt-optimal temsilher ikisi de eksi ve artı-HAM örnekleri (oklar) non-spesifik sinyaller ve arka edilen 4 uM biyotin-BMCC aşırı konsantrasyon kullanılmıştır δ P-katenin, temsilsici için IP-ABE sonuçlanır. (C) Biotin-BMCC aşırı 4 uM konsantrasyon kullanılmıştır δ P-katenin, ve ayrıca-HAM IP numune için kullanılan protein miktarı için bir başka alt optimum temsil eden IP-ABE WB HAM-aracılı için normalize edildi δ-katenin için reprobe WB kayıp bir sinyal ile sonuçlanan protein yıkımı,. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Burada sunulan IP-ABE tahlil çoğunlukla standart biyokimyasal teknikler kullanılarak, kültürlü primer hipokampal nöronlarda palmitoylated proteinleri tespit etmek için basit ve son derece hassas bir yöntemdir. Bu zaten batı blot malzemeleri ile donatılmış laboratuarlar için tahlil kolaylıkla adapte edilebilir. IP-ABE tahlil hızlı bir substrat protein palmitat düzeylerini tespit etmek için daha önce tarif ABE kimyası 2-4 ardından bir hedef protein izolatı ve hareketsiz bir standart immünopresipitasyon protokolü, birleştirir. ABE tekniği büyük ölçekli Palmitoyl-proteomik küresel palmitoylation profillerin tarama ve tek bir hedef proteinin palmitoylation düzeylerinin hızlı bir şekilde saptanması dahil olmak üzere, çeşitli doku ve hücre hatları palmitoylated proteinleri incelenmesi için çok geniş bir uygulama alanına sahiptir.

ABE kimya Önceki açıklamaları farklı yöntemler hücre parçalama ve nöronal prot deterjan ekstraksiyon faydalanmışeins 2, 9, serbest tiyol-blokaj 10, 11, biyotinilasyon, ve hedef protein 4 saflaştırılması, deney uygulamaya bağlı olarak değişebilir. Bir hedef proteinin palmitoylated fraksiyonu kendi hücre membranları karşı hedefleme ve tespit edilmesi de nöronal protein sonuçlar palmitat ve ayrıca bu örtüleri arasında çıkarma gerektirir. Daha önce anlatılan yöntemler ABE arzu edilen hedef proteinin elde etmek için iyonik 9 ve non-iyonik deterjanlar 8, çeşitli kullanılan, ve belli bir deterjan kullanılması hedef proteini ve bilinen zar ticareti bağlıdır. Burada, biz kullanmak non-denatüre ve non-iyonik deterjan IGEPAL CA-630 biz palmitoylated nöronal protein δ-katenin (Şekil 2) çıkarılması ve tespiti için geçerliliği palmitoylated proteinler, ayıklayın. IGEPAL CA-630 yapısı değil hantal ve katı olmayan kutup başını grup içeriryerli protein konformasyonu veya etkileşimleri bozabilir, ancak böylece onlara karışabilirliği görüşmekte ve onların çıkarma izin, membran-ilişkili proteinlerin hidrofobik bölgeleri ile ilişkisini sağlayan. Sinapsların sinaptik membran ya da post-sinaptik yoğunluğu lokalize birçok nöronal protein IGEPAL CA-630 ile elde edilmelidir, ancak bazı tamamen çözünür olmayabilir ve var Triton X-100 gibi farklı bir sigara denatüre deterjan kullanılması gerekebilir Daha önce ABE kimya, 2, 8 için kullanılmıştır.

ABE kimyanın çeşitli tanımları aynı zamanda protein saflaştırma 4 farklı araç gerektirmektedir Biotin-HPDP (Thermo Scientific) denilen burada tarif molekül, farklı bir tiyol-reaktif biyotinilasyon reaktifi faydalanmış. Biotin-HPDP yapısal d maliemide linker kolunda bir disülfid bağı içeren başka bir tiyol-reaktif, maliemide-konjuge biotin moleküldürbu disülfid bağı ihtiva etmez Biotin-BMCC, onu ifferentiating. Biotin-HPDP göre bir proteinin serbest ya da palmitoylated sisteinin tiol-biyotinilasyon ardından, hedef protein ve biotin grup ile sonuçlanan disülfid bağı biyotinilasyon yapma, biotin grup serbest bırakmak ve değiştirilmemiş haliyle protein yeniden üretmek için reaktifler azaltarak parçalanabilen Biotin-HPDP geçici ve geri dönüşümlü tarafından. Bu biyotinilasyon reaktif örneğin streptavidin kaplı boncuklar gibi hareketsiz avidin reaktifler, bir hedef proteinin saflaştırılması gerekir Bu nedenle, kullanım. Bununla birlikte, Biotin-BMCC ile bir hedef proteinin tiyol-biyotinilasyon, burada açıklandığı gibi, stabil ve nispeten kalıcı olup, bir antikor hedef karşı yönlendirilmiş ve Sepharose boncuklar üzerinde hareketsiz tutulan göre olan hedef proteinin saflaştırılması gerekir. Her iki ABE teknikler, daha önce büyük ölçekli ekranlar, ve tek proteinleri 2, 8-10, 12 palmitoylation tespiti için kullanılan, ve edilmiştirBurada tarif IP-ABE tahlil tek nöronal Hedef proteinlere palmitoylation hızlı tespiti için en uygunudur.

Hücresel palmitoylation ezici bir çoğunluğu, sistein ve tiyol grubu (biz bu protokolde 'palmitoylation' olarak genellemek S-palmitoylation, adlandırılır) için palmitat ve tersinir ek içerir, protein ancak çok sınırlı bir grup glisin de geri dönüşümsüz palmitoylation tabi tutulur ve istikrarlı bir amid bağı oluşumu yoluyla sistein artıkları, N-palmitoylation 13 olarak adlandırılır. Abe kimya bir sınırlama amid bağı kararlılık, N-palmitoylation sayesinde tespit yeteneksizliği ve böylece palmitoylation için yeni bir hedef proteinin tarama 3H-palmitat metabolik etiketleme 1 kullanılarak teyit edilmelidir.

Daha önce belirtildiği gibi, IP-ABE tahlil kolayca tran de dahil olmak üzere birden fazla kaynaktan gelen protein özleri de palmitoylation incelemek için adapte edilebilirheterolog hücre hatları, primer doku, ve çoklu beyin bölgelerinden primer nöronal kültürlerin sfected. IP-ABE tahlil, bazal koşullar altında 10 kültürü nöronlar sinaptik proteinlerin dinamik palmitat ciro incelenmesi için, bir hedef protein 8 boyunca bir palmitoylated sistein yerini belirlemek için mutasyona sistein-to-serin proteinlerin palmitoylation yeterliliğini incelemek için kullanılmıştır ve nöronal protein palmitoylation düzeylerindeki değişiklikleri nöronal aktivitenin 9 indüksiyonundan sonra. IP-ABE testinin duyarlılığı ve adaptasyon nöronal protein palmitoylation profilleri inceleyerek ve palmitoylation dinamik değişiklikleri tespit için optimal için ideal uygun hale.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Bu çalışma Sağlık Araştırma MOP-81.158 Kanada Enstitüleri ile hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
PMSF Fluka 93482
Protease Inhibitor Cocktail Roche Complete Mini 11 836 153 001
NEM Sigma E3876
HAM solution Sigma 46780-4
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 Ensure compatibility with chosen detergent
Protein G/A-coated sepharose beads GE Healthcare 17-6002-35
Biotin-BMCC Thermo Scientific 21900
Streptavidin-HRP Thermo Scientific 21126 Reconstitute at 1 mg/ml in water
Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).
  2. Kang, R., et al. Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation. Nature. 456, 904-909 (2008).
  3. Drisdel, R. C., Green, W. N. Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation. Biotechniques. 36, 276-285 (2004).
  4. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).
  5. Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium. Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).
  6. Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. Assays of protein palmitoylation. Methods. 40, 127-134 (2006).
  7. Eslami, A., Lujan, J. W. estern Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  8. Huang, K., et al. Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity. FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).
  9. Noritake, J., et al. Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95. J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).
  10. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  11. Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking. Neuron. 64, 213-226 (2009).
  12. Ho, G. P., et al. S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95. Neuron. 71, 131-141 (2011).
  13. Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling. Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).

Comments

7 Comments

  1. please ,what is the stringent buffer ? What reagents should I prepare?

    Reply
    Posted by: 李 î
    August 28, 2013 - 3:09 AM
  2. Hello,
    The stringent buffer is described in Table 1, 3rd buffer from the top. The description reads "In LB: 10 mM MEM 0.1% SDS," however there is typo and should read "In LB: 10mM NEM + 0.1% SDS." NEM refers to N-ethymaliemide, which we describe in the protocol. SDS refers to sodium dodecyl sulfate, a common laboratory reagent, and powerful ionic detergent. Add SDS to LB containing 10mM NEM to achieve a final concentration of 0.1% of the total volume. Perform the wash step (step 3.4) quickly, as we describe above, as the SDS could result in the removal of the target protein from the antibody-bead immunocomplex if incubated to long. Thank you for your interest in the our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    August 28, 2013 - 6:04 PM
  3. please,I want to kown that if my cell is suspended cells,what can I do about the Extraction of Target Protein ? especially,the amount of the LB+50mM NEM. THANK YOU!

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 2, 2013 - 2:22 AM
  4. Hello,
    The IP-ABE assay should work fine for a suspended cell culture. The section of the protocol pertaining to the harvesting and extraction (steps 1.1-1.8) of the target protein works in a manner similar to the extraction of any target protein for the purposes of immunoprecipitation. Begin by growing your cells to the confluence and density in suspension that you desire, and then simply spin down (e.g. 3000 x g/ 5 minutes) to collect the cells in a pellet. Next, simply re-suspend the cells in lysis buffer supplemented with 50mM NEM, and proceed with the remainder of the protocol as we describe. Some important considerations should be paid to your choice of detergent for extracting the target protein. We recommend the use of IGEPAL-CA 630, a non-ionic detergent suitable for the extraction of membrane-associated proteins, and which can extract palmitoylated fractions of neuronal proteins localized to synapses of cultured hippocampal neurons. Triton X-100 is a similar detergent, and is also highly utilized to extract palmitoylated proteins. We would not recommend using an ionic detergent (e.g. SDS), as this will denature the protein and may hinder the immunoprecipitation efficiency of your chosen antibody, and may degrade the palmitoylation signal. You will also want to choose an antibody suitable for immunoprecipitation of your target protein. We recommend that you refer to your lab's standard protocol for immunoprecipitating a target protein from suspended cell culture, and simply supplement your lysis buffer with 50mM NEM and proceed with the ABE assay as we describe. Please refer to the discussion section of our protocol for more information regarding choice of detergents. Thank you again for your interest in our protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 2, 2013 - 4:32 PM
  5. sorry ,I also confused about the Extraction of Target Protein of suspended cells, a problem is how do I control the amount of the LB+50mM NEM ? whether should I determine its amount based on the amount of my cells or refer your protocol to add 300μl ?

    Reply
    Posted by: 李 î
    September 3, 2013 - 3:14 AM
  6. Hello,
    I recommend that you determine the total volume of lysis buffer to use for harvesting according to the amount of cells you use as a starting point. As long as you maintain the concentration of 50mM NEM within your lysis buffer, the total volume can change depending upon your needs. The volume we used in the protocol was based upon harvesting protein from at least 3 wells of a standard 6-well dish containing hippocampal neurons, however I imagine you will want to adjust the volume you use for harvesting from suspended cells. In general, it is best to obtain a high total protein concentration within the lysis buffer, and so I recommend that you use the minimal volume of lysis buffer necessary to sufficiently extract your target protein. In my past experience working with adherent cell cultures and the IP-ABE assay, approximately 50-100uL of lysis buffer / 1.0 x 10^6 cells was sufficient for adequate protein extraction and achieving a high protein concentration. I suggest that you begin by determining the number of cells required for at least 500ug total protein / IP sample, and start with a smaller volume of lysis buffer (up to 500uL total, per sample). Once you spin down and pellet your suspended cells in a conical tube, you should be able to visualize an approximate volume that will suffice. We wish you the best of luck with the protocol.

    Reply
    Posted by: Stefano B.
    September 3, 2013 - 2:11 PM
  7. Hello,
    I tried the protocol with your protein as a positive control but I can't see any signal for palmitoylation. I noticed I used Protease Inhibitor Cocktail ultra which not contain EDTA compare to your. I used the 2x Laemmli Sample Buffer from Biorad (glycerol 20-35%, SDS 1-2.5%, water 50-100%) and I add DTT. Is this may be the reason it didn't work ?

    Reply
    Posted by: Nicolas P.
    September 25, 2016 - 12:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics