Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

In questo articolo, si descrive un metodo utile per lo studio ligando funzione di canale ionico in neuroni di fettine di cervello acuto isolato. Questo metodo comporta l'uso di un farmaco-riempita micropipetta per applicazione locale di farmaci per neuroni registrati utilizzando tecniche standard di patch clamp.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (68), e50034, doi:10.3791/50034 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

L'uso del tabacco porta a numerosi problemi di salute, tra cui il cancro, malattie cardiache, enfisema, e ictus. Dipendenza da fumo di sigaretta è un disturbo neuropsichiatrico prevalente che deriva dalle azioni biofisici e cellulari della nicotina sui recettori nicotinici (nAChR) in tutto il sistema nervoso centrale. Comprendere i vari sottotipi nAChR esistenti in aree cerebrali importanti per la dipendenza da nicotina è una delle principali priorità.

Esperimenti che impiegano tecniche elettrofisiologiche, come cellula intera o patch clamp a due elettrodi registrazioni voltage clamp sono utili per la caratterizzazione farmacologica dei nAChR di interesse. NAChRs cellule esprimenti, come cellule di mammifero o di coltura tissutale oociti di Xenopus laevis, sono fisicamente isolata e sono quindi facilmente studiato utilizzando gli strumenti della moderna farmacologia. Molti progressi sono stati fatti utilizzando queste tecniche, in particolare quando il recettore bersaglio era già noto unnd espressione ectopica è facile da realizzare. Spesso, tuttavia, è necessario studiare nAChR nel loro ambiente nativo: in neuroni in fettine cerebrali acutamente raccolti da topi o ratti di laboratorio. Ad esempio, i topi che esprime "ipersensibili" subunità nAChR come topi α4 L9'A 1 e topi α6 L9'S 2, consente l'identificazione univoca dei neuroni in base alla loro espressione funzionale di una subunità nAChR specifico. Sebbene cellule intere registrazioni di patch clamp da neuroni in fettine di cervello è fatto di solito dal elettrofisiologo esperto, è difficile da applicare localmente farmaci come acetilcolina o la nicotina alla cella di registrare, in una sezione del cervello. Diluizione dei farmaci nella superfusate (applicazione bagno) non è rapidamente reversibile, e U-tube sistemi non si adattano facilmente a lavorare con fettine di cervello.

In questo articolo, si descrive un metodo per la rapida applicazione di nAChR-attivazione farmaci neuroni registrati in pazienti adulti mOuse fettine di cervello. Standard di cellule intere registrazioni sono fatte da neuroni in fettine, e una micropipetta secondo riempito con un farmaco di interesse viene manovrata in posizione vicino alla cella registrata. Una iniezione di aria compressa o azoto inerte nella droga-riempita pipetta provoca una piccola quantità di soluzione di farmaco ad essere espulso dalla pipetta sulla cella registrata. Usando questo metodo, nAChR mediati correnti possono essere risolti con precisione millisecondo. Tempi di applicazione del farmaco può essere facilmente variata, e il farmaco-riempita pipetta può essere retratto e sostituita con una nuova pipetta, consentendo curve concentrazione-risposta per la creazione di un singolo neurone. Sebbene descritta nel contesto di nAChR neurobiologia, questa tecnica dovrebbe essere utile per studiare molti tipi di ligando canali ionici o recettori nei neuroni da fettine cerebrali.

Protocol

1. Preparazione di soluzioni per la preparazione del cervello Slice ed Elettrofisiologia

  1. Soluzioni per la preparazione di fette di cervello precedentemente descritte 3, 4. Preparare N-metil-D glucammina (NMDG) basata taglio e soluzione di recupero della seguente composizione (in mM): 93 N-metil-D glucammina, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 glucosio, 5 Na + ascorbato, tiourea 2, 3 Na piruvato +, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Portare a 300-310 mOsm con NMDG. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 10 N HCl.
    1. Sciogliere MgSO 4 • 7H 2 O e CaCl 2 • 2H 2 O in acqua Millipore per fare 2 soluzioni madre M di ciascuno.
    2. Pesare gli altri componenti nella sequenza indicata e aggiungere in un matraccio tarato parzialmente riempito con acqua Millipore e mescolare per sciogliere. Una volta che tutto è aggiunto, riempirepallone tarato con acqua Millipore.
    3. Misurare il pH e regolare con HCl 10 N.
    4. Misurare l'osmolarità e regolare con NMDG se necessario.
  2. Preparare HEPES titolari fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) della seguente composizione (in mM): NaCl 92, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20, 25 HEPES glucosio, 5 Na ascorbato + 2, tiourea, 3 Na + piruvato, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Portare a 300-310 mOsm con saccarosio. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 1 N HCl o NaOH.
    1. Pesare i componenti nella sequenza indicata e aggiungere in un matraccio tarato parzialmente riempito con acqua Millipore e mescolare per sciogliere. Una volta che tutto è aggiunto, riempire pallone tarato con acqua Millipore.
    2. Misurare il pH e regolare con NaOH o HCl, se necessario.
    3. Misurare l'osmolarità e regolare con saccarosio, se necessario.
  3. Preparare la soluzione standard di registrazione aCSF della seguente composizione (in mM): 124 NaCl, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, glucosio 12,5, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Portare a 300-310 mOsm con saccarosio. Regolare il pH a 7,3-7,4 con 1 N HCl o NaOH.

2. Preparazione di fette cerebrale acuto

  1. Slice taglio cervello e recupero vengono eseguiti come precedentemente descritto 3, 4. Bubble due piatti di cristallo pieno di NMDG soluzione di ripristino con il 95% di ossigeno / 5% di CO 2 gas (CarboGen), un piatto sul ghiaccio, l'altra a 33 ° C.
  2. Bubble un piatto di cristallo pieno di HEPES tengono aCSF con CarboGen a temperatura ambiente.
  3. Anestetizzare topo adulto (dai 2 ai 12 mesi) con Na + pentobarbital (200 mg / kg, ip). Procedere con procedura quando l'animale non ha alcuna risposta ad un dito del piede-pizzico.
  4. Se necessario, tagliare un campione di tessuto per la successiva coda Genotypzione dell'animale.
  5. Aprire la cavità toracica, esporre il cuore, e bloccare l'aorta discendente. Lacerano l'atrio destro.
  6. Transcardiaca perfusione animale con 5-10 ml di 0-4 ° C NMDG soluzione di ripristino.
  7. Decapitare animale, rimuovere il cervello e posizionarlo in 4 ° C NMDG soluzione di ripristino per 1 min.
  8. Su una pista fredda lastra di metallo, tagliare il cervello con l'orientamento desiderato (coronale, parasagittale, orizzontale, ecc) per includere l'area di interesse.
  9. Fissare il blocco cervello con colla sulla superficie stadio secco di un filtro vibrante (DSK-Zero 1, Dosaka), immergere il blocco cervello in 4 ° C NMDG soluzione di ripristino, e continuamente bolla la soluzione con CarboGen.
  10. Tagliare fette della zona cerebrale di interesse. Spessore della fetta è 200-400 micron, a seconda della zona del cervello specifico di interesse, età degli animali, e esperimento da eseguire.
  11. Subito dopo il taglio, fette incubare desiderati in carbogenated, 33 ° C NMDG recupero soluzione moltosu per esattamente 12 minuti, poi il trasferimento a HEPES camera carbogenated, temperatura di mantenimento soluzione per un periodo iniziale di 60 min. Dopo questa incubazione 60 min, fette può essere utilizzato per la registrazione. Fette sono mantenute in HEPES tengono soluzione tutto il giorno fino al loro impiego per la registrazione.

3. Registrazione Patch Clamp di neuroni in fettine di cervello

  1. Tirare una micropipetta standard di patch con una programmabile Flaming-Brown estrattore (Sutter P-97 o equivalente estrattore verticale). Pipette ottimali per giga-ohm formazione tenuta in genere hanno una resistenza di 4-6 MW
  2. Trasferire una fetta alla camera di registrazione (RC-27L; Instruments Warner), sul palco di un microscopio in posizione verticale (Nikon FN-1). Continua superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) la fetta con carbogenated, registrazione aCSF serie riscaldata e mantenuta a 32 ° C. In alternativa, fette può essere mantenuto a temperatura ambiente.
  3. Individuare e centro l'area del cervello di interesse utilizzandoun obiettivo aria 10 volte (Nikon Plan Fluor 10X, NA 0.3; WD: 16 mm).
  4. Visualizza singoli neuroni con un 40X nel vicino infrarosso (IR) Obiettivo immersione in acqua (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) collegato ad IR-differenziale contrasto interferenziale (DIC) e ottiche ad alta velocità vicino infrarosso Charged Coupled Device (CCD) telecamera (Hamamatsu C-7500). In IR-DIC osservazione, neuroni sani presentano una superficie liscia, di colore grigio chiaro membrana plasmatica.
  5. Riempire una micropipetta con una soluzione adeguata registrazione intracellulare. Per la maggior parte delle applicazioni, si usa la seguente soluzione (in mM): 135 gluconato di potassio, EGTA 5, CaCl 2 0,5, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP e 0,1 (pH regolato a 7,25 con Tris base, osmolarità regolato a 290 mOsm con saccarosio). Stabilire una cellula intera registrazione da un neurone visualizzato.

4. Applicazione locale di farmaci ai neuroni a fette

  1. Tirare uno standard micropipetta patch clamp come descritto sopra. Utilizzoun estrattore pipetta come un Sutter P-97 che produce due identici "sorelle" consigli dai lo stesso pezzo di vetro è vantaggioso quando soluzioni farmacologiche multiple devono essere utilizzati sulla stessa cella. Suggerimento dimensioni che potrebbero avere una resistenza di ~ 5 MW se sono stati riempiti con la soluzione intracellulare sopra descritta sono ottimali.
  2. Backfill la micropipetta con una soluzione diluita di farmaco in carbogenated, aCSF registrazione standard. Puntare la punta verso il basso, e aspirare il farmaco pieno micropipetta per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate nella colonna di soluzione.
  3. Montare il farmaco in una micropipetta riempita portapipette collegata con la tubazione di un adeguato sistema di espulsione a pressione, ad esempio un Picospritzer III (General Valve Co.). Il titolare pipetta deve essere montato su un micromanipolatore con la stessa risoluzione manipolatori comunemente utilizzato per la registrazione di patch clamp (per esempio, Sutter MP-285). Inoltre, il manipolatore deve consentire movimento diagonale e verso la fetta. Uomomanualmente espellere pressione 3 a 4 volte nella micropipetta per costruire un'adeguata pressione dietro la colonna di fluido.
  4. Utilizzando i controlli micromanipolatore, abbassare la pipetta farmaco nel fetta mentre visualizzi la punta sotto IR-DIC ottica. Idealmente, si dovrebbe identificare visivamente e centro un neurone da registrare da, seguito dal posizionamento della pipetta farmaco vicino alla cella prima di abbassare la micropipetta registrazione nella sezione. Posizionare la pipetta farmaco può causare il movimento del tessuto in prossimità della cella registrata che potrebbe disturbare la registrazione se il farmaco pipetta viene spostata in posizione dopo aver stabilito un sigillo gigaohm.
  5. Utilizzando video IR, posizionare la micropipetta farmaco alla superficie superiore della fetta tessuto. Eseguire una espulsione di pressione e monitor 1) prossimità della punta per il movimento dei detriti legata alla espulsione, e 2) la punta micropipetta per qualsiasi segno che la punta sia ostruiti o bloccati. Se la punta è bloccato / intasato, ritrarre il pipettE e sostituirlo con uno nuovo.
  6. Avvicinare la cella registrata diagonalmente dall'alto della fetta tale che quando in posizione finale, la punta della pipetta farmaco-riempita è 1) nello stesso piano focale (o leggermente inferiore) come cella registrata e la punta dell'elettrodo di registrazione , e 2) 10 a 40 um dalla cella registrata. Se il farmaco-riempita puntale è sopra la cella registrata, la forza di espulsione dalla pressione potrebbe compromettere la tenuta gigaohm.
  7. Registrare la risposta cellulare desiderata tenendo la cella in modalità voltage clamp o modalità morsetto corrente. Abbiamo regolarmente registrare acetilcolina e / o nicotina suscitato correnti cellulari tenendo neuroni in modalità voltage clamp. Anche se la pressione di espulsione può essere attivato manualmente utilizzando un Picospritzer III, per risultati più riproducibili si consiglia di attivare l'espulsione pressione utilizzando il sistema di acquisizione (Axon Digidata 1440 e pClamp 10.3) con un TTL impulsi digitali.

5. ControlloDrug-riempita Micropipetta ad un traduttore piezoelettrico

  1. Se possibile, montare il farmaco-riempita portapipette ad un traduttore monodimensionale piezoelettrico (es Piezojena PA-100 o Burleigh PZM-150) che è in grado di accettare un ingresso analogico di tensione (di nuovo, dal sistema di acquisizione), che è poi montato sul micromanipolatore alta precisione (Sutter MP-285). Un traduttore piezoelettrico è utile perché il movimento del farmaco-riempita pipetta dentro e fuori della fetta, inclusi i tempi e la velocità di entrata / uscita, possono essere più facilmente controllata e riprodotto da esperimento a esperimento. Quando si studia nAChR, gli effetti di desensibilizzazione perdite nicotina dal farmaco-riempita pipetta, se mai verificarsi, vengono minimizzati quando la pipetta viene spostata solo vicino alla cella con un traduttore piezoelettrico per il momento della pressione di espulsione.
  2. Con il potenziometro a controllo manuale dell'amplificatore piezoelettrico controllo della tensione, selezionare la tensioneal suo valore massimo.
  3. Utilizzando la, posizione micromanipolatore farmaco-riempita pipetta nella fetta dove la pipetta viene espulso il contenuto nella cella registrata, e ritrarre la pipetta manualmente riducendo la tensione a zero dell'amplificatore piezoelettrico controllo di tensione.
  4. Utilizzando un segnale di uscita analogico dal sistema di acquisizione di registrazione, spostare il farmaco-riempita pipetta nella fetta su un periodo di 250 msec 300 msec prima di iniziare la pressione di espulsione impulsi TTL verifica. Ritrarre la pipetta in un periodo di 250 msec, iniziando a 50 msec dopo l'impulso TTL termina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nei nostri esperimenti, abbiamo regolarmente registrare da dopamina (DA) alla produzione di neuroni dell'area ventrale tegmentale (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNC). In voltage-clamp modalità di applicazione di pressione di acetilcolina o nicotina a queste cellule in genere come risultato un rapido, corrente catione attivo che raggiunge picco entro 100-200 msec (Figura 1A-B). Decadimento della corrente in larga misura dalla diffusione del farmaco dal sito di azione, e se enzimi nella fetta presenza di metabolizzare il farmaco in una forma inattiva. Per esempio, ACh viene rapidamente idrolizzata mediante acetilcolinesterasi che si trovano sulla superficie delle cellule in aree del cervello che sono ricche di neuroni DA 5. Ciò provoca un rapido decadimento della corrente evocata (Figura 1A). Al contrario, la nicotina non è idrolizzato e nicotina-evocati correnti non decadono più rapidamente ACh-evocato correnti (Figura 1B), che le consente di Activ fortementemangiato e desensibilizzare nAChR 6.

Sistemi di espulsione a pressione consentono all'operatore di variare il tempo dell'impulso di pressione. Questa caratteristica è utile per studiare nAChR sulla superficie dei neuroni all'interno fette di cervello, in quanto consente al ricercatore di determinare se la corrente massima evocata è stato raggiunto in risposta ad un impulso di farmaco. Ad esempio, le due tracce in figura 2 mostrano che 250 msec di applicazione della droga (grigio traccia) può o non può rivelare una definitiva massima evocata corrente, mentre 1.000 msec di applicazione della droga (traccia nera) produce un massima netta corrente e un po 'di costante -stato di desensibilizzazione. La soluzione di questi "picco" delle correnti è fondamentale per la costruzione di un accurato curva concentrazione-risposta, o quando si studia desensibilizzazione nAChR.

Neuroni DA nel mesencefalo ventrale spesso potenziali d'azione spontanei, quando vengono registrati all'interno di sezioni di cervello acuto 7, 8. α6 L9'S topi, che expremere nAChRs che rispondono fortemente a concentrazioni inferiori 10 a 100 volte di nicotina o ACh 2, 9-11, esporre locomozione aumenta in risposta alla nicotina iniezioni. Correlare l'attività neuronale (potenziale di azione cottura) con comportamento, è utile applicare alla nicotina α6 L9'S neuroni DA registrati in current-clamp mode. Tipicamente, l'applicazione locale di nicotina (1 pM) per α6 L9'S neuroni DA comporterà un'accelerazione rapido e transitorio di cottura che decade ritorna al basale entro 30-40 sec 2 (figura 3, pannello superiore). Tali risposte alla nicotina sono facilmente quantificabile (Figura 3, riquadro inferiore) con software di analisi appropriato (ad es pClamp; Molecular Devices Corp.).

Esperimenti in cellule coltivate o oociti di Xenopus con nAChRs ectopicamente espresse godere il vantaggio che una serie di concentrazioni di farmaco può essere applicato a ciascuna cella registrata 12. Inneuroni in fettine cerebrali, tipicamente una curva concentrazione-risposta non è possibile, e risposte a una singola concentrazione di farmaco sono spesso riportati 1. Tuttavia, un farmaco-riempita pipetta come descritto in questo documento può essere ripetutamente modificato per consentire concentrazioni multiple di farmaco da applicare alla stessa cella registrata in una slice cervello 2, 8, 13, 14. Figura 4 mostra i dati rappresentativi di una singolo neurone DA registrato che è stato stimolato con tre concentrazioni di ACh. Esperienza del ricercatore, combinata con un micromanipolatore altamente stabile che tiene il farmaco-riempita pipetta, sono fattori critici che determinano il successo in questo tipo di esperimento. Quando ha successo, questo approccio fornisce preziose informazioni su farmacologica nAChR nativi.

I neuroni in fettine di cervello, tra cui diversi tipi di cellule non caratterizzate o quelle presenti in aree del cervello con una popolazione eterogenea, sono spesso classificati utilizzando vari elementi di basectrophysiological misure e / o morfologico 15. Ad esempio, l'espressione della corrente I h, potenziale di membrana, tasso di scarica spontanea, e la dimensione della cella sono misure tipici usati per caratterizzare i neuroni DA 2, 7, 8, 16, 17. Utilizzando il nostro metodo, è anche possibile caratterizzare i neuroni in base alla loro risposta alla nicotina localmente applicata o ACh 18, 19. Per esempio, il collicolo superiore (SC) è un'area del cervello eterogenea e relativamente non caratterizzate con espressione estremamente elevato di nAChR vari, compresi quelli che contengono α6 subunità 20. In fettine di cervello di topi α6 L9'S, abbiamo registrato da diversi neuroni SC e la nicotina applicata (1 mM) con espulsione a pressione con un pieno di nicotina pipetta. Due tipi di risposta distinti sono stati osservati: 1) l'attivazione di correnti inibitorie postsinaptiche (iPSCs) (Figura 5, le risposte di tipo I), e 2) grandi correnti di cationi verso l'interno con un po 'induttivosu di eccitatori correnti postsinaptiche (EPSCs) (Figura 5, le risposte di tipo II).

L'utilizzo di un traduttore piezoelettrico offre il vantaggio che il farmaco-riempita pipetta può essere tenuto in una posizione stazionaria ad almeno 100 micron dalla cella registrata finché non viene rapidamente spostata adiacente alla cella per l'espulsione di pressione. Questo è utile perché il movimento pipetta può essere automatizzato ed è coerente da cellula a cellula e il giorno per giorno. E 'utile anche quando alte concentrazioni di nicotina (che desensibilizzare nAChR) vengono applicate alla cella registrata, in quanto minimizza l'effetto di dispersione nicotina dal farmaco-riempita pipetta dovrebbe mai verificarsi. Per dimostrare la consistenza delle correnti nAChR quando si utilizza un traduttore piezoelettrico, abbiamo registrato dal VTA neuroni DA in fettine di cervello di topi α6 L9'S. Figura 6 mostra le risposte consecutive nella stessa α6 L9'S VTA DA neurone in risposta a concentrazioni di nicotine che fortemente attivare ipersensibili α6 * nAChR (1 pM: Figura 6A; 10 pM: Figura 6B). Se permesso di fuoriuscire continuamente sulla cella registrata, queste concentrazioni di nicotina ci si aspetterebbe per desensibilizzare nAChR sulla superficie cellulare, e la seconda risposta sarebbe attenuato rispetto alla prima risposta.

Figura 1
Figura 1. Risposte nAChR di rappresentanza in neuroni DA. A. Un neurone DA in una fetta WT cervello di topo era tensione serrato, seguito da applicazione locale di ACh (100 pM) tramite la pressione di eiezione (250 msec) utilizzando un secondo farmaco-riempita pipetta. Scala bar: 100 pA, 3 sec B.. Esperimento è stato eseguito come descritto in A, tranne che la nicotina (100 mM) è stato applicato al neurone DA. Scala bar: 60 pA, 3 sec.


Figura 2. Risolvere correnti di picco in base al tempo di droga un'applicazione disomogenea. Un neurone DA in una fetta WT cervello di topo era tensione serrato, seguito da applicazione locale di ACh (100 pM). Due risposte sono mostrati per la stessa cella registrata, dove è stato espulso ACh dal farmaco-riempita pipetta per 250 msec (grigio traccia) o 1000 msec (traccia nera). Scala bar: 50 pA.

Figura 3
Figura 3. Studiare potenziale d'azione di tiro dopo l'applicazione locale di droga. Un neurone DA in una fetta del mouse L9 α6'S cervello è stato registrato in Pinza di corrente (I = 0), il modo e potenziali d'azione spontanei sono stati osservati. Nicotina (1 mM) è stato applicato utilizzando espulsione di pressione (250 msec), e le variazioni di potenziale d'azione di tiro velocità e il potenziale di membrana a riposo eranoosservato. Utilizzando software pClamp (ricerca soglia), frequenza di attivazione istantanea stato derivato ed è mostrato nel pannello inferiore.

Figura 4
Figura 4. Applicazioni farmacologiche multiple alla stessa cella registrata. Un neurone DA in una fetta del mouse L9 α6'S cervello è stato registrato in modalità voltage-clamp. Un farmaco-riempita pipetta stato usato per applicare localmente ACh (1 pM, 250 msec). Pur continuando a registrare dalla cella, il farmaco-riempita pipetta è stata ritirata dalla fetta e sostituita con un'altra pipetta riempita con 3 pM ACh. Una risposta a ACh 3 pM è stato registrato, e il processo è stato ripetuto per 10 pM ACh. Scala bar: 100 pA, 1,5 sec.

Figura 5
Figura 5. Classificazione dei neuroni per tipo di risposta nAChR.Un gruppo di collicolo superiore (SC) neuroni in una fetta α6 L9'S cervello di topo furono tensione serrato, seguito da applicazione locale di nicotina (1 pM) tramite la pressione di espulsione. Di tipo I neuroni esposti iPSCs aumento dopo l'applicazione della nicotina. Di tipo II neuroni esposti grandi correnti attivo e EPSCs aumento in risposta alla domanda di nicotina. Scala bar: 20 pA, 3 sec.

Figura 6
Figura 6. Traduttore piezoelettrico offre la coerenza e la protegge dalle perdite di droga. A. Un VTA DA neurone in una fetta cervello da topo un L9 α6 è stato registrato in modalità morsetto di tensione durante l'applicazione di 1 nicotina pM. La nicotina-riempita pipetta è stata manovrata in posizione finale prima della pressione di espulsione e retratta dopo l'espulsione usando un traduttore piezoelettrico. Una seconda risposta è stata registrata 2 min dopo la fiRST di dimostrare che non si era verificato nAChR desensibilizzazione. Scala bar: 100 pA, 8 sec B.. risposte nAChR in α6 L9'S VTA neuroni DA sono stati registrati come in A, ma il 10 uM nicotina è stato applicato. Scala bar: 100 pA, 8 sec.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il metodo presentato in questo articolo è ampiamente utile per studiare ligando funzione di canale ionico nella preparazione fetta del cervello. Tuttavia, ci sono un certo numero di fattori che influenzano significativamente la qualità e la riproducibilità dei dati sperimentali che derivano da utilizzando questo metodo. Per esempio, le correnti evocate sono molto sensibili al diametro della punta della pipetta farmaco-riempita. Piccoli consigli causerà difficoltà con espulsione della soluzione di farmaco, e le punte di grandi dimensioni con bassa resistenza saranno più probabilità di interrompere la tenuta gigaohm tra la cella registrato e l'elettrodo di registrazione. Un altro limite del metodo presentato è che le cellule entro 10 um della cella registrata può essere esposto a farmaci dal farmaco-riempita pipetta, che possono aumentare la loro attività e potrebbe potenzialmente influenzare la cella registrata.

Quando si applica farmaco ad una cella più volte con la pipetta stesso farmaco, è fondamentale che la pipetta essere restituitoesattamente la stessa posizione nella fetta per ogni applicazione. Anche le piccole deviazioni (ad esempio 1-2 micron) in posizione da una risposta alla prossima spesso si traducono in differenze sostanziali nella risposta di picco osservato. Un traduttore piezoelettrico programmabile (come descritto sopra) o micromanipolatore robotico è vantaggioso per il posizionamento della pipetta farmaco. Un'altra considerazione chiave è la profondità della cella registrata all'interno della slice. Drug spesso disperderebbe da una cella sulla superficie della fetta più rapidamente, mentre farmaco può essere "intrappolato" all'interno della slice quando viene espulsa su una cella che si trova in profondità all'interno della slice. Questo è spesso un fattore chiave quando si applica la nicotina, che desensibilizza rapidamente nAChR quando i tempi di esposizione sono più di 100-200 msec. Analogamente, la pressione (in psi) che viene espulso nella droga-riempita pipetta e la quantità di tempo che la pressione viene applicata (Figura 2) sono considerazioni importanti per interpretare nAChR corrente data. Noi abitualmente uso 10-12 psi di pressione, e si trova che 250 msec è tempo sufficiente per risolvere correnti di picco nAChR senza causare desensibilizzazione vasta recettore.

Uno dei principali vantaggi del metodo descriviamo è la capacità di scambio di droga pieni di consigli pipette in modo che le concentrazioni farmacologiche multiple possono essere applicate allo stesso neurone. Le considerazioni principali quando pipette scambio sono: 1) variazione della posizione della punta della pipetta da una concentrazione a quella successiva, e 2) la variabilità del diametro di punta della pipetta. Pipettare posizione della punta in genere può essere adeguatamente controllata con una ad alta risoluzione vicino IR videocamera e un micromanipolatore precisa. Variabilità diametro punta della pipetta può essere controllato utilizzando pipette "sorelle" quando possibile, e utilizzando un estrattore pipetta che tira micropipette con un alto grado di precisione e coerenza.

Nel complesso, il farmaco pieno di pipetta metodo descritto in questo articolo è un approccio molto utile quando studying nAChR nativi espressi nei neuroni trovati in fettine cerebrali acute. Oltre ad essere utile per studiare la neurobiologia della dipendenza da nicotina e biologia nicotinico colinergico, questo metodo è facilmente applicabile ad altri ligando canali ionici. 5-HT 3, i recettori GABA A recettori e recettori glicina sono alcuni degli altri "cis-loop" recettori che possono essere studiati utilizzando queste tecniche 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) sovvenzione DA030396. Grazie ai membri del laboratorio Drenan di discussione utile e critica del manoscritto. Un ringraziamento speciale a Kim Mi Ran per l'assistenza tecnica e Jonathan Thomas Ting per avere consigli relativi adulti fettine di cervello di topo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-Methyl D-glucamine Sigma M2004
KCl Sigma P3911
NaH2PO4 Sigma S9638
NaHCO3 Sigma S6014
HEPES Sigma H3375
glucose Sigma G5767
Na+ ascorbate Sigma A4034
thiourea Sigma T8656
Na+ pyruvate Sigma P2256
MgSO4∙7H2O Sigma 230391
CaCl2∙2H20 Sigma 223506
NaCl Sigma S9625
Na+ pentobarbital Vortech Pharmaceuticals 76351315
potassium gluconate Sigma G4500
EGTA Sigma E3889
Mg-ATP Sigma A9187
GTP Sigma G8877
DSK-Zero 1 Vibrating slicer Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming/Brown micropipette puller Sutter
RC-27 Recording chamber Warner
TC-344B Perfusion heater controller Warner 640101
SH-27B Solution heater Warner 640102
Nikon FN-1 Nikon
C-7500 CCD Video camera Hamamatsu
Picospritzer III General Valve Co.
MP-285 Micromanipulator Sutter
PA-100 Piez–lectric translator piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplifier piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B Molecular Devices Corp.
Digidata 1440A Molecular Devices Corp.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
  2. Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensitized, high-affinity ?6* nicotinic acetylcholine receptors. Neuron. 60, 123-136 (2008).
  3. Zhao, S. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-7452 (2011).
  4. Peca, J. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472, 437-442 (2011).
  5. Zhou, F. M., Wilson, C. J., Dani, J. A. Cholinergic interneuron characteristics and nicotinic properties in the striatum. J. Neurobiol. 53, 590-605 (2002).
  6. Pidoplichko, V. I. Nicotine activates and desensitizes midbrain dopamine neurons. Nature. 390, 401-404 (1997).
  7. Nashmi, R. Chronic nicotine cell specifically upregulates functional ?4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path. J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).
  8. Xiao, C. Chronic nicotine selectively enhances ?4?2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. J. Neurosci. 29, 12428-12439 (2009).
  9. Cohen, B. N. Nicotinic cholinergic mechanisms causing elevated dopamine release and abnormal locomotor behavior. Neuroscience. 200, 31-41 (2012).
  10. Drenan, R. M. Cholinergic modulation of locomotion and striatal dopamine release is mediated by α6β4* nicotinic acetylcholine receptors. J. Neurosci. 30, 9877-9889 (2010).
  11. Grady, S. R. Structural differences determine the relative selectivity of nicotinic compounds for native α4β2*-, α6β2*-, α3β4*- and α7-nicotine acetylcholine receptors. Neuropharmacology. 58, 1054-1066 (2010).
  12. Drenan, R. M. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled α6 and β3 subunits. Mol. Pharmacol. 73, 27-41 (2008).
  13. Keath, J. R. Differential modulation by nicotine of substantia nigra versus ventral tegmental area dopamine neurons. J. Neurophysiol. 98, 3388-3396 (2007).
  14. Mansvelder, H. D. Bupropion inhibits the cellular effects of nicotine in the ventral tegmental area. Biochem. Pharmacol. 74, 1283-1291 (2007).
  15. Lee, S. The largest group of superficial neocortical GABAergic interneurons expresses ionotropic serotonin receptors. J. Neurosci. 30, 16796-16808 (2010).
  16. Margolis, E. B. Reliability in the identification of midbrain dopamine neurons. PLoS One. 5, e15222 (2010).
  17. Margolis, E. B. The ventral tegmental area revisited: is there an electrophysiological marker for dopaminergic neurons. J. Physiol. 577 (Pt 3), 907-924 (2006).
  18. Couey, J. J. Distributed network actions by nicotine increase the threshold for spike-timing-dependent plasticity in prefrontal cortex. Neuron. 54, 73-87 (2007).
  19. Yang, K. Distinctive nicotinic acetylcholine receptor functional phenotypes of rat ventral tegmental area dopaminergic neurons. J. Physiol. 587, 345-361 (2009).
  20. Endo, T. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes involved in facilitation of GABAergic inhibition in mouse superficial superior colliculus. J. Neurophysiol. 94, 3893-3902 (2005).
  21. Bouzat, C. New insights into the structural bases of activation of Cys-loop receptors. J. Physiol. Paris. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics