액체 셀 전송 전자 현미경을 사용하여 액체의 재료의 동적 프로세스를 공개

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Summary

우리는 전송 전자 현미경을 사용하여 액체를 통해 영상을 수있는 독립적 인 액체 전지를 개발했습니다. 액체의 나노 입자의 동적 프로세스는 하위 나노 미터 해상도 실시간으로 공개 할 수 있습니다.

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Niu, K. Y., Liao, H. G., Zheng, H. Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (70), e50122, doi:10.3791/50122 (2012).

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Abstract

높은 공간 해상도를 가진 액체를 통해 이미지를 허용 원위치 전송 전자 현미경,에 대한 최근의 개발은 재료 과학, 물리학, 화학 및 생물학 연구 분야에서 큰 관심을 끌고있다. 키 활성화 기술은 액체 셀입니다. 우리는 정기적으로 TEM 그리드의 크기와 액체 셀 표준 TEM 샘플 홀더에 끼워 넣을 수 실리콘 나이트 라이드 막 증착, photolithographic 패턴, 웨이퍼 에칭, 세포 접합 등, 연속 microfabrication 과정을 통해 얇은 볼 수있는 창문이있는 액체 전지를 제조 . 100 nanoliters 반응 솔루션은 저수지에로드되어 약 30 picoliters 액체는 모세관 힘에 의해 볼 창문에 그려집니다. 그 후, 세포는 현장 영상에 대한 현미경에 가둔 후로드됩니다. TEM 내부, 전자 빔은 두 실리콘 질화물 멤브레인 사이에 끼어 얇은 액체 층을 통해 간다. 동적 proc이러한 핵 및 nanocrystals, 확산 및 나노 입자 등의 조립의 성장과 같은 액체에 나노 입자의 esses은, 서브 나노 미터 해상도로 실시간으로 이미지로되어 있습니다. 우리는 또한 다른 연구 분야, 예를 들어, 물에 이미징 단백질에이 방법을 적용했습니다. 액체 셀 TEM들은 작업 환경에서 재료의 동적 프로세스를 드러내 중요한 역할을 태세입니다. 또한 자신의 네이티브 환경에서 생물학적 과정의 연구에 높은 영향을 가져 수 있습니다.

Introduction

자신의 모국어 환경에서 실시간 영상 생물학적 자료에 액체의 화학 반응의 연구는 연구 분야 1-5에서 상당한 이익을했습니다. 전송 전자 현미경 (TEM), TEM을 사용하여 액체를 통해 영상의 높은 공간 해상도로 인해 4,5 많은 관심을 끌고있다. 기존의 현미경은 높은 진공 환경에서 운영되어 있기 때문에 그러나, TEM을 사용하여 이미지를 액체 샘플에 큰 도전이되었습니다. 또한, 액체 샘플 전자 빔이 통과 할 수 있도록 할 수있을만큼 얇고 할 수 있습니다. 윌리엄슨 외. 6 잘라 내기의 전기 증착의 이미지가 TEM에서 운영 전기 액체 전지를 사용하여 5 나노 미터 해상도로 달성 할 수 있다고보고했다. 드 Jonge 외. 1 스캐닝 (S) TEM을 사용하여 serveral 마이크로 미터 두께의 물을 통해 이미지 생물학적 샘플을 수있었습니다. 생물학적 샘플의 낮은 대비 아니었다금 나노 입자가 이미지에 대한 마커로 사용 된 이후 문제로 올렸다. 줄기 이미징 모드가 사용되었고 나노 미터 해상도가 달성 된 이후 두꺼운 액체 샘플에는 문제가 아니 었습니다. 우리는 최근 subnanometer 해상도 5,7와 액체에서 콜로이드 나노 입자의 실시간 TEM 영상을 수있는 독립적 인 액체 전지를 개발했습니다. 개선 해상도와 빠른 TEM 영상 (높은 해상도의 줄기 이미징에 의해 달성되지 않은 초당 30 프레임)이 가능 액체에 콜로이드 nanoparticle 역학을 공부 한을 제공합니다 이러한 새로 개발 된 액체 세포. 액체 전지는 표준 TEM 홀더에 맞게 정기적으로 TEM 샘플로 운영 할 수 있습니다. 액체 (30 picoliters 약)의 작은 금액은 확장 화학 반응에 따라 현장에서 검사 할 수 있습니다. 다양한 이미징 및 분석 (즉, 에너지 흩어지는 X-선 분광법) 기술이 적용 할 수 있습니다. 보기 창 (멤브레인 포함 총 두께 이후와 액체 층)이 아래에 최대 100 나노 미터하거나 제어 할 수, 금 nanoparticle 아이콘이없는 액체 물에 생물 샘플 (예 : 단백질)의 직접 영상도 팔을 달성했습니다.

지난 20 년에 콜로이드 nanocrystals 9-11의 syntheses 및 응용 프로그램에 상당한 성과가 있었다. 그러나, 액체에 서로 성장하고 상호 작용하는 방식을 나노 입자의 핵의 이해는 주로 경험적와 대부분 11-13 전 현장 분석에 기반을두고 있습니다. 액체 세포 TEM 우리의 개발 현장 5,7,14,15에서 액체의 나노 입자의 동적 프로세스를 연구 할 수있는 독특한 플랫폼을 제공합니다.

우리는 순차적 microfabrication 과정에서 매우 얇은 실리콘 웨이퍼 (100 μm)를 사용하여 독립적 인 액체 셀을 제조. 이 실리콘 질화물 막의 증착, photolithographic 패턴, 웨이퍼 에칭, 스페이서 증착 및 셀을 포함결합은 반응 솔루션 등 약 50 nanoliters는 모세관 힘에 의해 셀에 그려집니다 저수지로로드됩니다. 우리는 액체의 또 다른 50 nanoliters으로 다른 저장소를 작성하십시오. 그 후, 세포는 현장 영상에 대한 현미경에 가둔 후로드됩니다. 현미경 내부의 액체는 두 실리콘 질화물 멤브레인 (30 picoliters에 대한 총) 검사를 할 수 있습니다 사이에 끼어. 전자 빔이 얇은 액체 층을 통과 할 때 액체의 나노 입자의 동적 프로세스를 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. 핵 및 나노 입자의 성장은 일부 경우에 5,7 또는 반응은 외부 열원 14,16에 의해 트리거 할 수있는 전자 빔에 의해 유도 할 수 있습니다. 전자 빔 손상이 우려되면, 낮은 전자 빔 전류 (선량)을 사용해야합니다.

액체 전지는 실리콘 microfabrication 과정에서 대형 일괄 처리, 막 또는 액체의 변화에​​ 제조되기 때문에개인 액체 세포 간의 두께는 smal L6 할 수 있습니다. 기본 microfabrication 훈련을 가진 연구원이 성공적으로 액체 세포를 만들 수 있습니다. 액체 처리 기술, 현장 TEM 운영도 연습 후에는 마스터 할 수 있습니다. 그것은 보는 창으로 실리콘 질화물 멤브레인을 사용하는 외에, 이러한 이산화 실리콘, 실리콘 또는 탄소 (graphene 포함)과 같은 다른 물질이 막 창뿐만 아니라 17-19로 사용될 수 있다고 지적하고 있습니다. 이후 더 멤브레인의 불룩 작은보기 창, 1 개 50 μm를 사용하여 우리의 액체 전지가 관찰되었습니다. 그리고 액체 전지는 작동하기 견고, 액체 세포의 1 % 실험 중에 창문을 깨뜨이 아래 즉. 또한, 액체 층의 두께도 유연하게 증착 된 인듐 스페이서의 두께를 변경하여 조정 할 수 있습니다. 샘플 준비하는 동안 봉인 된 액체 전지없이 유출로 몇 일 동안 액체를 유지 관리 할 수​​ 있습니다. 액체의 작은 양의 수실시간으로 확장 화학 반응의 연구를 수있는 전자 빔에서 몇 시간 동안 검사.

지금까지 우리가 예를 들어, 액체에 나노 입자의 시각화 많은 독특한 동적 프로세스를 가지고 PT의 성장과 합체가 얇은 액체 20,21, 이중 나노 입자 (14)의 성장 변동, 그리고 PT 3 성장 나노 입자의 확산, 5,15을 나노 입자 nanoparticle의 빌딩 블록 7, 등 또한에서 철 nanorods, 우리는 2.7 nm의 해상도 8 액체 물에, 예를 들어, 다른 지역으로 이미징 단백질이 방법을 적용했습니다. 요약하면, 우리의 액체 세포 TEM 기술은 재료 과학, 물리학, 화학 및 생물학에 근본적인 문제의 광범위한 연구를위한 아주 중요한 발전이 될 입증되었습니다. 우리는 액체 TEM 미래의 기술 발전 및 응용 프로그램을위한 큰 여지가 믿고 확실히 높은 impa 될 것입니다과학 연구의 광범위한 스펙트럼에 중부 표준시.

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Protocol

1. 액체 셀의 Microfabrication

  1. 실리콘 웨이퍼 (P-도핑, 두께 100 μm, 직경 4 인치) 준비 절차를 청소 표준 웨이퍼 목욕을 사용하여 웨이퍼를 청소하십시오.
  2. 저압 화학 기상 증착 (LPCVD) 방식에 의한 실리콘 웨이퍼의 양쪽에 보증금 낮은 스트레스 실리콘 질화물 박막 (두께 20 nm의). 사용자 정의 개발 제조법은 실리콘이 풍부한 질화물의 성장 (신 x, x라고 <4 / 3) 수있는 증착을 위해 사용됩니다.
  3. 보기 창 (1 × 50 μm),보기 창 (1 × 50 μm)와 상단 칩 (직경 3mm 2.6 × 2.6 mm)로, 하단 칩을 (직경 3mm 2.6 × 2.6 mm) 제조 두 개의 저수지 (0.6 × 1.2 × 0.1 mm) photolithographic 패턴 등의 표준 제조 공정, 죄의 x 막의 플라즈마 에칭 (활성 가스로 SF 6을 사용), 코 서부 유럽 표준시 etchin의 순서에 따라노출 된 실리콘 웨이퍼의 g 등 우리는 이러한 포토 레지스트의 스핀 코팅과 같은 가장 일반적인 photolithographic 프로세스를 사용 (1 분 3,000 RPM의 회전 속도와 긍정적 인 포토 레지스트, 포토 레지스트의 두께는 약 1 μm이다), UV 노출 개발자 및 해결사 (탈 이온수) 등을 사용하여 액체 전지, 리소그래피 패터닝의 크롬 마스크에서 스핀 코팅과 패터닝을위한 개발자를위한 포토 레지스트의 다른 선택이 있습니다. 그리고 프로세스에 해당하는 매개 변수는 다를 수 있습니다. 패턴의 특징 (μm 이상의 수백) 상대적으로 큰 있기 때문에 프로세스가 수행 될 용이합니다. 1시 2분의 물 무게 비율 : 코 솔루션은 수산화 칼륨과 탈 이온수에 수산화 칼륨 전원을 용해하여 준비가되어 있습니다. 코 솔루션은 에칭 동안 80 ° C에서 관리하고 있습니다. 분 당 1 μm의 에칭 속도는 달성 될 수있다. 신 X 막는 실리콘 코 에칭을위한 이상적인 보호 마스크입니다. etchin 이후g 선이 사용되며, 각각의 칩은 코 에칭 한 후 에칭 웨이퍼의 얇은 선으로 연결되어 있습니다. 칩의 조각은 쉽게 후속 프로세스에 대한 날카로운 핀셋을 사용하여 웨이퍼로부터 분리 될 수있다. 더 다이 싱 공정이 필요하지 않습니다.
  4. 하단 칩의 평면 측면에 보증금 인듐 스페이서. 첫째, 1.3에서 유사한 절차에 따라 칩의 리소그래피 패터닝을 수행. 칩의 처리를 돕기 위해, 포토 레지스트를 사용하여 얇은 유리 시트에서 개별 칩을 (여러 칩의 한 부분이 될 수있다) 어려움 스핀 코팅, UV 노출하기 전에 5 분 등 두 번째 동안 건조한 공기를합시다하여 패턴 칩을 청소 O 2 플라즈마는 1 분 50 와트에서 청소, 증발기를 사용하여 칩에 100 nm의 두께 셋째, 보증금 인듐 박막, 셋째, 리프트 - 오프 공정은 인듐 스페이서를 생성하는 수행됩니다.
  5. 함께 결합 바닥과 최고의 칩. 우리가 처음 광학 microsco 아래 바닥과 최고의 칩의 두 실리콘 질화물보기 창을 정렬PE는과 클램프를 사용하여 약 0.1 MPA의 압력을 적용 할 수 있습니다. 그것은 바로 서로의 상단에 창을 정렬하기 위해 연습이 필요합니다. 그 후, 액체 전지는 1 시간에 120 ° C에서 진공 오븐에서 구운되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 세포를 수집하고 향후 사용을위한 진공 건조기에서와 같은 - 준비된 세포를 저장합니다.

전체 제조 공정은 그림 1에 표시됩니다. 우리는 캘리포니아 버클리 대학의 Nanofabrication 연구소에서 모든 제조 공정을 실시합니다.

2. 반응 솔루션의 준비

우리는 예를 들어로 성장 PT 3 철 nanorods에 대한 반응 솔루션을 준비합니다. 플래티넘 (II) acetylacetonate (20 MG / ML)과 철 (II) acetylacetonate는 (20 MG / ML) pentadecane 및 oleylamine (7시 3분 권 / 권) 또는 pentadecane, oleylamine의 혼합물의 용매 혼합물에 용해하고 있었는데 올레산 (6시 3분 1초 권 / 권 / 권)이 surfactan의 비교에 사용됩니다t 효과.

3. 반응 솔루션을로드

  1. 반응 솔루션의 약 50 NL은 주사기와 테플론 나노 튜브 (콜 - Parmer, IL에서 구입)를 사용하여 액체 셀에 저수지 중 하나에로드됩니다. 그런 다음, 다른 저장소는 같은 방식으로 가득 차 있습니다.
  2. 반응 솔루션의 약 30 PL은 모세관 힘에 의해 셀에 그려진와보기 창에서 두 실리콘 질화물 멤브레인 사이에 끼어 액체 레이어 (~ 100 nm 정도)을 형성하고 있습니다.
  3. 액체 셀은 이후 얇은 구리 커버 (Tedd 펠라 주식회사에서 구입 한 단일 슬롯 0.6 mm 직경의 구멍과 ~ 50 μm의 TEM 그리드)를 사용하여 밀봉되어 있습니다. 진공 그리이스는 커버의 한 측면에 적용되었으며, 에폭시는 액체 셀의 가장자리를 밀봉하는 데 사용되었다. 최종 액체 전지의 총 두께는 250-300에 대한 μm이다.

4. TEM에 액체 전지로드

  1. 300 KV와 페이에서 작동 JEOL 3010 TEM은 F20 UT TEC를 monochromatedNAI (Network Advertising Initiative)는 현장 영상에서 사용되는 200 KV에서 작동.
  2. 액체 셀은 이미지에 대한 표준 TEM 샘플로 현미경에로드됩니다.

5. 실시간 TEM 영상

  1. 완벽한 고해상도 TEM 영상 조건에 현미경, 그리고 1-8의 빔 전류 밀도 × 10 5 A / m 2 실시간 영상 동안 유지를 조정.
  2. PTFE 시스템의 경우 핵 및 나노 입자의 성장은 액체 층에 전자 빔을 주조에 의해 시작 할 수 있습니다.
  3. Gatan DigitalMicrograph 소프트웨어와 결합 VirtualDub 소프트웨어는 nanoparticle 역학을 기록하기 위해 사용됩니다.

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Representative Results

액체 셀 TEM 방법을 사용함으로써, 우리는 nanoparticle의 빌딩 블록에서 PT 3 철 nanorods의 솔루션 성장을 시각화하고 있습니다. 그림 2는 다른 솔루션 조건에서 PT 3 철 nanorod의 성장 궤도를 묘사 연속 이미지를 보여줍니다. 포토샵을 사용하여 허위 색칠 과정은 나노 입자를 강조하기 위해 고용되었다.

pentadecane 및 oleylamine (7시 3분 권 / 권)의 용매 혼합물이 사용되었을 때, 성장의 세 가지 단계는 (그림 2A) 식별 할 수 있습니다. PT 및 철 전구체는 전자빔 조사에 의해 감소​​ 될 때 첫째, 많은 작은 나노 입자가 형성되어 있습니다. 그들 중 일부는 단량체 첨부 파일 증가, 다른 사람들은 접착을 받고있다. 둘째, 짧은 nanoparticle 체인 nanopaticle 상호 작용을 통해 형성된다. 셋째,로 구성된 짧은 나노 입자 체인은 상대적으로 긴 nanoparticle 체인을 구불 구불 형성 블록을 구축하는 역할을합니다. 때 pentadecane, OLE의 혼합물ylamine, 그리고 올레산 (6시 3분 1초 권 / 권 / 권)이 사용되었다, 구불 구불 한 nanoparticle 체인이 먼저 형성 한 다음, nanoparticle 체인은 바르게하고 짧은 기간 (그림 2B) 내에서 단일 결정 nanorods를 형성하고 있습니다.

요약에서, 우리는 빌딩 블록의 교정, 방향 및 모양을 수정 한 다음 모양 감독 nanoparticle 첨부에서 다결정 nanoparticle 체인을 권선의 성장을 통해 단결정 nanorods의 형성을 보여 주었다. 실시간 영상에서 통계 및 nanoparticle 역학의 정량화는 기능 장치 7 계층 나노 소재의 성장과 자기 조립의 이해와 컨트롤에 큰 의미가있다.

그림 1
1 그림.

그림 2
그림 2. 전자 빔에 노출하는 동안 액체 셀에 PT 3 철 nanorods의 성장. (A) 모양 감독 nanoparticle 첨부하여 nanowire 형성 이후 단계에 분자 전구체 용액의 초기 핵과 성장의 진화를 보여주는 선형 TEM 이미지. pentadecane 및 oleylamine (7시 3분 권 / 권)의 용매 혼합물은 사용되었습니다. (B) 트위스트 PT 3 철 nanorods의 형성과 이후의 교정 과정. (A) 짧은 PT 3 철 nanorod의 성장의 선형 TEM 이미지. (B) 선형 TEM 이미지는 긴 PT 3 철 nanorod의 성장을 보여주고 있습니다. pentadecane, oleylamine, 그리고 올레산 (6시 3분 1초 권 / 권 / 권)의 용매 혼합물은 사용되었습니다. 초, 그리고 초기 시간 7 임의입니다. 모두 (A)와 (B), 시간은 분으로 표시됩니다에

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Discussion

모든 제조 과정은 반도체 장치가 만들어 클린 룸에서 수행되었습니다.

인듐의 증착하기 전에 칩의 O 2 플라즈마 청소는 표면에 유기 잔류 물을 제거 할 필요가 있습니다. 따라서, 고품질의 인듐 스페이서는 상단과 하단 칩의 본딩 및 누설 무료로 액체 세포의 수율을 향상시킬 수있는 달성 될 수있다.

두께 약 13 nm의 ultrathin 막과 창을 볼 수 실리콘 질화물 높은 공간 해상도를 달성하기위한 열쇠입니다. 이러한 액체 세포를 처리 할 때 특별한주의가 제조뿐만 아니라 실험을하는 동안 멤브레인을 위반하지 않도록 필요합니다. 예를 들어, 평면 앞에있는 핀셋을 권장합니다. 그리고, O 2 플라즈마 공정, 낮은 전력 및 복용량을 청소 막 동안 (즉, 20-30 초 30, 월트) 포함될 수 있습니다. 성장 속도론은 전자빔 curren에 크게 의존 할 수 있기 때문에t 밀도, 이미지가 중요하지만 같은 전자 빔 전류 밀도를 유지. 액체 셀 TEM 방법은 실시간으로 솔루션에 nanocrystals의 성장 역학 연구를 수 있지만, 다른 동적 프로세스를 (즉, 액체, 액체 비말 역학 등의 나노 입자의 확산) 공개 할 수 있습니다뿐만 아니라. 또한, 기본 환경에서 생물학적 과정을 시각화 할 수있는 유망한 경로를 제공합니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

청 EM의 초기 개발 액체 셀 동안 교수 A. 폴 Alivisatos와 도움이 토론 박사 울리히 Dahmen 감사드립니다. 그녀는 과학 조기 경력 연구 프로그램의 DOE 사무소의 지원에 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Platinum(II) acetylacetonate Aldrich 523038
Iron(II) acetylacetonate Aldrich 413402
pentadecane Aldrich P3406
oleylamine Aldrich O7805
oleic acid Sigma O4137
Equipment
TEM JEOL JEOL 3010
Monochromated TEM FEI F20 UT Tecnai

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