Real-time Analyser af Retinol Transport af membranen Receptor af Plasma retinolbindingsprotein

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi en optimeret teknik til at producere høj kvalitet vitamin A / RBP kompleks og to real-time overvågning teknikker til at studere vitamin A transport med STRA6, det RBP receptoren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vitamin A er afgørende for vision og vækst / differentiering af næsten alle menneskelige organer. Plasma retinol-bindingsprotein (RBP) er princippet og specifik bærer af vitamin A i blodet. Her beskriver vi en optimeret teknik til at producere og oprense holo-RBP og to real-time overvågning teknikker til at studere transporten af ​​vitamin A ved høj affinitet RBP receptor STRA6. Den første teknik gør det muligt at fremstille en stor mængde af høj kvalitet holo-RBP (100%-fyldt med retinol) for vitamin A transport assays. Høj kvalitet RBP er afgørende for funktionelle assays, fordi fejlfoldede RBP udgivelser vitamin A let og bakteriel forurening i RBP forberedelse kan forårsage artefakter. Real-time overvågning teknikker som elektrofysiologi har gjort kritiske bidrag til studier af membran transport. Den RBP receptormedieret retinol transport er ikke blevet analyseret i realtid indtil for nylig. Den anden teknik er beskrevet her, er real-time analyse af STRA6-katalyseret retinol frigivelse eller læsning. Den tredje teknik er realtidsanalyse af STRA6-katalyseret retinol transport fra holo-RBP til cellulært retinol bindingsprotein I (CRBP-I). Disse teknikker giver høj følsomhed og opløsning i afslørende RBP receptors vitamin A optagelse mekanisme.

Introduction

Vitamin A er et organisk molekyle, der er afgørende for menneskets overlevelse og et velfungerende næsten alle menneskelige organer. Vitamin A derivater (retinoider) deltage i diverse biokemiske og cellulære begivenheder, herunder sensing af lys til syn 1,2 og reguleringen af genekspression og protein translation under fosterudviklingen og i voksent væv 3-6. Selv retinol har evnen til at diffundere systemisk, evolution kom op med plasma retinol-bindende protein, et specifikt bærerprotein for vitamin A transport i blodet for at opnå en høj effektivitet og specificitet og undgå toksicitet forbundet med tilfældig diffusion 7-10. Et højaffinitets-receptoren, som binder til RBP og fylder vitamin A Hypotesen var i 1970'erne 11-13. Trods beviser akkumuleret i tre årtier på eksistensen af RBP receptor 14-31 blev receptor hypotese debatteret i mange år på grund af existence af en forkert definition af holo-RBP. Den korrekte definition af holo-RBP er, at det er den høje affinitet 1:1 kompleks mellem retinol og RBP. Gentagen ekstraktion af holo-RBP af organisk opløsningsmiddel er nødvendig til at producere Apo-RBP. Denne definition anvendes af næsten alle laboratorier studerer RBP 7,9,32-35 eller RBP-receptoren 14-31,36-42. Den forkerte definition af holo-RBP der blev brugt til modbevise eksistensen af ​​RBP-receptoren er den akutte blanding af fri retinol med apo-RBP. Eftersom funktionen af ​​RBP receptoren i vitamin A optagelse fra holo-RBP er at frigøre retinol fra holo-RBP ville RBP-receptoren spiller nogen rolle i retinol optagelse hvis retinol er fri til at begynde med (som foreslået af urigtige afgrænsning af holo -RBP).

Den nylige identifikation af RBP receptor som multitransmembrane domæne protein kaldet STRA636 og dets funktion i vitamin A optagelse fra holo-RBP 36-43 kraftigt taler imod den hypotese, at RBP ikke erbrug for en receptor til at levere vitamin A. Detaljerede analyser afslørede, at STRA6 har 9 transmembrane domæner med N-terminalen er placeret ekstracellulært, og C-terminus placeret intracellulært 40. Placeret mellem transmembran 6 og 7 er en væsentlig RBP bindingsdomæne 39. STRA6 er koblet til både LRAT og CRBP-I i vitamin A optagelse fra holo-RBP, men hverken LRAT eller CRBP-I er absolut nødvendig for øget STRA6 aktivitet 41. STRA6 evne til at katalysere retinol frigivelse fra holo-RBP er nøglen til dets vitamin A optagelsesaktivitet 41. Ved at lægge STRA6 at frigive sit retinol, kan vitamin A levering af RBP transportere vitamin A til målceller i perifere væv med høj specificitet og effektivitet.

Den afgørende betydning af holo-RBP definition og forberedelse illustreres ikke kun af historisk debat om eksistensen af ​​RBP-receptoren, men også af tre beslægtede seneste artikler baseret på holo-RBP definitioner DIFskellige fra den oprindelige og korrekte definition 44-46. Det første papir holo-RBP definition, der blev anvendt til at afvise eksistensen af RBP receptoren at undersøge RBP receptor 44. Den anden og tredje papirer kom op med en tredje definition af holo-RBP der gjorde det endnu mindre sandsynligt for retinol, som skal undersøges for at danne en ordentlig kompleks med RBP 45,46. Disse undersøgelser prepared 3 H-retinol/RBP ved blanding af holo-RBP (ikke engang apo-RBP) med 3H-retinol. Eftersom dette assay ikke havde 3 H-retinol/RBP dannet og ikke unødigt frit 3H-retinol 45,46, er det ikke et assay for 3H-retinol optagelse fra 3 H-retinol/RBP, men er en fri 3H-retinol diffusion assay. Det er blevet vist tidligere, at STRA6 ikke forøge cellulær optagelse af frit retinol ved LRAT 38 eller CRBP-I 41. Stort set al retinol er bundet til RBP i blodet, og der er ingen påviselig free retinol. En hovedfunktion RBP-receptoren er at katalysere retinol frigivelse fra holo-RBP under retinol optagelse fra holo-RBP 41. Hvis retinol kunstigt frigives eller er i fri form til at begynde med 45,46 er RBP-receptoren ikke nødvendigt. De dramatisk forskellige resultater, som frit retinol diffusion assay i sammenligning med assays baseret på korrekt forberedt holo-RBP illustrerer, at korrekt tilberedning af RBP er afgørende for dets funktionelle assays.

RBP kan oprenses fra humant serum 41, men fremgangsmåden er kompleks, og udbyttet er lavt. En alternativ fremgangsmåde er at fremstille RBP i E. coli. Da E. coli ikke har evnen til korrekt folde mammale secernerede proteiner med mere end ét par af disulfidbindinger som RBP, er det vigtigt at refold RBP og oprense korrekt foldede protein. Fejlfoldede proteiner ikke alene opfører sig forskelligt fra korrigeret foldede RBP i forskellige analyser,men også forårsage proteinaggregering under opbevaring. Af samme grund er apo-RBP kun fremstillet af høj kvalitet holo-RBP. Vi beskriver her en optimeret protokol til at producere høj kvalitet RBP 100% fyldt med retinol gennem bakteriel ekspression, genfoldning, og HPLC-oprensning. HPLC-oprensning ikke kun fjerner ukorrekt foldet RBP men også betydelig bakteriel forurening, der kan forårsage alvorlige artefakter hvis RBP bruges i signaltransduktionsinhibitorer assays. Vi beskriver også to følsomme real-time overvågning teknikker til at studere retinol transport af STRA6. Begge teknikker afhænger af høj kvalitet RBP. På grund af pladsbegrænsninger, de klassiske teknikker til radioaktiv retinoid-baseret og HPLC-baseret vitamin A uptake assays er ikke beskrevet her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produktion, Refoldning, og HPLC-oprensning af holo-RBP

  1. Transform BL-21cells med pET3a vektor, der huser cDNA'et for human RBP med 6x His-mærke på N-terminalen. Dyrke de transformerede BL-21-celler i et rysteapparat ved 37 ° C i 40 ml LB-medium med carbenicillin, indtil OD ved 600 nm når 0,5. Inducere RBP-proteinekspression ved tilsætning af IPTG til 1 mM. Dyrke bakterierne ved 37 ° C endnu 5 timer.
  2. RBP produceret i E. coli er for det meste til stede i uopløselige inklusionslegemer. At berige inklusionslegemer, pellet celler ved 10.000 x g i 20 min. Derefter sonikeres cellerne på is i 5 ml PBS med proteaseinhibitorer, efterfulgt af 2 cykler af nedfrysning og optøning. Pellet ned inklusionslegemerne ved 20.000 x g i 30 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og holde pellet på is.
  3. Solubilisere inklusionslegeme pellet ved sonikering i 10 ml 7,5 M guanidinhydrochlorid. Tilføje et halvt volumen (5 ml) af 25 mM Tris-puffer, pH 9,0 og DTT til en endelig concentration på 10 mM. Kraftigt blande opløsningen på en vortex-blander natten over ved stuetemperatur til fuldstændig reduktion og denaturering proteiner.
  4. Centrifuger proteinopløsningen at fjerne uopløseligt materiale ved 18.000 x g i 20 min ved 4 ° C. Efter centrifugering, overføres supernatanten til et nyt rør og anbringes røret på is.
  5. Forberede fire volumener (60 ml) i genfoldningspufferen (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cystin, 3,0 mM cystein, 1 mM EDTA). Afgasses genfoldningspufferen. Også fremstilling af 600 pi 10 mM retinol i ethanol under svagt rødt lys. Hold det i mørke på is. Både genfoldningspufferen og retinol opløsning skal være frisk fremstillet.
  6. Afkøle både proteinopløsningen og genfoldningspufferen på is i mindst 30 min. Højere temperatur kan forringer kvaliteten af ​​refoldet RBP. Tilsæt 1 ml genfoldningspufferen dråbevis, og 10 pi retinol opløsning igen, mens proteinopløsning kraftigt blandes i et bægerglas på is. Gentag dette trin, indtil alle genfoldningspufferen og retinoltilsættes. Hold omrøring af reaktionsblandingen på is i mørke i 5 timer.
  7. Spin ned genfoldning reaktionen ved 24.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Det er vigtigt at fjerne aggregater lige efter genfoldning reaktionen.
  8. Koncentrere supernatanten opløsning under anvendelse af Amicon Ultra 15 koncentrator (MWCO 10 K) til omkring 10 ml. Må ikke koncentrere refoldede løsning mere end dette niveau. Koncentrere for meget vil føre til proteinaggregering og sænker den endelige udbytte og kvalitet af korrekt foldet RBP. Fortynd det koncentrerede prøve med kold PBS til 100 ml. Formålet med dette trin er at fjerne komponenterne i genfoldning reaktion, der forstyrrer nikkel oprensning.
  9. Spin opløsningen en gang ved 24.000 x g i 20 min ved 4 ° C. Det er vigtigt at fjerne eventuelt bundfald. Supernatanten overføres til to 50 ml reagensglas, der hver indeholder 1 ml Ni-NTA opslæmning, der er blevet vasket med PBS. Rotere rørene ved 4 ° C i en time. Inkubering fortyndet opløsning feller 1 time kan forårsage udfældningen af ​​fejlfoldede proteiner, der skal fjernes.
  10. Spin ned rør ved 500 x g i 3 minutter. Fjern supernatanten omhyggeligt. Alt flydende bør fjernes. Læg kold PBS til 30 ml for hvert rør. Spin igen og fjern supernatanten. Gentag denne proces, indtil du ser noget, men perler i røret.
  11. Overfør Ni-NTA-harpiks til en tom spalte. Vask harpiksen med 20 søjlevolumener af 10 mM imidazol, 500 mM NaCI i PBS. Eluere His-RBP i 5 søjlevolumener af 100 mM imidazol i PBS. Opbevar ikke denne opløsning i en længere periode, og frysning reducerer det endelige udbytte og kvalitet. For det bedste resultat, rense RBP ved HPLC med det samme.
  12. Dialyseres His-RBP oprenset fra Ni-NTA-harpiks mod 25 mM Tris, pH 8,4, og 120 mM NaCI. En koncentrator kan også anvendes til bufferudskiftning. Klare prøver til HPLC ved centrifugering ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C lige før hver kørsel.
  13. Oprense holo-RBP på HPLC under anvendelse af en ionbyttersøjle AX-300 ved en NaCl-tringradient (220 mM 12 min, 360 mM 15 min, og 1,000 mM 15 min) under anvendelse af 25 mM Tris, pH 8,4 som mobil fase ved 1 ml / min. Som NaCl-koncentrationen stiger, bliver holo-His-RBP frigivet, mens apo-RBP og fejlfoldede RBP forblive bundet til søjlen (figur 1). Hvis RBP genfoldning ikke sker optimalt, fejlfoldede RBP (f.eks fejlfoldede RBP-I i figur 1) kan dominere hele præparatet.
  14. Opsaml korrekt foldet holo-RBP fra topfraktionerne på 360 mM NaCl. Omhyggeligt overvåge elueringsprofilen for korrekt foldet og fejlfoldede His-RBP. Ved 1.000 mM NaCl, fejlfoldede fleste af His-RBP, bør frigives.
  15. Fraktioner indeholdende holo-RBP er samlet, koncentreret og dialyseret mod PBS natten over ved 4 ° C. Kontrollere den endelige udbytte og kvalitet (330 nm/280 nm) efter spektrofotometer. Korrekt foldet produkt skal have en 330 nm/280 nm forhold på lidt højere end 1 (figur 1).
  16. Til produktione apo-RBP, der tilsættes samme mængde af heptan til de rensede holo-RBP og blandes forsigtigt ved rotation natten over ved 4 ° C. Der centrifugeres ved 16.000 g i 10 minutter ved 4 ° C og forsigtigt overføre den nederste vandige fase til et nyt rør (for at undgå bundfaldet ved grænsefladen). Gentag fremgangsmåden tre gange med en 3 timers inkubation for hver. Tjek absorption på en Nanodrop spektrofotometer for at sikre, at 330 nm peak er faldet til baggrundsniveauet.

2. Real-time overvågning af STRA6-katalyseret Retinol Udgivelse og Retinol Loading

  1. Blokere en sort 96-brønds Microfluor-2 plade (Thermo Scientific) med 200 pi Blocker casein (Pierce) natten over ved 4 ° C for at forhindre ikke-specifik klæbning af holo-RBP til plast. Blocker Kasein giver den bedste blokerende virkning af alle de blokerende løsninger, vi testede.
  2. Membraner frisk fremstillet ud fra celler, der udtrykker STRA6 eller kontrolceller vaskes ved anvendelse af PBS og ledes gennem en Hamilton-sprøjte (GastiGHT # 1710) 6 gange til frembringelse af en ensartet suspension i PBS. Vi anvender typisk membraner afledt fra 1/100 til 1/20 af celler dyrket på en 100 mm skål per reaktion.
  3. Vask de coatede brønde i mikrofluorpladen-2 plade gang med 200 ul PBS. Køle pladen på is før tilsætning af membransuspensionen (50 pi per well).
  4. Real time overvågning af retinol fluorescens måles ved hjælp af fluorescens optik Polarstar Omega (BMG Labtech) med excitationsfilter 320ex og emissionen filter 460-10. Programmet er indstillet til Endpoint læsning mode. The Plate tilstand kan også anvendes til at måle et tidsforløb, hvis tidsintervaller ikke varieres. Signalet fra hvert tidspunkt er gennemsnittet af 10 målinger (orbital midling med en diameter på 2 mm), og den sættes til 1800. Pladen rystes i 10 sekunder ved 500 opm ved at anvende dobbelt-orbital omrystning før hver måling.
  5. For at starte retinol release assay brøndene læses en gang med Endpoint læsning mode før holo-RBP (typisk 1 pM slutkoncentration) tilsættes ved 0 min. Så snart holo-RBP tilsættes, gennemføres reaktionen overvåges kontinuerligt hver 5-10 min i 1-3 timer. At starte retinol loading assay, all-trans retinol (typisk 1 pM slutkoncentration) sættes til brøndene under svagt rødt lys. Pladen læses en gang før apo-RBP tilsættes ved 0 min. Så snart apo-RBP tilsættes, gennemføres reaktionen overvåges kontinuerligt hver 5-10 min i 1-3 timer.
  6. Når alle målinger er udført, skal du downloade de rå data (eksempel vist i figur 2) fra Omega Data Analysis software (BMG Labtech) til Microsoft Excel til dataanalyse. Hvert tidspunkt frembringer en fil, der indeholder aflæsningerne af alle forsøgsbetingelserne. For eksempel, hvis der er 20 tidspunkter konsolidere 20 filer i en Excel-fil til dataanalyse.
  7. Til dataanalyse er de fluorescenssignaler før tilsætning af retinol eller holo-RBP ved 0 minutter betragtes baggrundssignaler end subtraheres fra de endelige fluorescenssignaler på alle tidspunkter. Selv om baggrundssignaler er lave sammenlignet med retinol fluorescens i holo-RBP, subtraktion af baggrunden eliminerer den ikke-specifikke indflydelse af lysspredningen af ​​membranerne og gør det muligt at fokusere på retinol fluorescens af holo-RBP eller retinol tilsat ved 0 min.

3. Real-time overvågning af STRA6-katalyseret Transport af Retinol Fra Holo-RBP til CRBP-I

  1. Retinol-EGFP er en ny fluorescensresonansenergioverførsel (FRET)-par, der for nylig er blevet etableret 41. STRA6-katalyseret retinol transport fra holo-RBP til EGFP-CRBP-I overvåges i realtid ved at måle retinol-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I fusionsprotein med 6xHis-tag (EGFP-CRBP-I) fremstilles i pattedyrceller og oprenses på Ni-NTA resin før forsøget. EGFP-CRBP-I kan lagres i PBS med proteaseinhibitorer for en kort tid ved 4 ° C. Alternativt fusionsproteinet is nedfrosset i -80 ° C i små portioner.
  2. Før reaktionerne, udarbejde et blokeret Microfluor-2-plade og membraner som beskrevet ovenfor. Vask de coatede brønde i mikrofluorpladen-2 plade en gang med 200 pi PBS før tilsætning af membransuspensionen (50 pi per well).
  3. Real-time retinol-EGFP FRET måles ved hjælp af Polarstar Omega med excitationsfilter 320ex og emissionen filtrene 460-10 og 510-10 med samtidige duel emission fluorescens optik. Programmet er indstillet til Endpoint læsning mode. The Plate tilstand kan også anvendes til at måle et tidsforløb, hvis tidsintervaller ikke varieres. Signalet fra hvert tidspunkt er gennemsnittet af 10 målinger (orbital midling med en diameter på 2 mm), og den sættes ved 1.800 per kanal. Pladen rystes i 10 sekunder ved 500 opm ved at anvende dobbelt-orbital omrystning før hver måling.
  4. At starte reaktioner, EGFP-CRBP-I (typisk 1 pM slutkoncentration) sættes til brøndene. Pladen aflæses påce med Endpoint læsning tilstand, før holo-RBP tilsættes ved 0 min. Så snart holo-RBP tilsættes, gennemføres reaktionen overvåges kontinuerligt ved måling hver 5-10 min i 1-2 timer.
  5. Når alle målinger er udført, skal du downloade de rå data (eksempel vist i figur 3) fra Omega Data Analysis software til Microsoft Excel til dataanalyse, som beskrevet ovenfor.
  6. Retinol-EGFP FRET beregnes ved den dynamiske ændring i forholdet mellem acceptor / donor emissionstoppe 47. Ligningen 41 til beregning af dette forhold er [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], hvor 510 t, 510 b, 460 t, og 460 b repræsenterer emissioner ved 510 nm efter initiering af reaktionen ( t = tid point), er ved 510 nm før retinol eller holo-RBP tilsat (b = baggrund), ved 460 nm efter initiering af reaktionen (t = tidspunkt), og ved 460 nm før retinol eller holo-RBP tilsættes (b = baggrund) hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi præsenterer her repræsentative resultater for holo-RBP produktion og oprensning ved HPLC (fig. 1), real-time analyse af STRA6-katalyseret retinol frigivelse fra holo-RBP og retinol påfyldning i apo-RBP (fig. 2) og tidstro analyse af STRA6-katalyseret retinol transport fra holo-RBP til EGFP-CRBP-I (figur 3).

Uden genfoldning, fremstillet RBP i bakterier er næsten fuldstændigt fejlfoldede på grund af tilstedeværelsen af ​​mange ukorrekte disulfidbindinger. Derfor genfoldning i nærvær af liganden retinol er kritisk vigtigt at opnå god foldet RBP. Vi fandt, at hvis genfoldning reaktionen ikke udføres korrekt, fejlfoldede RBP arter (f.eks fejlfoldede RBP-I i figur 1) kan dominere hele præparatet, og udbyttet af høj kvalitet holo-RBP kan være meget lav efter HPLC-oprensning. Derfor kan HPLC ikke løse problemet med dårlig refoldning. Som vist i (figur 1). Selv delvis fejlfoldede RBP stadig binder retinol, retinol / RBP komplekset er langt mindre stabil, og RBP lettere frigiver bundet retinol. Fejlfoldede RBP kan føre til forkerte konklusioner fra RBP eller vitamin A-relaterede eksperimenter. En anden forskel mellem korrekt foldet RBP og fejlfoldede RBP er, at korrekt foldet holo-RBP er stabil i flere år ved 4 ° C i PBS. Hvisholo-RBP forberedelse har fejlfoldede RBP forurening, vil uopløselige materialer opstå efter en periode med opbevaring. Uopløselige materialer kan observeres efter centrifugering ned opløsningen ved høj hastighed ved 4 ° C. Apo-RBP er kun produceret af høj kvalitet holo-RBP.

Når oprenset høj kvalitet holo-RBP eller apo-RBP er tilgængelig, kan den anvendes til at studere STRA6-katalyseret retinol transport. Både real-time retinol release assay og retinol loading assay afhænger af overvågning af retinol fluorescens. En kilde til kunstigt fald i retinol fluorescens er den uspecifikke binding af RBP til plastskål (når RBP er bundet til plastvæg, kan den ikke længere måles i opløsning). Vi har testet mange blokerende betingelser, og fandt, at Blocker casein (Pierce) er mest effektiv til at reducere denne uspecifikke og receptor-uafhængig nedgang af retinol fluorescens. En anden kilde til kunstigt fald i retinol fluorescens er dårlig kvalitet af RBP, som beskrevetovenfor.

STRA6-katalyseret retinol frigivelse, retinol lastning og retinol transport er relativt langsomme begivenheder, som vist i de repræsentative data i figur 2 og 3.. Reaktionerne er relativt langsom, fordi hver RBP kun binder et molekyle af vitamin A og alle STRA6-katalyserede reaktioner afhænger af både RBP binding og RBP dissociation at fortsætte. For STRA6-katalyseret retinol release reaktion at fortsætte, kan holo-RBP kun binde efter apo-RBP dissocierer. For STRA6-katalyseret retinol loading reaktion at fortsætte, kan apo-RBP kun binde efter holo-RBP dissocierer. For alle de real-time overvågning beskrevne teknikker her fandt vi, at den ideelle hyppigheden af ​​måling er en måling hver 5 min eller 10 min. Selv hyppigere målinger kan skabe en højere tidslig opløsning, vil de resulterende datafiler være meget store, fordi hvert tidspunkt opretter en Excel-fil.

Figur 1 telt-bredde = "5.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50169/50169fig1.jpg" />
Fig. 1. Oprensning af genfoldet RBP ved HPLC til opnåelse af holo-RBP 100% fyldt med retinol. Nikkel harpiks-oprenset refoldet RBP påføres ionbytningssøjle AX-300 ved en NaCl-tringradient (220 mM 10 min, 360 mM 15 min, og 1,000 mM 15 min). Den korrekt foldet holo-His-RBP frigives og elueret ved 360 nM NaCl. Absorptionsspektre (250 nm-400 nm) af toppene for korrekt foldet holo-RBP, fejlfoldede RBP-1, fejlfoldede RBP-2, og forurening er også vist (proteintop er angivet med en blå lodret linje, og retinol peak er indiceret af rød lodret linje). Klik her for at se større figur .

d/50169/50169fig2.jpg "/>
Figur 2. Real-time overvågning af STRA6-katalyseret retinol loading ind i apo-RBP og retinol frigivelse fra holo-RBP. Denne analyse har spillet en vigtig rolle i afsløringen hvad STRA6 kan gøre af sig selv uden LRAT eller CRBP-IA Et eksempel på den rå datafil til den STRA6-catalzyed retinol lastning og retinol frigivelse som vist på Omega Data Analysis software. At indlede retinol release reaktionen holo-RBP tilsat til STRA6 membran eller kontrol membran ved 0 min. At indlede retinol loading reaktionen retinol tilsat til STRA6 membran eller kontrol membran forblandet med apo-RBP ved 0 min. Fluorescensmålinger til 320 nm excitation og 460 nm emission afslørede tidsforløbet af reaktionerne. Reaktioner 1-6 monitor retinol påfyldning af apo-RBP (1, 3, og 5 er STRA6 reaktion, 2, 4, og 6 er kontrolreaktioner). Reaktioner 7-12 monitor retinol påfyldning af apo-RBP (7, 9, og 11 er STRA6 reaktion, 8, 10, og 12 er kontrolreaktioner). B. De endelige beregnede signaler for reaktioner vist i A. Den venstre kurve blev beregnet baseret på reaktionerne 1-6. Den højre graf blev beregnet på grundlag af reaktionerne fra 7 til 12. Det højeste fluorescenssignal er defineret som 1 i venstre graf. Fluorescensen af holo-RBP tilsat ved 0 min er defineret som 1 i den højre graf. se større tal .

Figur 3
Figur 3. Realtidsovervågning af STRA6-katalyseret retinol transport fra holo-RBP til CRBP-IA Et eksempel på den rå datafil, der overvåger FRET mellem retinol og EGFP som vist på Omega Data Analysis software. Ved 0 min, bliver holo-RBP sat til reaktioner indeholdende STRA6 membran (reaktioner 1, 3 og 5) eller kontrol membran med EGFP-CRBP-I initiere reaktionerne (reaktionerne 2, 4 og 6). Samtidige duel emissionsmålinger for excitation ved 320 nm afslørede den grønne spor som den 460-10 emission tidsforløb og den blå spor som den 510-10 emission tidsforløbet. B. Den endelige beregnede FRET signaler til reaktioner vist i A. FRET signaler blev beregnet ifølge metoderne i trin 3,6. Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi deler her en optimeret RBP produktion protokol fordi RBP produktion og oprensning procedurer er afgørende for at skabe korrekt foldet RBP. Have mulighed for fejlfoldede RBP arter og tilstedeværelsen af ​​spormængder af bakterielle proteiner selv i HPLC-oprenset bakterier producerede RBP, er det nyttigt at anvende nativt RBP fra serum for at bekræfte en konklusion vedrørende RBP. Urin RBP, som er kommercielt tilgængelig, er en kompleks blanding af mange arter af RBP herunder apo-RBP-og holo-RBP 48,49.

De tidstro overvågning teknikker beskrevet her er baseret på den iboende fluorescens af retinol. Den oprindelige drivkraft for at udvikle disse assays var, at vi blev begrænset af de oplysninger, der kan afsløres ved de klassiske radioaktive assays og HPLC-baserede assays. For eksempel fandt vi, at STRA6 har lidt vitamin A optagelse aktivitet ved sig selv i vitamin A optagelse assays, men vi kan ikke nemt forklare den lave aktivitet af STRA6 i vitamin A optagelse uden LRAT eller CRBP-I 41. I retinyl ester-baserede assays, er det let at forstå, at STRA6 i sig selv ikke gør retinyl ester fordi STRA6 ikke er et enzym, der har LRAT aktivitet. Selv i retinol-baserede assays, STRA6 stadig har ringe aktivitet i sig selv. Har STRA6 har nogen vitamin A optagelse aktivitet på alle? Hvis det ikke sker, hvordan kan CRBP-I eller LRAT accelerere dens aktivitet? Hvis den gør det, hvorfor det behøver CRBP-I eller LRAT? Selv om radioaktive assays og HPLC-baserede assays ikke besvare disse spørgsmål, vi ræsonnerede, at STRA6 skal have evnen til at frigive retinol fra RBP. Vi har også begrundet, at en retinol fluorescensassay kan afsløre denne aktivitet. Retinol fluorescensmåling har gjort det muligt at studere bevægelsen af frie retinol i hvirveldyr fotoreceptorceller efter let blegning af visuelle pigmenter i realtid 50,51. Hvordan kan RBP receptor aktivitet overvåges ved måling af retinol fluorescens? Det blev opdaget ibegyndelsen af 1970'erne af to forskergrupper, som retinol dramatisk har øget fluorescens, når bundet til RBP 52,53. Vi fandt, at STRA6-katalyseret retinol frigivelse fra holo-RBP forårsager et fald i retinol fluorescens, mens STRA6-katalyseret retinol loading i apo-RBP forårsager en stigning i retinol fluorescens. Selv radioaktive assays og HPLC-assays har været omfattende anvendt til at undersøge vitamin A optagelse, var fluorescens assays ikke blevet anvendt til at undersøge RBP receptoraktivitet indtil for nylig, sandsynligvis fordi de endogene membraner, der anvendes som kilden til receptoren har meget høj baggrundsfluorescens og har en kompleks blanding af retinoid proteiner / enzymer, der gør det vanskeligt at fortolke den enkelte protein. De for tiden tilgængelige følsomme instrumenter er også det, der gør disse teknikker mere realistisk. Ud over direkte fluorescensmåling, den nye retinol-EGFP FRET-par 41 kombineret med samtidige duel emission optikgør det muligt at studere retinol transport til retinol-bindende proteiner i realtid og i flere reaktioner samtidigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Støttet af National Institutes of Health tilskud R01EY018144.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S. The Retinoids. Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. 2, Academic Press. 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey's small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochemistry. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300, (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305, (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochemistry. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochemistry. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O'Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. In Press. (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics