Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu alfa-sinüklein, Parkinson hastalığı ile ilişkili bir genin transkripsiyonel düzenleyici belirlemek için hızlı ve ucuz bir yüksek verimli tarama protokol mevcut. 293T hücreleri, bir tek gen başına oyuk mikro biçimde, bir arada lusiferaz haberci plazmidleriyle, bir dizilmiş ORF sentezleme kütüphanesinden plazmid ile transfekte edilir. Ateşböceği lusiferaz aktivitesi, bir iç kontrol yapısı (Renilla lusiferazı yönlendiren bir hCMV promotörü) ekspresyon normalize alfa-sinüklein transkripsiyon, üzerine her bir kütüphane genin etkilerini belirlemek için 48 saat sonra test edilir. Bu protokol, 96 kuyulu formatta aseptik sıvı taşıma yapan bir biyo-güvenlik kabini içinde bulunan bir tezgah üstü robot tarafından kolaylaştırılır. Bizim otomatik transfeksiyon protokol yüksek verimli bir kitaplık üretimi veya lentiviral konjugat olarak eşsiz bir kütüphane plazmidlerin çok sayıda üç transfections gerektiren diğer fonksiyonel eleme protokollere kolayca uyarlanabiliryardımcı plazmidin ortak bir set ile nction. Ayrıca, ucuz ve geçerli bir alternatif sunmak PTC124'ün, EDTA, ve önceki Renilla lusiferaz ölçümü ateş böceği lusiferaz aktivitesini bastırmak için pirofosfat kullanan ticari olarak temin edilebilen, çift lusiferaz reaktifler için. Bu yöntemler kullanılarak, 7670 insan genleri elenir ve alfa-sinüklein 68 regülatörleri belirlenmiştir. Bu protokol, diğer ilgi genleri hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.

Introduction

Temel genetik düzenleyici unsurları ve onlara hareket faktörleri belirlemek için yeteneği çok sayıda biyolojik süreçlerin keşif için esastır. Bununla birlikte, bu spesifik sinir hücresi popülasyonları gibi nadir hücre tiplerinde gen ekspresyonunu düzenleyen faktörlerin tanımlanması, zor olabilir. Burada, alfa-sinüklein (SNCA) 'nin yeni transkripsiyon düzenleyici belirlenmesi için bir protokol mevcut, Parkinson hastalığı ile ilişkili ve substantianigra dopaminerjik nöronların ifade edilen bir gen, orta beyin bölgesini pars compacta. Biz, 293T hücrelerinde alfa-sinüklein ifade yapısızlaştırmak bir yüksek verimli, çift-lusiferaz, in vitro raportör ekran kullanarak bunu. Alfa-sinüklein promoter birinci ateşböceği lusiferaz geni ihtiva eden bir raportör plazmid içine klonlanır. Yapısal olarak aktif bir promotörün kontrolü altında Renilla lusiferaz içeren bir plazmid, bir iç kontrol olarak hizmet vermektedir. These raportör yapılan, her biri de tek bir kütüphane bir plazmid ile transfekte edilir, öyle ki, bir DNA sentezleme kütüphanesinden plazmidleri ile mikroplakalarda 293T hücrelerine ko-transfekte edilir. 48 saat sonra, her bir muhabir için lusiferaz aktivitesi, bir çift ışıma analizi kullanılarak ardışık olarak ölçülür sonra. Plaka bazlı normale döndükten sonra (R oranı F) her bir Renilla lusiferaz aktivitesi: Her kitaplık genine karşılık olarak alfa-sinüklein nispi ekspresyon böceği oranı ile anlaşılmaktadır.

Bu protokol, insan gücü minimum (1-2 kişi) ve minimum maliyet (mikro-deney başına yaklaşık 3 $ maliyeti reaktifi) kullanılarak, raportör gen transaktivasyonu için kapasiteleri için genleri, çok sayıda (~ haftada 2500) taranması için olanağı sağlar. Genetik manipülasyon dirençli kültüre edilmiş nöronlarda çalışma zordur nöronal genlerin transkripsiyonel düzenleyici (örneğin, alfa-sinüklein), bu doğrudan fonksiyonel deneyde yan yana karşılaştırılabilir. Biz dahil bizimprotokolünün geleneksel prosedürler (Tartışma) ile yetiştirilen bu bölgeyi içeren plazmidler kararsız olduğu bulundu beri klonlama ve alfa-sinüklein promotörünü içeren plazmidlerin büyümesi için ayrıntılı bir yöntem. Ayrıca, yüksek verimli deneyler için ticari olarak temin edilebilen çift-lusiferaz reaktifler için ucuz bir alternatifi bulunmaktadır. Bu protokol, kolayca ilgili diğer düzenleyici elemanları, ya da yüksek verimli, geçici nakiller gerektiren herhangi bir işlem hedeflemek için adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deneysel bir bakış için Şekil 1'e bakınız.

1.. Alpha-Sinükleinin Destekleyici İçeren Reporter Plazmidleri hazırlayın

Alfa-sinüklein geni (Şekil 2) Düzenleyici elemanlar intron 2 3 boyunca yukan NACP (amiloid peptidinin non-A beta bileşen) dinükleotid sekansı tekrar 1,2 yaklaşık 10 kb, kapsar. Biz, bu bölgenin bir kısmını içerir Bizim muhabir yapı. Biz büyüme için gerekli olan 2 özel prosedürler intron içeren plazmidler, aşağıda özetlenen bulundu. Lusiferaz plazmidleri pGL4.10 ve pGL4.75 (Şekil 3), Promega'dan ticari olarak mevcuttur ve geleneksel moleküler biyoloji protokoller kullanılarak çoğaltılabilir.

  1. Tablo 1 'de tarif ve Tablo 2'deki primerler kullanılarak, ayrı PCR reaksiyonlarında alfa-sinüklein promoterin 2 bileşeni yükseltin.
  2. Verify PCR TE (Tris-EDTA), 50 ul sulandırarak Qiaquick PCR Saflaştırma kiti (Qiagen) kullanılarak agaroz jel ve clean ürünleri. Gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de taşınan 0.9 kb fragmanı saklayın.
  3. SacI ve XhoI ile tüm 3.4 kb PCR fragmanı ses, hem de pGL4.10 5 ug Digest. Buzağı Bağırsağı Alkalin Fosfataz (Roche) ile vektör tedavi ve jel PureLink Quick Jel Özümleme kiti (Invitrogen) kullanılarak saflaştırılması.
  4. T4 DNA ligaz (NEB) kullanılarak fragmanı ve vektör Arter. 10 ul TE tampon maddesi içinde yıkanarak PureLink Micro PCR kiti (Invitrogen) kullanılarak, reaksiyonun tamamlandığını temizleyin.
  5. ElectroMAX Stbl4 yetkili hücreleri (Invitrogen) içinde 20 ul içine temizlenmiş, bağlama reaksiyonunun 2 ul Dönüşümü ve üreticinin talimatlarına göre elektroporasyona. 90 dakika boyunca 225 rpm'de 30 ° C kuluçka makinesi içinde çalkalayın. 100 mg / ml ampisilin ihtiva eden LB plakaları üzerine yayıldı 2 birimleri ve 2 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
  6. Bir kürdan kullanarak, TB 2 ml (Müthiş Broth) içine aşılama için 4-6 küçük koloniler seçmek. Bir 30 ° C çalkalama O / N, bu miniprep kültürleri büyümek
  7. PureLink HiPure Plasmid Miniprep kiti (Invitrogen) kullanılarak her bir miniprep kültürün 1.5 ml plazmid DNA arındırın.
  8. BamHI ile miniprepleri sindirimi ve bir agaroz jeli üzerinde electrophorese. Doğru bir klon 2.8 kb ve 4.9 kb'lik fragmanları üretmek gerekir.
  9. Taze LB (Luria Et suyu) plakası üzerinde doğru klonundan geri kalan miniprep kültür Restreak ve 2 gün boyunca 30 ° C'de büyür.
  10. Küçük bir koloni seçin ve 1.5 ml TB starter kültür aşılamak. 30 ° C'de O / N sallamak Starter kültür doygunluk büyümesine izin vermeyin.
  11. Önceden ısıtılmış 150 ml TB içine tüm başlatıcı kültür seyreltilir ve 2 gün boyunca 30 ° C'de çalkalanır. Bir sonraki adıma geçmeden önce, klon replicati sırasında mutasyona olmadığını teyit etmek için ek bir miniprepi ve sindirim için bu kültürün 1.5 ml kullanın üzerinde.
  12. PureLink HiPure Plasmid Maksiprep kiti (Invitrogen) kullanılarak geri kalan kültürden plazmid DNA arındırın. Bu ara plazmidin beklenen sonuçlar, kültür, 150 ml başına 50-150 ug bulunmaktadır.
  13. Aşama 1.2 'de dondurulmuş 0.9 kb fragmanı çözülme. 1,3-1,12 Kpnl ve Sacl ile sindirim yerine, ara plazmid içine 0.9 kb fragmanının klonlanması için adımları tekrarlayın. Ligatı, seçin, dönüşümü, ve yukarıdaki gibi maksi için büyür. BamHI ile sindirimi 5.8 kb ve 2.8 kb fragmanlarının verim gerekir. Bu ekran için kullanılacak olan bir plazmiddir.

2. Tarama için 293T Hücreler, Muhabir Plazmidleri ve Kütüphane DNA hazırlayın

293T hücreleri ilk olarak 96 oyuklu plakalara tohumlandı ve sonraki gün transfekte edilir. Reporter plazmid ve kütüphane DNA'lar, 96 oyuklu plakalar içinde seyreltilir. Biz Massachusetts General Hospital (en DNA Çekirdek transfeksiyon dereceli kütüphane DNA plakaları elde= "_blank" olsun> dnacore.mgh.harvard.edu). Bu protokol, 293T hücreleri 2 aynı plakalar (Şekil 1) içine tek bir kütüphane plaka transfects hücre böylece 2 plakaları taranabilir her kütüphane levha için ekildi olmalıdır.

Not: Bu lusiferaz deneyleri müdahale ve sırasıyla transfeksiyonla sırasında toksisite arttıkça, kırmızı ya da antibiyotikler fenol olmadan medya hücreleri büyümek.

  1. Her kitaplık levha% 14 FBS ihtiva eden DMEM içinde 1.5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar, tekrar süspansiyon tripsinize edilmiş 293T hücrelerinin taranması için. Steril bir rezervuar (Axygen) dökün.
  2. Robot güverte rezervuarı, 2, berrak tabanlı, 96 oyuklu plakaları (Corning), ve filtre pipet uçları bir kutu (Agilent) yerleştirin. Oyuk başına 1.5 x 10 4 hücre yoğunluğunda için, her ikisi de plakaların her kuyuya 100 ul hücre dağıtın.
  3. Eşit sağlamak için düşük rampa hızları kullanılarak, 2 dakika boyunca 50 xg'de hücre plakaları santrifüjboyunca her bir hücre yoğunluğu. 37 ° C'de inkübe edilir ve% 10 CO2 O / N.
  4. Serumsuz ortam içinde 5 ng / ul ateş böceği ve Renilla raportör plasmidleri seyreltin. Bir 15 ml konik bir tüp içinde (hacimce) firefly Renilla plazmaya 05:03 oranında bir dilüsyonları birleştirin.
  5. Her kuyuya, kütüphane plaka başına 17 ul artı 2-10 ul fazlalık dağıtma, 96 oyuklu plakanın her oyuğuna pipetle birleşik plasmidler.
  6. Yukarıdaki gibi transfeksiyon dereceli DNA kütüphanesi plakaları elde edilir ve endotoksin içermeyen su ile 13.3 ng / ul seyreltin. Oyuk başına asgari hacmi 28 ul olmalıdır.

3.. Transfeksiyonlar gerçekleştirin

Ekranın 2. günde, raportör plasmidleri ve kütüphane DNA'lar 293T hücrelerine transfekte edilir.

  1. Her bir plaka için kütüphane, bir polistiren bir tüp içinde 4.3 ml serum barındırmayan ortam (1:40 seyreltme) ile RT Optifect (Invitrogen) 107.5 ul karıştırın. 5 dakika oda sıcaklığında ve inküben, 96 oyuklu, polistiren V-tabanlı bir plakanın (Greiner) her oyuğuna (kütüphane plaka başına) 44 ul dağıtmak.
  2. Seyreltilmiş Optifect tabak, raportör plasmidleri (Aşama 2.5), kütüphane DNA'lar (Aşama 2.6) ve robot güverte pipet uçları bir kutu yerleştirin.
  3. Her aspirasyon arasında 5 ul hava boşluğu ekleme muhabiri plazmidler, seyreltilmiş Optifect 43 ul, ve kütüphane DNA 26 ul, aspire 17 ul. Kütüphane DNA çapraz bulaşmayı önlemek için son aspire edilmelidir. Yeni bir polistiren V-altlı plaka içine ipuçları içeriğini dağıtın, kapak karıştırın ve lipid / DNA kompleksleri oluşturmak için izin vermek için 20 dakika boyunca bir kenara ayrılmıştır. Birden çok kütüphane plakaları transfecting ise pipet ipuçları ve kütüphane plakasını değiştirin ve tekrarlayın.
  4. Optifect / DNA karışımı, plaka ortaya çıkarmak ve 293T hücrelerinde 2 plakaları ile robot güverte üzerine yerleştirin. Pipet ipuçları tek bir kutu, aspire Optifect 80 ul Kullanımı: DNA karışımı ve yavaş yavaş hücrelerin her levha üzerine 40 ul dağıtmak. Trans eğerbirden çok kütüphane plakaları edilmesini, tüm Optifect için tekrarlayın: DNA plakaları. Hücreleri kapsayacak.
  5. 30 dakika boyunca 1200 x g'de hücre plakaları santrifüjleyin. Kapak ve inkübatör dönmek.
  6. 4-6 saat boyunca hücrelerin inkübe edin. Bu kuluçka sırasında, her bir plaka için transfekte edilmiş kitaplık,% 10 FBS ve 10 ug / ml siprofloksasin (Cellgro) içeren 12 ml DMEM karıştırılmasıyla taze ortam hazırlar. Steril bir rezervuar içine taze medya dökün.
  7. Robot ipuçları 2 kutu yerleştirin, hücrelerin tek bir tabak, robot güverteye taze medya ve atık haznesi içeren rezervuar. Aspire 100 hücrelerden ortam ul ve kısmen de% 70 etanol ile doldurulmuş atık rezervuar içine dağıtın. Taze ipuçları, taze medya aspire 100 ul kullanarak ve yavaş yavaş hücreleri üzerine dağıtmak. Bütün hücre plakaları için tekrarlayın.
  8. 48 saat boyunca inkübatör plakaları dönün.

4.. Dual-Lusiferaz Deneyleri gerçekleştirme

Ekranın 4. günde,ateşböceği ve Renilla lusiferaz tahlilleri gerçekleştirilir.

Not:. Tablo 3 'de tarif edildiği gibi, çift-lusiferaz deney Firefly ve Renilla lusiferazların böylece hücreler önce lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi için lize olmalıdır salgılanmış olmamak üzere, 2 deney tampon maddeleri, ateş böceği 3X deney tamponu ve 3X Renilla deney tamponu ardışık olarak ilave edilmesini gerektirir . Firefly deney tamponu hücreleri lize ve ateş böceği lusiferaz alt-tabaka içerir; Renilla deney tamponu ateşböceği sinyali söndürür ve Renilla lusiferaz alt-tabaka üretmektedir.

  1. Tablo 3 'de tarif edildiği gibi her bir kitaplık plaka için, stok çözeltilerinden 3X firefly deney tamponu içinde 8 ml hazırlamak ve bir 96 oyuklu V-tabanlı bir plakanın her oyuğuna 82 ul dağıtmak.
  2. Her bir kütüphane için plaka, aynı zamanda 3X Renilla deney tamponu içinde 12 ml hazırlamak ve bir 96 oyuklu V-tabanlı bir plakanın her oyuğuna 122 ul dağıtmak. Her iki kenara koyunateşböceği ve Renilla tahlil tamponlar.
  3. Robot Güvertede (aynı kütüphane plakadan nakledilen) pipetle ipuçları bir kutu, bir atık rezervuar, ve hücrelerin 2 tabak yerleştirin.
  4. Aspire 60 Her levhadan ortam ul ve kısmen de% 70 etanol ile doldurulmuş atık haznesinde atın. Kenara kapak plakaları ve ayarlayın. Birden çok kütüphane plakaları transfecting ise, plakaların tüm setleri için tekrarlayın.
  5. 2 pipet ipuçları kutuları, 3X ateşböceği tahlil tampon plaka, ve robot güvertede hücre plakaları bir dizi yerleştirin.
  6. Aspire 40 3X firefly ul deney tamponu ve iyice karıştırma, hücrelerin birinci plaka ekleyin. Yeni pipetlemeyin ipuçları geçiş, ikinci hücre plaka için tekrarlayın. Lizizi tamamlamak için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında hücreler yerleştirin. Birden çok kütüphane plakaları transfecting varsa, ipuçları ve hücre plakaların kutuları değiştirin ve tekrarlayın.
  7. Her hücre 1 saniye kayıt bir lüminometre üzerinde plaka, başına iyi her kuyudan rekor lüminesans. Robot plakaları geri döngüverte.
  8. 2 pipet uçları kasası, 3X Renilla deney tamponu plaka ve robot güverte hücre plakaları bir dizi yerleştirin.
  9. Aspire 60 3X Renilla ul deney tamponu ve iyice karıştırma, hücrelerin birinci plaka ekleyin. Pipet ipuçları yeni bir kutuya geçiş, ikinci hücre plaka için tekrarlayın. Birden çok kütüphane plakaları transfekte ise, hücre plakalar her kümeleri için tekrarlayın.
  10. Yukarıdaki gibi 1 saniye Her çukurun kayıt bir lüminometre tüm plakaları Tutanak lüminesans. Plakaları atın.

5. Veri Analizi

  1. Ateşböceği hesaplayın: Renilla lüminesans oranını ("F: R oranı"), Renilla sinyalin sayımlarının böceği sinyalinin sayımları bölünerek her bir oyuk için.
  2. F bölerek indüksiyon değerini hesaplayın: iyi ortalama F tarafından her R oranı: plakasının R oranı, kuyuların en yüksek ve en düşük% 25 hariç.
  3. Çoğaltır genelinde indüksiyon değerleri ortalamasınıTek bir transfekte edilmiş kitaplık levha. Üç kat daha alfa-sinüklein daha uyaran veya bastıran genleri Bu ekranda "hit" olarak kabul edilir ve daha fazla doğrulama ve ikincil ekranları tabidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tipik Lusiferaz değerleri, K: R, oranlar ve tek bir yarım plaka için indüksiyon değerleri Şekil 4'te gösterilmiştir iyi H2, bir 32-kat indükleyici olarak isabet not edin.. Aşırı toksisite (örneğin, iyi E3), ya da kötü transfekte edildi kuyuları neden olan genler, hem ateşböceği ve Renilla lusiferazlarm düşük değerler üretmek, ama ortalama bir indüksiyon değer olacaktır. PGL4 omurgası ile etkileşim yoluyla olabilir lusiferaz aktivitesi, non-spesifik indüksiyon neden olan genler, bir ortalama değer indüksiyon ile sonuçlanan eşit ateş böceği ve Renilla lusiferazların neden olacaktır. Çoğaltır indüksiyon değerlerinde büyük farklılıklar yürütme hataları şüphesini akla getirmelidir. Bu klon, artan sentezlenmesine neden Artan lusiferaz aktivitesi olarak ölçülebilir, böylece ekran raportör tahliller lineer aralığı dahilinde gerçekleştirilir doğrulamak için önemlidir. Biz doğrusallık doğrulamak için her bir raportör geninin artan miktarda transfekteBizim deneysel koşullar altında raportör tahlilin (Şekil 5). Bu alt-tabaka, inkübasyon kademesi nedeniyle azalmasına doğrusal olmayan önlemek için hemen sonra deneyler gerçekleştirmek için de önemlidir. Biz, reaktifler ilave edildikten (Şekil 6) sonra 1 saat için önemli ateş böceği lusiferaz faaliyeti gözlenmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. Deneysel bakış. Kütüphane DNA yapılarının her biri tek bir levha 2 raportör yapılan ile birlikte bir araya getirilmiş ve hücre yinelenen plakaları transfekte etmek için kullanılır. 48 saat sonra, her bir lusiferaz raportör etkinliği ardışık olarak ölçülür. Her bir kütüphane, plasmid tarafından SNCA promotör plazmidin özel indüksiyon plakası temelli normalizatio sonra Renilla lusiferaz için Firefly oranı ile hesaplanırn.

Şekil 2,
Şekil 2,. Ateşböceği haberci plazmid kullanılmaktadır kromozom 4 üzerinde yer alan alfa-sinüklein 5 'bölgesi (SNCA), şematik. Primer adları, Tablo 2'de serilerine tekabül etmektedir. Hatch işaretleri gösterir Şekil elendiği yaklaşık 8 kb kesimi Aksi ölçek. SNCA için ATG başlangıç ​​kodonu ekson 3 bulunur.

Şekil 3,
Bu tarama protokolde kullanılan Şekil 3,. Lusiferaz raportör plasmidleri. SNCA genomik bölge Pg çoklu klonlama klonlanırAteşböceği lusiferaz hemen üst L4.10. HCMV-IE1 Renilla lusiferaz (insan sitomegalovirüs ilk erken 1) promotörü ekspresyonu yönlendiren bir plazmit, bir iç kontrol olarak kullanıldı. Her iki plazmit Promega'dan ticari olarak temin edilebilir.

Şekil 4,
Şekil 4,. Tek 96-yuvalı plakanın yarısını Örnek sonuçlanır. A. Ham ateş böceği lusiferaz sayımı B. Ham Renilla lusiferaz sayısı C. F:.. Her bir F bölünerek her bir, hesaplanan B. D. indüksiyon değerlerindeki değeri A değeri bölünmesiyle hesaplanır R oranları: R oranı ortalama F:. kuyu üst ve alt% 25 hariç, plakanın R oranı, E. Grafik indüksiyon için temsili değerler iyi H2, olumlu bir hit, tek plaka, vurgulanır. H2 önceden SNCA ifadesi ile ilişkili olmayan bir nöronal transkripsiyon faktörüdür çarptı. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,
Şekil 5,. Lineerlik deneyler. Hücreler güçlü hCMV-IE1 promoterin kontrolü altında ateş böceği ve Renilla lusiferaz plasmidlerin artan miktarları ile transfekte edilmiş ve yukarıdaki protokol ile analiz edilmiştir. (Transfekte edilmiş DNA'nın toplam miktarı nötr dengeleyici plazmidin kullanılması ile sabit tutulmuştur). A. Firefly doğrusallık deneyi. Ateş böceği aktivite değerleri. B. Renilla doğrusallık deney geniş bir aralığı boyunca doğrusal kaldığına dikkat edin. 15 ng / çukur üzerindeki eğrinin düzleşme dikkat edin.

ntent "fo: keep-together.within-page =" always "> Şekil 6,
.. Şekil 6, ateş böceği lusiferaz deneyi için çürüme sinyalinin zaman seyri Lusiferaz, reaktifler, bir CMV-lusiferaz 0 zamanda yapı ile transfekte edilmiş tek bir plakaya ilave edildi; seri ölçümler ayrıca reaktiflerin eklenmeden yapılmıştır.

Bileşen Hacim Final Konsantrasyon
5 ng / ul BAC 2002-D6 4 ul -
5X Phusion GC Tampon 20 ul 1X
DMSO 6 ul % 6
dNTP (10 mm) 2 ul 200 uM
İleri Astar (100 mikron) 1 ul 10 uM
REverse Astar (100 mikron) 1 ul 10 uM
GKD 2 O 65 ul -
Phusion DNA Polimeraz 1 ul -
Toplam: 100 ul

Tablo 1.. PCR alfa-sinüklein promotör yükselterek için set-up.

Isim Sekans Sınırlama alanı
SNCA7 5'-GTC ggtacc tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' Kpnl
SNCA8 5'-TGC gagctc aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' SacI
SNCA1 5'-TCT gagctc tctgagcatttccctaggtg-3 ' SacI
SNCA2 5'-tag CTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3 ' Xhol

.. Tablo 2, alfa-sinüklein promotör yükseltilmesi için primerler NACP tekrar amplikonu 0.9 kb fragmanını üretmek gerekir; Diğer amplikon uzunluğu 3.4 kb'dir. Astar yerleri için Şekil 2'ye bakınız.

A: 3X Firefly Assay Buffer
Hazır Çözümler (-80 ° C'de mağaza) 100 ml 3X Firefly Test Tamponu başına hacim Final Konsantrasyon (3X)
500 mM DTT 3.0 ml 15 mM
10 mM koenzim A 6.0 mi 0.6 mM
100 mM ATP 0.45 ml 0.45 mM
80 mg / mlluciferin 0.525 mi </ Td> 4.2 mg / ml
Triton liziz tamponu 90,025 ml -
B. Triton Lysis Buffer
Komponent (oda sıcaklığında mağaza) 100 ml Triton Lysis Buffer başına hacim Final Konsantrasyon
Tris-HCl toz 1.705 g 0,1082 M
Tris-baz toz 0.508 g 0,0419 M
5 M NaCl 1.50 mi 75 mM
1 M MgCI2 0.30 mi 3 mM
Triton X-100, saf sıvı 0.75 mi % 0.25
Su 100 ml toplam hacme -
C. 3X Renilla Analiz Tamponu
~ 100 ml 3X Renilla Test Tamponu başına hacim Final Konsantrasyon (3X)
DMSO içinde 10 mM PTC124 0.6 mi 0.06 mM
Etanol içinde 2 mM h-CTZ 0.5 mi 0.01 mM
Renilla Tuzları 100 mi -
D. Renilla Tuzları
Komponent (oda sıcaklığında mağaza) 100 mi Renilla tuzları başına hacim Final Konsantrasyon
0.5 M Na2EDTA 9.0 mi 45 mM
Na Pirofosfat 1.34 g 30 mM
NaCl 8.33 g 1.425 M
Su 100 ml toplam hacme -

Tablo 3. Stok çözeltileri ve Firefly ile Renilla lusiferaz deneyleri için deney tamponu. A. 3X ateşböceği tahlil tamponu tarifi. DTT, ditiyotretol ihtiva eder. Aksi belirtilmedikçe, tüm bileşenler su içinde çözünür. B. Triton. C. 3X Renilla deney tamponu tarifi tarifi lizis tamponu. h-CTZ, h-coelenterazine. % 100 EtOH içinde 12.2 ml konsantre HCI 120 ul 10 mg h-CTZ eklenmesi ile 2 mM h-CTZ olun. PTC124 DMSO. D. Renilla tuzlan tarifi çözünür. Triton tampon lizis ve Renilla tuzları ile, 4 ° C'de ve oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca stabildir. 3X firefly deney tamponu ve 3X Renilla lusiferaz deney tamponu tahlili yerine 3-4 saat içinde karıştırılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alfa-sinüklein Lewy 4, bu hastalık için patognomonik olarak hücre içi dahil olanlar bir bileşeni olarak, Parkinson hastalığı (PD) olarak işaret edilmiştir. Çok sayıda genom-geniş dernek çalışmaları sporadik PH 5,6,7 riski ile alfa-sinüklin tek nükleotid polimorfizmleri bağlantılı var. Sporadik PH daha az yaygın olsa da, ailesel PD aynı zamanda çoğaltılması ve alfa-sinüklein mahalinin 9,10,11 arasında triplication olarak, alfa-sinüklin 8 mutasyonların neden olabilir, bir fenomen de sporadik PH 12. görülmektedir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar PH patogenezinde alfa-sinüklein merkeziliğini güçlendirmek. Bu ekranın amacı alfa-sinüklein düzenleyen genlerin belirlenmesi ve bu nedenle, Parkinson hastalığının patogenezinde bir rol oynayabilir oldu. Bu protokolü kullanarak, 7.670 insan genlerini ekranlı ve 140 temsil eden, 154 ön hit (en azından indükleyicileriin 3 kat) tespitözgü genler. Bu tıklama isabet tekrarlanabilirlik belirlemek için yeni DNA hazırlıklarını kullanarak ikincil deneylere tabi tutulmuştur. 3-kat aralığında Hit sonraki lusiferaz tahlillerinin% 28 çoğaltılabilir. Sırasıyla, ve 5-kat indükleyicileri -, 5 - tekrarlanabilirlik 4 içinde% 59,% 69 ve% 78'e yükselmiştir. 7 kat fazla indüksiyonların ile Hitler zaman% 100 çoğaltılamaz. Bu son olarak alfa-sinüklein transkripsiyon 68 yeni regülatörleri tespit edilmiştir.

Çeşitli türden kanıtlar şunu temin 68 bulgular, alfa-sinüklein gerçek düzenleyici olduğunu göstermektedir. Tespit itibaren Bizim listesi GATA3, daha önce ifade SNCA 3 düzenlediği gösterilmiştir transkripsiyon faktörlerinin GATA ailesinin bir elemanı içerir. Birkaç bilinen SNCA düzenleyicilerin biri Puanlama bizim ekranın güvenilirliği büyük güven veriyor. Buna ek olarak, biz bağımsız nöronal transkripsiyon faktörlerinin aynı ailenin birkaç üyesi vurur gibi, attı ekran tekrarlanabilir ve genlerini belirlemek olmadığını düşündürenrastgele. En önemlisi, ilave takip deneylerinde, bizim üst kabiliyeti aşırı ifadesi ve yok etme deneylerde doğrulanmıştır nöronal hücrelerde endojen SNCA ekspresyonunu düzenleyen vurur. Biz BacMamvectors SY5Y dopaminerjik hücrelerin 3 kullanarak vurur üst birkaç aşın ve bu vuruşlardan ShRNA devirme azalmış SNCA mRNA düzeylerinde sonuçlanırken, endojen SNCA düzeylerini 2-8 kat artırmak için başardık. Bu çalışmalar kesin bizim en hit endojen SNCA seviyelerinin düzenleyiciler ve deconstructed lusiferaz sisteminin sadece eserler olmadığını göstermektedir. Diğer hit için ek takip çalışmaları bizim ekran isabet tam listesi için doğru yanlış pozitif ve yanlış negatif oranlarını belirlemek için gerekli olacaktır. Vurur ve Parkinson Hastalığı ilişkileri tam bir açıklaması hazırlanması 14 bulunmaktadır.

Bu bizim tarama yönteminin sınırlamaları dikkate almak önemlidir. Bu obv olmalıdırEkran herhangi regülatörü tespit olmaz ious tarama kütüphanede mevcut değil. Bizim tarama kütüphane insan genomunun yaklaşık dörtte birini içeren, önemli iken, kapsamlı değildi. Bizim deneyinin kolaylığı göz önüne alındığında, ek kütüphaneler kolaylıkla taranabilir olabilir. Biz ikincil analizlerde, hit paraloglarına, dahil olmak üzere mevcut hedeflenmiş bir şekilde tarandı genlerin sayısı arttı. Aynı zamanda raportör yapısının dahil olanlar dışında genomik bölgelere bağlı olan herhangi bir isabet puan değildir. Uygun bölgeden dahil şansını maksimize etmek için, bizim muhabir SNCA destekleyicisindeki bulunan birden fazla transkripsiyon başlangıç ​​siteleri için hemen yan dizileri içeriyordu. Bu ilave faktörler SNCA ekspresyonunu düzenleyen çok yakın promoter bölgesi dışındaki bölgelere bağlanan olasıdır. İstenirse Bu ilave yukarı akışlı ve aşağı bölgelerle ekranlar performans ile tespit edilebilir, bir seferde yalnızca ~ 10 kb bir olabilir amanedeniyle verimli bir plasmid vektörleri içine klonlama ve yüksek bir kopya sayısı pGL4 vektörleri stabilitesi üzerinde sınırlamalar bu şekilde ssessed. Seçenek olarak ise, lusiferaz yapısı SNCA yerinin içeren BAC DNA 'ların içine sonradan edilebilir. Ikinci yaklaşımın bir dezavantajı uygun şartlar altında bile BAC'lerin transfeksiyon sonra> 100-kat daha az etkin olduğunu 15 plazmidler olmasıdır. Başka bir yaklaşım "knock-in" için lusiferazın muhabir endojen SNCA yörüngesi içine, sonra bizim yaklaşımımız çok daha zahmetli bir yöntem olacaktır. Ayrıca, daha önce aşın Artan lusiferaz aktivitesi ile sonuçlanmaz, böylece düzeyde satürasyon ifade edilen herhangi bir isabet puanı değildir. Bu nedenle biz SNCA düzenleyen nöronal faktörleri eksikliği olabilir, ve gerçekten de nöron transkripsiyonel bir dizi faktöre attı nöron olmayan 293T hücreleri kullanılmakta, seçtik. 293T hücreleri bir potansiyel dezavantajı, ancak, bu gerekirse bir vuruşu olarak, herhangi bir genin puan olmayabilir olmasıdırLAVE F nöronal faktörler düzgün çalışması için. Böylece, tüm ekranlar gibi, bizim çalışmada potansiyel SNCA regülatörlerin bir dizi kaçırmayın olabilir. Ancak, pratik açıdan, 68 vurur biz artırmak, daha fazla 10 kat SNCA bilinen düzenleyicilerin sayısını elde edilen ve takip etmek nedenle ek hit bizim durumda gerekli olmayabilir iş yıllar gerektirir.

Bu metodoloji kullanılarak meydana gelebilecek potansiyel eserler gerçekleştirmek için de önemlidir. Kimyasal eleklerde, lusiferaz daha çok transkripsiyon indüklenmesi ile daha lusiferaz proteinin stabilizasyonu ile yapay bir puanlama bileşikler için tanınıyor. Protein stabilizasyon eserler ekarte etmek için, biz diğer bazı promotör-lusiferaz yapılarının karşı hit tarandı ve promoter'lar ifadeyi yükseltilerek post-transkripsiyonel hareket ortaya herhangi bir isabet bulamadık. Bir başka potansiyel artefakt pGL4 vektör omurgasına bağlanan yerine bir transaktivasyon faktör olabilirSNCA promoter. Biz kapsamlı, bu sorunu önlemek için bağlayıcı siteleri transkripsiyon faktörü kaldırmak mutagenezlenir olmuştur pGL4 vektör istihdam. Bizim itibaren herhangi bir indüksiyonu için vektör omurga gerekli olup olmadığını değerlendirmek için, herhangi bir omurga yoksun SNCA-lusiferaz vektörü bölgeyi genişleten PCR için kullanılan ve ikincil deneyleri için bir haberci olarak doğrusal fragmanı kullanılmıştır. Biz tam plazmid muhabir ve bir istisna doğrusal omurga-ücretsiz yapısı arasında indüksiyon değerlerinde anlamlı bir fark bulunamadı. GATA2 plazmid raportör ile ~ 15 kat indüksiyonunu göstermiştir, ancak GATA2 indüksiyon bazıları omurga bileşenlerine bağlanma olabileceğini düşündürmektedir doğrusal raportör ile sadece yaklaşık 2.7 misli,.

Transkripsiyonel tespit etmek için diğer bir dizi yöntem tarif edilmiştir. Yaklaşık 30 yıl önce, transfekte raportör gen ekspresyonu üzerinden güçlü viral promoterler de cis-hareket eden kopyalama kontrol elemanlarının eşleme est oldu16 ablished. Bu yöntem, bazen uygun bir primer hücre hatları elde etmek ve transfect zor olduğundan "promotör dayak," hücre tipi özel yararlanıcı haritalama için lehine dışına düşmüş olarak adlandırılan ve bu çizgiler doğru geldikleri dokusunu temsil olmayabilir. Füzyon bir gen kütüphanesi ve belirli bir cis-hareket eden eleman arasındaki etkileşimi saptamak için bir deconstructed raportör sistem sağlayarak maya tek-hibrid sistemi 17 alt ettiği, bu sorunu. Yaklaşımımız kendi deconstructed tasarımda maya tek hibrid sistemine benzer, ancak sistemimizde biz daha çok maya, memeli hücreleri kullanan normal sentezleme klonlar yerine gen füzyonlarının kullanır, ve yan yana Quantitative sağlar: robotik istihdam Her bir gen için işlevsel bir test koordinatlar. Umut verici bir yöntem belirli bir genom bölgelerine bağlı proteinlerin belirlenmesi 18 tarif edilmiştir veriyor izole kromatin kesimleri (PiCh) arasında proteomiks adlandırılan, ancak sahip değil henüzbaşarılı bir şekilde tek-kopya bir insan genleri uygulanmıştır. Genom kromatin immünopresipitasyon (ChIP-seq ve yonga-çip) çalışmaları büyük bir ölçekte 19 sis etkili bölgeleri tanımlamak için kullanılır olmuştur. Bu yöntem, potansiyel olarak güçlü olmakla birlikte, Pic benzerleri gibi kolayca homojen bir kültüründe elde edilen olmayan özel nöron popülasyonu gibi hücre tipleri için daha az faydalı olabilir. Bizim valide isabetleri için ChIP veritabanlarını kontrol ettikten Ayrıca, ne zaman, onlar SNCA promoterine bu vuruşlardan bağlayıcı olmadığını göstermiştir. Biz geleneksel yonga 14 tarafından SNCA promoterine bu faktörlerin bağlanmasını göstermek mümkün olmuştur beri bunun nedeni açık değildir; ama mikrotertip okumalarını (ChIP-chip) kullanılarak ChIP çalışmalarında istihdam edilen tüm SNCA promotör bölgenin eksikliği nedeniyle olabilir. Bizim yöntem üretir doğrudan fonksiyonel okumalar birleştiğinde zaman Pic, ChIP-seq ve diğer proteomik yaklaşımlar dolayısıyla en yararlı olabilir.

Dual-Lusiferazdeneyleri ateşböceği istihdam ve Renilla lusiferazların yüksek verimli bir formata 20 çok sayıda hücre içi süreçleri incelemek için hassas bir yöntem sunuyoruz. Ateşböceği lusiferaz için bir hedef promotörün füzyon alfa-sinüklein 1,2 dahil olmak üzere, in vitro olarak çok sayıda hedeflerin transkripsiyonel düzenleme ve promoter yapısı, çalışma için kullanılmıştır. Bu ucuz bir alternatif geliştirilmiş güçlü bir sinyal sağlanır ve tahlilin aralığı (Şekil 6) içinde ticari olarak temin edilebilen doğrusal bir çift-lusiferaz reaktifler. Bizim yöntemi cömertçe NIH ve daha önce tarif edilen ticari olmayan çift-lusiferaz deneyi 21 Ron Johnson tarafından sağlanan bir protokole uyarlanmıştır. Firefly deney tamponu hücreleri lize ve ATP ve luciferase ™, ateşböceği lusiferaz alt-tabakalar. Bu deney, yaklaşık olarak 1 saatlik bir yarı-ömür (Şekil 7) olan bir ışıma tepki verir. Renilla tahlil tamponu firefl söndürüry sinyal ve uygun alt-tabaka (coelenterazine) sağlamaktadır. Renilla deney tamponu kendisinin hücreler lize edildi olmayacak ve Triton liziz tamponu ya da ateş böceği deney tamponu ile kombinasyon olarak kullanılmalıdır unutmayın. Bu kolayca, oda sıcaklığında çöktürüldü daha önce tarif edildiği Renilla tahlil tampon maddeleri, böylece biz sodyum sülfat elendiği ve% 60 sodyum pirofosfat miktarının azaldığı bulunmuştur. Bizim deney de PTC124'ün, deneyde ilave söndürme katkı ateşböceği lusiferaz 22 güçlü bir inhibitörü içerir. Islah aktivitesi, EDTA, NaCl, ve Renilla tamponunda pirofosfat tarafından sağlanmaktadır. Bu yeni formülasyonlar ile, ateş böceği faaliyetinin yaklaşık% 99,5 'i Renilla tamponu ile söndürülür. Her iki ateş böceği ve Renilla lusiferaz sinyallerinin yoğunluğu ve tekrarlanabilirliği hafif (4,6 ve 4,10 adımları) tamponların ilave edildikten sonra karıştırılarak geliştirilmiştir.

Bizim deneyim, tam bir inpGL4.10 in lfa-sinüklein promoter, belki de intron 2'de GC açısından zengin bir bölge ve karmaşık ikincil yapının, yükseltmek ve klon için benzersiz zordur. Dengesiz insertlerin klonlanması için optimize edilmiştir STBL4 yetkili hücreler, en başarılı olmuştur. Hatta bu önlemler şu, biz sık sık bir mutant kurtarıldı hangi E. coli genomik DNA yapısının 3 'ucu içine sokulmuştur. Bu mutant BamHI (doğru klonu 5.8 kb ve 2.8 kb karşı) ile sindirilmiş zaman yaklaşık olarak 5.8 kb, 4 kb bant oluşturur ve selektif tabakalarına daha büyük koloniler olarak görünür. 30 ° C ve hücre içerisine dikkatli bir büyüme düşüşler satürasyonu ulaşmasını engelleyen kültürleri, ama mutant geri kazanılması olasılığını ortadan kaldırmaz. Tüm restriksiyon dijest ile DNA preparatları ve, transfeksiyondan önce, jel elektroforezi saflığını doğrulanması önerilir.

Bu tarama protokolü kolay bir başka promoterler şekilde uyarlanmıştırd zaten hedef promotörü düzenleyen bilinen pozitif ve negatif kontroller genler kullanılarak, buna göre optimize edilmelidir. Çeşitli hususlar, raportör plasmidlerin klonlanması ve transfeksiyon için geçerlidir. Ateşböceği lusiferaz haberci plazmid içine hedef promoteri klonlama zaman, lusiferaz başlangıç ​​sitesi, hedef genin 'de translasyonel başlangıç ​​sitesi yaklaşık olmalıdır. Dual-Lusiferaz perdeler, genellikle plazmid omurgasının etkileri en aza indirmek için, örneğin, HSV-tk promotörü gibi, bir minimal destekleyicinin kontrolü altında Renilla plazmid yerleştirin. Ancak, bu promotör neden olduğu pozitif kontrol eden biri, böylece biz CMV promoterinin tercih olduğu bulunmuştur. Her bir haberci plazmid nispi miktarı deneysel olarak tespit edilmelidir ve her promoterinin konstitütif aktivitesi etkilenir. Ideal taban (transfekte edilmiş, ama indüklenmemiş) lusiferaz sayımları kütüphaneleri algılanmasını sağlamak için, en az on misli beş ile transfekte edilmiş hücrelerden alınan arka plan üzerinde olmalıdıry baskı altında genler ya da daha düşük bir sinyal ile sonuçlanır neden olan toksisitesi. Önceki tarama, Luminometreler arasında değişebilir ki, beklenen lusiferaz sayımı, her bir tayin doğrusal aralığı içinde olduğundan emin olun. (Bizim Renilla tahlilimizde doğrusal aralığının üst ucunda tipik olarak düşüş sayar unutmayın.) Dolayısıyla bu habercisinin az miktarda kullanılan, ateş böceği haberci plazmid kütüphane DNA oranının arttırılması daha yüksek indüksiyonu ile sonuçlandığını bulduk.

Transfeksiyon protokolü de optimize edilmelidir. Bu transfeksiyon göreceli kolaylığı için 293T hücreleri seçtik etkinliği bir santrifüjleme aşama (adım 3.5) ilavesi ile 50-kat artmıştır. Dopaminerjik hattı SY5Y fazla elimizdeki transfekte az 100 kat, ve, yukarıda ele alındığı gibi, aşın tarama yapmak için uygun olmayabilir olduğunu. Bizim deneysel olarak uygun deney süresi 48 saat olarak tespit edilmiştir, bu nedenle eden hücreler, düşük bir başlangıç ​​yoğunluğunda kaplandı,% 10-70 confluency hücreleri transfekte etmek için tasarlanmıştır Optifect kullanımını gerektirmektedir. Diğer hücre hatları, farklı başlangıç ​​yoğunluklarına ve farklı transfeksiyon tepkin maddeleri gerektirebilir. Biz (varsa transfeksiyonundan sırasında zehirlenmeye neden olabilir) antibiyotik eklemek için transfeksiyonundan sonra hücre ortamı değiştirmek için seçti. Bu bakteriyel kontaminasyon olasılığını azaltır, ancak, diğer sistemlere bu protokolü uyarlanırken, böylece bu adımın gerekliliği değerlendirilmelidir, malzeme (özellikle robot pipet uçları) de maliyetini artırmaktadır. Lusiferaz deneyleri, minimal optimizasyonu ile kullanılır, ancak farklı bir hücre tipi, yüksek verim, bu deneyi gerçekleştirmeden önce, hücreler, uygun bir Triton liziz tamponu ile lize doğrulamak olabilir. Triton X-100 coelenterazine otoflüoresanı neden olduğunu not edin. Bizim deneyde Renilla sinyali bu etkiyi değersizleştirmek için yeterince güçlü olduğunu, ancak diğer hücre türleri için bu tahlil optimize ederken, mi Triton X-100 hacimlerini sınırlamayaHücre liziz için gerekli Nimal miktar.

Biz, geçici bir çift-lusiferaz raportör sistemi ile transfekt edilmiş hücreleri kullanarak, alfa-sinüklein yeni transkripsiyon düzenleyici belirlenmesi için hızlı ve nispeten ucuz bir tarama yöntemi sunulmuştur. Bu protokol, diğer ilgi genleri hedef için kolayca değiştirilebilir ve aynı zamanda bu gibi lentivirüs üretimi 23 gibi yüksek verimli transfections gerektiren herhangi bir uygulama için adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu çalışma lisanslama BacMamreagents (ABD patent 5731182) elde gayrimaddi tarafından desteklenmiştir.

Acknowledgments

Bu DNA tarama kütüphanesinin hazırlanması için MGH DNA Core John Darga ederiz. Perkin Elmer Christopher Chigas bizim VVallac 1420 luminometrede için çok değerli bir destek sağladı. Steven Ciacco ve Agilent Martin Thomae Bravo robot için destek sağladı. Biz cömertçe dual-kızdırma lusiferaz tahlil protokolü sağlamak için NIH Ron Johnson ve Steve Titus teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent -
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
C–nzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10, (26), 3101-3109 (2001).
  2. Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113, (5), 426-431 (2003).
  3. Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, (31), 10907-10912 (2008).
  4. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388, (6645), 839-840 (1997).
  5. Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71, (3), 370-384 (2012).
  6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41, (12), 1303-1307 (2009).
  7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41, (12), 1308-1312 (2009).
  8. Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science. 276, (5321), 2045-2047 (1997).
  9. Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet. 364, (9440), 1169-1171 (2004).
  10. Chartier-Harlin, M. -C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet. 364, (9440), 1167-1169 (2004).
  11. Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease. Science. 302, (5646), 841 (2003).
  12. Ahn, T. -B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70, (1), 43-49 (2008).
  13. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93, (6), 2348-2352 (1996).
  14. Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
  15. Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2, (9), 1044-1051 (1982).
  16. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
  17. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  18. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
  19. Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5, (1), 127-136 (2007).
  20. Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356, (1), 94-99 (2006).
  21. Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, (9), 3585-3590 (2009).
  22. Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics