Rening och mikroRNA profilering av Exosomes härrör från blod och kultur Media

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Förekomsten av stabila mikroRNA (miRNA) i exosomes har genererat stort intresse som ett nytt sätt att kommunikationen mellan, för deras potentiella användbarhet som biomarkörer och som en väg för terapeutisk intervention. Här visar vi exosome rening från blod och kultur media följt av kvantitativ PCR för att identifiera miRNA som transporteras.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294, doi:10.3791/50294 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Stabila miRNA finns i alla kroppsvätskor och några cirkulerande miRNA skyddas från nedbrytning genom upptag i små blåsor som kallas exosomes. Exosomes kan smälta samman med plasmamembranet vilket resulterar i överföring av RNA och proteiner till målcellen. Deras biologiska funktioner inkluderar immunsvar, antigenpresentation och intracellulär kommunikation. Leverans av miRNA som kan reglera genuttryck i de mottagande cellerna via blodet har öppnat nya vägar för mål ingripande. Förutom att erbjuda en strategi för leverans av läkemedel eller RNA terapeutiska medel, kan exosomal innehållet fungera som biomarkörer som kan hjälpa vid diagnos, bestämma behandlingsalternativ och prognos.

Här kommer vi att beskriva förfarandet för att kvantitativt analysera miRNA och budbärar-RNA (mRNA) från exosomes utsöndras i blodet och cellodling. Renade exosomes kommer att karakteriseras med användning av western blot-analys för exosOMAL markörer och PCR för mRNA av intresse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) och immunogold märkning kommer att användas för att validera exosomal morfologi och integritet. Total RNA kommer att renas från dessa exosomes för att säkerställa att vi kan studera både mRNA och miRNA från samma prov. Efter validering RNA integritet genom Bioanalyzer, kommer vi utföra ett medium genomströmning kvantitativ realtids PCR (qPCR) för att identifiera exosomal miRNA med Taqman Low Density Array (TLDA) kort och gen studier uttryck för utskrifter av intresse.

Dessa protokoll kan användas för att kvantifiera förändringar i exosomal miRNA i patienter, modeller gnagare och cellodlingsmedia före och efter farmakologisk intervention. Exosomal innehåll varierar beroende på källan av ursprung och de fysiologiska tillstånd av celler som utsöndrar exosomes. Dessa variationer kan ge insikt om hur celler och system hantera stress eller fysiologiska störningar. Vår representativa data visar variations i miRNA närvarande i exosomes renade från mus blod, människoblod och mänskliga cellodling.

Här kommer vi att beskriva förfarandet för att kvantitativt analysera miRNA och budbärar-RNA (mRNA) från exosomes utsöndras i blodet och cellodling. Renade exosomes kommer att karaktäriseras med western blot-analys för exosomal markörer och PCR för mRNA av intresse. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) och immunogold märkning kommer att användas för att validera exosomal morfologi och integritet. Total RNA kommer att renas från dessa exosomes för att säkerställa att vi kan studera både mRNA och miRNA från samma prov. Efter validering RNA integritet genom Bioanalyzer, kommer vi utföra ett medium genomströmning kvantitativ realtids PCR (qPCR) för att identifiera exosomal miRNA med Taqman Low Density Array (TLDA) kort och gen studier uttryck för utskrifter av intresse.

Dessa protokoll kan användas för att kvantifiera förändringar i exosomal miRNA in patienter, modeller gnagare och cellodlingsmedia före och efter farmakologisk behandling. Exosomal innehåll varierar beroende på källan av ursprung och de fysiologiska tillstånd av celler som utsöndrar exosomes. Dessa variationer kan ge insikt om hur celler och system hantera stress eller fysiologiska störningar. Vår representativa data visar variationer i miRNA närvarande i exosomes renade från mus blod, människoblod och mänskliga cellodling

Introduction

Korta noncoding miRNA modulera genuttryck genom bindning till mål-mRNA. Seed sekvenskomplementaritet av ~ 7 baspar gör miRNA att binda till mål-mRNA resulterar i hämning av översättning eller minskning av stabiliteten hos mRNA, som båda kan leda till minskat uttryck av målproteinet 1. Forskning under det senaste decenniet har entydigt visat en grundläggande roll för miRNA i att medla cellulära funktioner. Det har också skett en betydande ansträngning för dissekera miRNA medierade molekylära förändringar som ligger bakom olika sjukdomar 2,3. Dessutom banade nyligen identifiering av stabila miRNA i kroppsvätskor 4-6 vägen för deras användning som nya biomarkörer som lämpar sig för klinisk diagnos.

Ett läge av miRNA transporter i kroppsvätskor är via exosomes, små blåsor som bär mRNA, proteiner, medlare lipid och miRNA till recipientceller via systemiska blod cirkulerarion 7-14. Detta resulterar i modulering av genuttryck i mottagarceller och representerar en ny mekanism av cellulär kommunikation. Till exempel kan celler modulera immun-reglerande processer genom att utsöndra och / eller absorberande exosomer innehållande biomolekyler involverade i inflammation såsom interleukin-1β (IL1β), tumörnekrosfaktor-α (TNFa), transformerande tillväxtfaktor-β5 (TGFβ5), och de miRNA som reglerar dessa gener 13. Som avvikande miRNA uttryck är ett vanligt inslag i en mängd olika mänskliga sjukdomar, dessa molekyler ger nya spännande möjligheter för upptäckt och validering av nya terapeutiska mål 2.

Cirkulerande miRNA finns i alla kroppsvätskor och det är känt att sammansättningen av exosomer är olika baserat på källcellerna från vilka de släpptes. Alltså de erbjuder en väg att studera fysiologisk status av cellerna och hur cellerna alter signalerar ävents som svar på stress inklusive sjukdomar. Studera förändringar i exosome sammansättning kan ge insikt i signaltransduktion och undersöka deras potentiella användbarhet som biomarkörer eller terapeutiska vägar ingripande.

Här kommer vi att visa rening av exosomes från flera källor baserade på publicerade protokoll. Dessa exosomes kommer att användas för RNA isolering följt av qPCR att identifiera och mäta nivåerna av miRNA närvarande i exosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment med blodprov från människa och gnagare avrättades i enlighet med alla relevanta riktlinjer, föreskrifter och tillsynsmyndigheter. Mänskliga försökspersoner rekryterades efter att informerat samtycke som har godkänts av Drexel University College of Medicine Institutional Review Board och alla förfaranden för studier utförda med hjälp av djur godkändes av Drexel s Institutional Animal Care och användning kommittén.

Ett. Exosome Rening från Blood (~ 5,5 tim)

TIPS

  • Vi resuspendera exosomes från ett rör av blod (~ 10 ml blod och ~ 2 ml musblod) i 300 pl RNA lyseringsbuffert från Mirvana miRNA isolering kit.
  • För att rena exosomes från cellodlingsmedia, media centrifugerades vid 500 xg under 10 minuter för att avlägsna celler och även filtreras genom ett 0,22 ìm filter efter centrifugering vid 12000 x g.. Den exosome rening från cellodlingsmedierkräver inte en spädning i PBS, PBS tvätt eller andra ultracentrifugering steg.
  • Om de renade exosomes kommer att användas för proteomik studierna ledde tillägg av en sackaros-steggradient centrifugering efter ultracentrifugering steg kommer att minska mängden proteinaggregat och föroreningar 15.
  • Den observerade morfologi exosomes kan variera beroende på både käll-och processteg för TEM. Vi observerade inte den skålformade morfologi för exosomes som tidigare har tillskrivits skillnader i provbearbetning 9,15. Våra TEM-bilder, inklusive immunoguld märkning liknar tidigare rapporter från olika källor, inklusive blod, galla och kortikala kultur härstammar exosomes 9,16,17.
  1. Invertera EDTA belagda röret innehållande blodet 5x och plats upprätt vid rumstemperatur under 10-60 min.
  2. Centrifugera vid 2000 xg under 15 minuter vid 4 ° C. Samla det översta lagret, plasman, i 15 ml rör och hålla på is.
  3. Späd vätska med en lika stor volym PBS. Centrifugera 30 min vid 2000 xg vid 4 ° C.
  4. Överför till centrifugrör, tillsätt 1X PBS under en total volym av 24 ml, och centrifugera 45 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C.
  5. Överföring till ultracentrifugrör och centrifugera 2 h vid 110.000 xg vid 4 ° C.
  6. Återsuspendera pelleten i PBS och centrifugera en timme vid 100.000 xg vid 4 ° C.
  7. Återsuspendera pelleten i lämplig buffert (RNA lyseringsbuffert).
  8. Återsuspendera i PBS eller RIPA-buffert för elektronmikroskopi och Western blot-analys respektive.

2. RNA-rening med användning av en modifierad Mirvana Kit miRNA Isolering (~ 1 timme)

TIPS

  • Förbered området för att isolera RNA genom att bära personlig skyddsutrustning (PPE), avtorkning och pipetter med RNas Zap, och använder sterila filter tips och rör.
  • Lägga till en on-column DNas-behandling avlägsnar spår av DNA som kan vara närvarande. Beroende på källan till exosomes, har DNA rapporterats vara frånvarande i exosomes renade från vissa källor, inklusive mus och mänskliga mast cellinjer 8 men kromosomala DNA-sekvenser har påvisats i exosomes renade från media av odlade hjärtmuskelceller 18.
  • Vi minskade volymen av tvättlösning 1-350 pl (Steg 2.4 nedan) för att leverantören tillhandahåller bara tillräckligt tvättlösning 1 för en 700 ul tillägg. Om volymen inte reduceras det inte finns tillräckligt med lösning kvar för att använda hela kitet. Kvarvarande steg utfördes enligt tillverkarens rekommendationer.
  1. Lägg 1/10 volume av miRNA Homogenat Tillsats (30 | il) och inkubera på is under 10 min.
  2. Extrahera med en volym av syra-fenol: kloroform lika med den initiala lysatet volym. Centrifugera och återvinna den övre fasen i ett nytt rör.
  3. Lägg 1,25 volymer 100% etanol (375 pl). Vortex. Ansök till filterpatron och centrifugera 15 sek vid 10000 x g..
  4. Tillsätt hälften av rekommenderade volymen miRNA Tvättlösning 1 (350 | il) och centrifugera 15 sekunder vid 10.000 x gav.
  5. Tillsätt 10 | il DNas 1 till 70 RDD l buffert (Qiagen) för varje prov. Tillsätt 80 | il till kolonn och inkubera 15 min vid rumstemperatur.
  6. Lägg Tvättlösning 1 (350 | il) och centrifugera 15 sekunder vid 10.000 x gav.
  7. Lägg Tvättlösning 2/3 (500 | il) och centrifugera 15 sekunder vid 10.000 x gav. REPEAT.
  8. Eluera med 40 | il 95 ° C nukleasfritt H2O
  9. Bestäm koncentrationen av RNA och späd RNA till 100 ng / ul.

Tre. miRNA Profilering av Exosomes från Blood Använd Taqman Low Density Array (TLDA) Kort (~ 6,5 tim)

TIPS

  • Förbered området för att isolera RNA genom att bära skyddsutrustning, avtorkning och pipetter med RNas Zap, och använder sterila filter tips och rör.
  • Pre-amplifiering (pre-amp) steg rekommenderas för 1-350 ng RNA (350-1,000 ng prover inte kräver pre-amp steget efter cDNA-syntes). Det är viktigt att avgöra huruvida pre-amp är nödvändigt för ditt prov eftersom du måste behandla alla prover på lika villkor. Pre-amp steget adderar kostnad och CT-värdena har en lägre acceptabel cut off (32 istället för 40).
  • Det är nyttigt att förbereda cDNA reaktionen i remsor rör istället för en tallrik beroende på antalet kort som kan köras på en enda dag. Detta kommer att minimera frysning-tining av cDNA prover som inte kommer att behandlas samma dag.
  • Exosomes samlats in från olika källor har diffehyra mängder RNA. Detta protokoll tillåter maximalt 3 | il RNA-mall för cDNA-syntesreaktionen. Beroende på källan, kanske mängden exosomal RNA som kan isoleras begränsade. Medan en typisk vävnad skulle ge tillräckligt med RNA som cDNA skulle göras från 100 ng RNA i 3 il volym, exosomes från blod eller cellodling innehåller ofta mindre RNA och cDNA måste göras från mindre utgångsmaterial. Musblod exosomes innehåller högre halter av RNA och minst 100 ng i 3 pl kan erhållas.
  1. För att framställa cDNA från renat RNA genom användning megaplex Pools omvänt transkriptas primers (pool A och pool B innehåller primers för de miRNA på microfluidic kort Array A och B), tina reaktionskomponenterna på is.
  2. Label två RNase-fri 1,5 ml rör för RT reaktion med pool En primers eller Pool B primers och lägga till komponenter i diagrammet ordning. Lägg till minst en extra volym av komponenter för 2 eller fler reaktioner eller göra en master mix som rekommenderat av than försäljaren.
RT-reaktionen Komponent Komponent Koncentration Volym för 1 prov (totalt V / prov = 4,5 l)
Nukleasfritt vatten 0,20 | il
Megaplex RT-buffert (10X) 1X 0,80 | il
dNTPs (100 mM) 4,4 mM 0,20 | il
MgCl2 (25 mM) 5 mM 0,90 | il
RNase Inhibitor (20U/μl) 2 U 0,10 | il
Megaplex RT Primers A eller B (10X) 1X 0,80 | il
MultiScribe omvänt transkriptas 75 U 1,50 | il
  1. Invertera rör 6 gånger och centrifuge kortfattat. Sedan, pipett 4,5 pl RT reaktionsblandning i MicroAmp 8-rör Strips eller en 96-väl MicroAmp optisk tryckplattan.
  2. Tillsätt 100 ng av RNA och justera volymen till 3 il med DEPC behandlat vatten eller tillsätt 3 mikroliter totalt RNA, rör om med pipett spets, och försegla rören eller platta. Snurra snabbt och inkubera på is i 5 min.
  3. Ladda reaktionen i PCR-maskinen och köra det under följande villkor (vilket rekommenderas av Applied Biosystems Megaplex Pools protokoll):
Stage Temp Tid
Cycle (40x) 16 ° C 2 min
42 ° C 1 min
50 ° C 1 sek
Håll 85 ° C 5 min
Håll 4 ° C
  1. Förvara cDNA vid -20 ° C (bra för minst en vecka) eller fortsätta att pre-Amp steg som kan lagras i en vecka.
  2. Tina Preamp primers för pool A och pool B på is och invertera att blanda. Swirl Taqman Pre-Amp mästare blanda och hålla på is också.
  3. Följ tabellen tillsats av minst en extra volym av komponenter för två eller flera reaktioner eller göra en huvudblandning såsom rekommenderas av säljaren.
Pre-Amp Reaction Component Volym för 1 prov
Nukleasfritt vatten 7,5 | il
Taqman Förstärkarnivå Master Mix (2X) 12,5 | il
Megaplex förförstärkare Primers A eller B (10X) 2,5 | il
  1. Pipettera 2,5 pl RT product in MicroAmp 8-rör Strips eller en 96-brunnars MicroAmp optisk reaktionsplattan och dispensera 22,5 pl Förstärkarnivå reaktionsblandningen i varje brunn.
  2. Täta plattan, inkubera på is 5 min och sedan ladda provet i PCR-maskin. Kör på följande villkor.
Stage Temp Tid
Håll 95 ° C 10 min
Håll 55 ° C 2 min
Håll 72 ° C 2 min
Cycle (12x) 95 ° C 15 sek
60 ° C 4 min
Håll 99,9 ° C 10 min
Håll 4 ° C
  1. Efter det förförstärkare reaktionen är avslutad, kortfattat centrifugera rören eller platta och sedan lägga till 75 | il 0,1 X TE pH 8,0 till varje brunn eller rör.
  2. Täta och mixa och snurra kort. Förvara den utspädda produkten i en vecka vid -20 ° C eller fortsätta att ladda plattan.
  3. Kombinera följande i en RNas-fri 1,5 ml rör på is.
Komponent Volym för 1 kort
Taqman Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) 450 | il
Utspädd Förförstärkar produkt 9 | il
Nukleasfritt vatten 441 | il
  1. Vänd röret för att blanda och centrifugera en kort stund. Fördela 100 l PCR-reaktionsblandningen i varje port Taqman MicroRNA Array kort.
  2. Centrifugera kort 2 x 1.000 xg i 1 minut. Tillslut kortet och köra det genom att använda mallen med primers i Applied Biosystems handboken och de 384 väl Taqman Low Density inställningar Array. Vi använder Applied Biosystems 7900HT Snabb Real-Time PCR System.

4. mRNA Analys av Taqman (~ 1,5 tim)

  1. För att förbereda qPCR reaktion, blanda reaktionskomponentema i ordning i diagrammet. Samtliga prover kommer att analyseras med primer prober för genen av intresse samt 18S rRNA som normaliserare genen.
Taqman Reaktion Component Volym för 1 prov
Nukleasfritt vatten 7 il (justera utifrån enskilt prov)
Taqman Snabb Master Mix (2X) 10 pl
Taqman Primer prober (20x) 1 il
cDNA från 100 ng RNA 2 & mu, L (justera utifrån enskilt prov)
  1. Kör 96 brunnar med Fast 96-väl blocket som rekommenderas av tillverkaren (Applied Biosystems 7900HT Snabb Real-Time PCR System).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter isolering av exosomer från blod eller cell odlingsmedier, kan renheten hos de exosomes testas genom elektronmikroskopi (EM) och western blöt (fig. 1A och 1B). Vi bekräftade våra exosome beredningar från olika källor med EM och western blöt med användning av flera antikroppar. Figur 1A visar EM bilder bekräftar att exosomes är intakta med en diameter på ~ 30 -100 nm och innehåller CD81 genom immunoguld märkning. Vanligen använda exosomal markörer är Hsp70 och tetraspannin familj glykoproteiner CD63, CD81 och CD9 14. Efter att ha bekräftat integriteten av de renade exosomes, utförde vi western blöt för Hsp70 i figur 1B och visade att exosomes innehåller Hsp70 medan enbart medium (negativ kontroll) inte gör det. Den Bioanalyzer spår visar att exosomes isolerade från RAW cellodlingsmedier innehålla en mångfald RNA, men inte innehåller stora mängder av ribosomala RNA som är typiska i RNA från helacell (Figur 1C). Figur 1D visar qPCR analys av mRNA från helblod och exosomes härrör från blod. Vi har möjlighet att isolera 500 ng exosomal RNA från ~ 10 ml humant blod med användning av Mirvana kit miRNA isolering. QPCR resultat indikerar förekomst av mRNA som kodar för TNF och vascular endothelial growth factor A (VEGFA) i renat exosomes liksom i helblod.

Förutom qPCR för genuttrycksstudier, totalt RNA användes också för miRNA profilering. Mirna TLDA kortet version 3.0 innehåller primer prober för ~ 758 miRNA inklusive den endogena kontrollen RNA U6. Med tillägget av den pre-amplifiering steg, rekommenderar säljaren 30 ng RNA för att köra ett TLDA kort. Detta är användbart för att analysera RNA från exosomes renade från serum eller humant blod, som typiskt har lägre utbyten än de som renades från musblod. Den miRNA analys visas i Figur 2 utfördes med 250 ng RNA från musblodexosomes och 15-30 ng exosomal RNA från blod eller aortaendotelceller (HAOEC). Våra resultat anger närvaron av 89 miRNA i exosomer samlats in från musblod, 209 miRNA i mänskligt blod exosomer, och 199 miRNA i exosomer från humana cellodlingsmedia. Representativa data för sex miRNAs visas som Delta Ct normaliserat till den endogena U6-RNA för gnagare blod (Figur 2A), humant blod (figur 2B) och HAOEC cellodling media (figur 2C). Medan miR-126 och miR-200c var frånvarande i exosomes från gnagare blod eller HAOEC media respektive de återstående fyra miRNAs är närvarande i samtliga tre prover i varierande mängder. Relativt exosomes renade från cellodlingsmedier, MIR-223 uttrycks i högre nivåer i exosomes från människa och gnagare blodprov.

Figur 1
Figur 1. Transmission elektronmikroskopi (TEM), western blot analys och QRT-PCR för mRNA med exosomes renade från olika källor. A) TEM bild av musblod exosomes suspenderade i 1% glutaraldehyd (vänster) eller RAW cellhärlett exosomes återsuspenderade i 4% paraformaldehyd, märkt med 10 nm guld och kanin-anti CD81 (höger) och fläckig på Formvar kolbelagda galler för EM . analys (skala bar = 100 nm) B) Western analys av HSP70 i exosomes renade från musblod eller exosome-fria medier + / -. 24 timmars inkubering med RAW 264.7 murinceller och suspenderades i RIPA buffert C) Bioanalyzer analys av total-RNA renat från exosomes härledda från RAW 264.7 cellodlingsmedia D) Totala RNA renade från helblod och exosomer erhållet från ett representativt mänsklig kontroll användes för att jämföra expressionsnivåerna av TNFa och VEGFA. Klicka häratt visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. Relativ Expression av miRNA fraktion som finns i exosomes. Tröskel cykel (CT-värde) är ett relativt mått på koncentrationen av en enskild miRNA i PCR-reaktionen och lägre CT-värde indikerar högre uttryck. qPCR värden för sex detekterbara exosomal miRNA normaliserades till U6-RNA och delta-Ct-värden plottas för exosomes från tre källor. Ett negativt värde anger högre uttryck i denna figur. Exosomes från gnagare blod (A) och humant blod (B) uttryckte HSA-miR-223 på högre nivåer än kontrollen, medan exosomes från HAOEC cellodling media (C) uttryckt HSA-miR-223 på lägre nivåer än kontroll. HSA-miR-226 var frånvarande från exosomes gnagare blod och HSA-miR-200c var frånvarande från HAOEC exosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll, visar vi en kvantifiering av miRNA och mRNA från exosomer renade genom differentiell centrifugering från blod-och odlingsmedia. Exosomes har olika komponenter beroende på deras ursprung och är involverade i ett antal biologiska funktioner, inklusive immunförsvaret, antigen presentation, intracellulär kommunikation och överföring av RNA och proteiner 9,11,12,19,20. Medan storlek och form är en avgörande faktor för exosome renhet, ett antal artiklar som visar EM data exosomes indikerar att dessa blåsor kan variera i storlek och morfologi grundas på källan varifrån de utsöndras, liksom den metod som används för fixering och bildbehandling 9 , 15. Den accepterade storleken för exosomes av 30-100 nm är ett genomsnittligt intervall som innehåller en liten population av exosomes med en större diameter beroende på källa 21,22, en anledning till att flera metoder används för att validera exosomal renhet. Utsöndrade miRNA har många erforderlig features av goda biomarkörer 23 förutom att vara potentiella terapeutiska mål för olika sjukdomar 2,3,24. Denna reningsmetod ger en icke-invasiv sätt att karaktärisera temporala biologiska förändringar i exosomal innehåll från en mängd olika kroppsvätskor medan miRNA profilering av qPCR ger en omfattande översikt av miRNA innehåll 2. Över 4.500 proteiner, 1,639 mRNA, 764 miRNA och 194 lipider är kända för att associera med exosomes 25 ( www.exocarta.org ) och i vissa fall har förändringar i nivåerna av dessa biomolekyler redan kopplade till sjukdomstillstånd. I våra studier hade exosomes renade från humant blod många miRNA gemensamt med exosomes renade från media från odlade humana cellinjer men betydande skillnader från exosomal miRNA funna i musblod. Även om det finns exempel på miRNA som riktar enda mRNA, många miRNA fungerar att delvis minska nivåerna av multiple mål leder till en stark fysiologisk respons. Characterizing både mRNA och miRNA som bor i exosomes ger unik inblick i exosome-medierad informationsöverföring och rollen av cirkulerande miRNA i att medla förändringar i genuttryck. Rening och karakterisering av exosomer från en mängd olika källor kommer att vara fördelaktig i att identifiera molekylära signaturer förknippade med dessa sekretoriska vesiklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av medel från Rita Allen Foundation till Seena Ajit. Författarna vill tacka Erika Balogh och Dr Soumitra Ghoshroy från University of South Carolina elektronmikroskopi Center för instrumentets användning, vetenskapligt och tekniskt stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA coated vacutainer (10 ml tubes) BD Diagnostics 366643 For exosome purification from human blood
EDTA coated vacutainer (2 ml tubes) BD Diagnostics 367841 For exosome purification from mouse blood
PAXgene Blood RNA Tube BD Diagnostics 762165 For miRNA isolation from total blood
miRVana microRNA isolation kit Ambion AM1561
Acid-Phenol: CHCl3 Ambion 9721G
DNase 1 Qiagen 79254
TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG Applied Biosystems 4326614 For TLDA cards
Megaplex RT rodent Pool Set v3.0 Applied Biosystems 4444746
Megaplex preamp rodent Pool set v3.0 Applied Biosystems 4444747
Taqman Array Rodent MicroRNA A+B set V3.0 Applied Biosystems 4444909
Megaplex RT Human Pool set V3.0 Applied Biosystems 4444745
Megaplex Preamp human pool set v3.0 Applied Biosystems 4444748
Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 Applied Biosystems 4444913
Taqman MicroRNA RT kit Applied Biosystems 4366596
Taqman fast universal PCR master mix Applied Biosystems 4366072 For mRNA qRT-PCR
Tumor necrosis factor (primer probe) Applied Biosystems Hs01113624_g1
Vascular endothelial growth factor A (primer probe) Applied Biosystems Hs00900055_m1
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR Thermo Scientific K1642 For mRNA
HSP70 antibody Abcam ab94368 For western blot
Anti-rabbit IgG-Gold Sigma G7402 For electron microscopy
Rabbit-anti CD81 Sigma SAB3500454
Nickel 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Ni
Copper 300 mesh carbon formvar grids Electron Microscopy Sciences FCF300-Cu
Table 1. Table of specific reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  2. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  3. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
  4. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
  5. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
  6. Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148 (2008).
  7. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282 (2011).
  8. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
  9. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  10. Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
  11. Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. (2011).
  12. Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
  13. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
  14. Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22 (2006).
  16. Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
  17. Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
  18. Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653 (2012).
  19. Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
  20. Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
  21. El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
  22. Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
  23. Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. (2011).
  24. Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
  25. Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).

Comments

1 Comment

  1. You suggest that Pre-amplification (pre-amp) step is recommended for samples with 1-350 ng RNA, but what is the minimum amount of miRNA needed not to use pre-amp? (miRNA can be specifically isolated and quantified using small RNA chip from AGILENT).

    Reply
    Posted by: Tannia G.
    September 10, 2013 - 7:15 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics