مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا الإجراء ينتج الخلايا العصبية الدماغ الانتهائي من خلال الذهاب من خلال نقاط التفتيش التي هي مماثلة لتلك التي لوحظت خلال التنمية البشرية. يسمح للخلايا للتمييز بشكل عفوي، ويتعرض لعوامل التي تدفع بهم نحو النسب العصبية، ومعزولة، وعلى ومطلي coverslips للسماح التمايز النهائي والنضج.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

هنا، وقد وصفت إجراء تدريجي لتوليد الخلايا العصبية بكفاءة الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة (الأمنية). وبدأت عملية التمايز عن طريق كسر الأمنية الإنسان في كتل التي محاصرة لتشكيل المجاميع عند وضع الخلايا في ثقافة التعليق. ثم تزرع في وسط المجاميع hESC من أيام 1-4 ليسمح لتمايز عفوية. خلال هذا الوقت، والخلايا لديها القدرة على التحول إلى أي من الطبقات الجرثومية الثلاث. من أيام 5-8، وتوضع الخلايا في وسيلة تحريض العصبية لدفعهم إلى نسب العصبية. حول يوم 8، ويسمح للخلايا لوحات تعلق على 6 جيدا وتفرق خلالها خلايا عصبية ظهارية شكل. يمكن عزل هذه الخلايا الظهارية العصبية في يوم 17. ويمكن بعد ذلك أن تبقى الخلايا كما neurospheres حتى جاهزة للمطلي على coverslips. باستخدام وسيلة أساسية دون أي عوامل منشئ للذنب، وخلايا عصبية ظهارية هي specifieد السلائف في الدماغ الانتهائي، والتي يمكن بعد ذلك أن يفرق الى مزيد من الأسلاف الدماغ الانتهائي الظهرية والخلايا العصبية الجلوتاميرجي بكفاءة. وعموما، نظامنا يوفر أداة لتوليد الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الإنسان للباحثين لدراسة تطوير هذه الخلايا العصبية والأمراض التي تؤثر عليهم.

Introduction

الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (الأمنية)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs)، لديها القدرة على توليد كل نوع من الخلايا في الجسم، بما في ذلك الخلايا العصبية 1-3. تمايز الخلايا العصبية الموجهة من الأنواع الفرعية المختلفة من شركات الأمن الخاصة الإنسان هو مفتاح لتطبيق هذه الخلايا في الطب التجديدي. توليد الخلايا العصبية الوظيفية الأنواع الفرعية خلال التنمية عملية معقدة تنطوي على تحريض النسب العصبية، مواصفات الأسلاف الإقليمية على طول محور rostro-الذيلية، والتفريق بين أنواع الخلايا العصبية بعد الإنقسامية من الأسلاف الإقليمية 4،5. ابتداء من عام 2001، تم إنشاء عدة أنظمة لتوليد نسب العصبية من hESCs، التي وفرت منصة للجيل اللاحق للأنواع فرعية العصبية 6،7. استنادا إلى المبادئ التنموية، وأنواع الخلايا العصبية عديدة مثل الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري 8-12، DOP الدماغ المتوسطالخلايا العصبية aminergic 13-15، وخلايا الشبكية العصبية 16،17 تم تحديد كفاءة من الإنسان الأمنية الخاصة. وقد تم ذلك من خلال تطبيق morphogens الحرجة التي تعتبر هامة لتحديد هذه الأنواع خلال الخلايا العصبية في الجسم الحي التنمية. كما تم وضع بروتوكولات أخرى لتعزيز التفريق بين الخلايا العصبية في hESCs باستخدام عوامل إضافية مثل 18-20 جزيئات صغيرة أو عن طريق زراعة بالتعاون مع أنواع الخلايا الأخرى للمساعدة في تعزيز التمايز 21.

ودرجة عالية من التطور والقشرة المخية الحديثة الإنسان يحتوي على العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية التي الجلوتاميرجي تلعب دورا هاما في التعلم، والذاكرة، والإدراك وظيفة 22،23. الخطوة الأولى في توليد الخلايا العصبية في الثقافة الجلوتاميرجي هو تحديد الخلايا الاصلية الدماغ الانتهائي. مجموعة يوشيكي Sasai لاول مرة في المفاضلة الموجهة السلائف الدماغ الانتهائي من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس (mESCs) باستخدام المصل خالية suspensioن الثقافة في وجود DKK1 (الذي يثبط إشارات WNT) وكذلك LeftyA (الذي يثبط إشارات العقدي) 24. في وقت لاحق، وأفادت عدة مجموعات من بينها وفدنا أيضا مواصفات السلائف من الدماغ الانتهائي الأمنية الإنسان في المصل 25-27 المتوسطة الحرة. الجيل السلائف من الدماغ الانتهائي الأمنية الإنسان لا تتطلب استخدام morphogens الخارجية وكفاءة في توليد هذه السلائف أعلى من ذلك بكثير من mESCs 26،27. هنا، وقد وصفت نظام محدد كيميائيا لتحريض العصبية التي أنشئت بشكل جيد من قبل مجموعة تشانغ 7. بدون إضافة عوامل خارجية منشئ للذنب، يولد هذا البروتوكول بكفاءة السلائف من الدماغ الانتهائي الأمنية الإنسان 27. ويمكن بعد هذه الأسلاف تكون متباينة في ظهري أو بطني الأسلاف من خلال تنظيم الإشارات من القنفذ سونيك WNT و(SHH). أسلاف الظهرية يمكن التفريق الى مزيد من الخلايا العصبية ه الجلوتاميرجيfficiently 27. وبالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول أيضا يعمل بشكل جيد لتوليد الخلايا العصبية الجلوتاميرجي من iPSCs الإنسان 28، والذي يسمح لتوليد المريض محددة الخلايا العصبية التي يمكن استخدامها لاستكشاف آلية العمل وكذلك العلاجات المحتملة لمجموعة كبيرة من الأمراض . وعلاوة على ذلك، لدينا نظام يوفر أيضا منصة لاستكشاف التنمية وتحديد أنواع الخلايا العصبية في الدماغ الانتهائي متنوعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جيل من الإنسان المجاميع افرة القوة الخلايا الجذعية (D1-D4)

  1. يتم استزراع خلايا الجذعية المحفزة على الماوس الجنينية مغذيات (MEF) الخلايا الليفية في حضور المتوسطة hESC تستكمل مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF، 4 نانوغرام / مل). بعد 5-7 أيام في الثقافة، عندما المستعمرات هي كبيرة ولكن لا تزال غير متمايزة، انهم على استعداد لاتخاذ الخطوة التالية.
  2. ينبغي أولا الحل انزيم تكون مستعدة. في أنبوب 50 مل، حل dispase (أو كولاجيناز) بتركيز ملغ / 1 مل في DMEM/F12 المتوسط. وبما أن هذه الحلول على أفضل وجه عندما ارتفعت درجة حرارة المزيج، ضع أنبوب يحتوي على انزيم والمتوسطة إلى 37 درجة مئوية لمدة حمام الماء 10-15 دقيقة ثم تعقيم باستخدام عامل تصفية Steriflip.
  3. نضح قبالة المتوسطة من الخلايا، وشطف لهم DMEM/F12، ونضح قبالة هذا أيضا. إضافة 1 مل من كل بئر إلى dispase ومكان في الحاضنة لمدة 3-5 دقيقة لhESCs (ما يصل إلى 10 دقيقة للiPSCs). نظرة على الخلايا تحت المجهر، وعندماحواف عقص قليلا / تبدو أكثر قتامة قليلا، والخلايا على استعداد لاتخاذ الخطوة التالية. فمن الأفضل للتحقق من الخلايا بعد 3 دقائق ووضعها من جديد في إذا لزم الأمر. عند استخدام هذا البروتوكول لأول مرة، فمن الأفضل أن تبدأ مع لوحة واحدة فقط من الخلايا في وقت واحد كما أنه من المهم لإزالة الخلايا من dispase في أسرع وقت ممكن.
  4. نضح قبالة dispase من الخلايا. بلطف (الخلايا هي ضعيفة جدا في هذه المرحلة وسوف تؤتي ثمارها بسهولة من لوحة نسبيا) إضافة 1.5 مل من المتوسط ​​إلى DMEM/F12 كل بئر من أجل شطف dispase. نضح قبالة DMEM/F12 وإضافة 1.5 مل من المتوسط ​​hESC إلى كل بئر.
  5. لفصل وتفتيت الخلايا، ضع غيض من ماصة الزجاج 10 مل نحو الزاوية اليمنى السفلي من بئر (لمس الخلايا) ونقل ماصة صعودا وهبوطا (عموديا) - ويجب أن يكون ستوك الصاعد على مقربة إلى السكتة الدماغية إجراءات الهبوط. مرة واحدة يتم الوصول إلى الجانب الآخر من البئر، كرر في خيمة الأفقي ction.
  6. مرة واحدة كل من الخلايا في التعليق، ووضعها في أنابيب وأجهزة الطرد المركزي 15 مل في 200 XG لهم لمدة 2 دقيقة. يجب أن يكون هناك بيليه الخلايا في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح قبالة المتوسطة من فوق بيليه.
  7. حجم الخلية قارورة الثقافة التي ينبغي أن تستخدم للحفاظ على المجاميع في يتوقف على كمية من الخلايا الأصلية. ل6 آبار (1 وحة) من hESCs، وتعامل احدة غير زراعة الأنسجة قارورة T75 ينبغي أن تستخدم مع 50 مل من المتوسط ​​hESC. نقل الخلايا من الخطوة 1.6 إلى القارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية.
  8. من أجل التخلص من الحطام الخلية، ينبغي استبدال الخلايا والمتوسطة حوالي 12 قارورة ساعة في وقت لاحق. للقيام بذلك، ضع كافة الخلايا / المتوسطة في أنبوب 50 مل، وتدور الخلايا أسفل (200 x ج لمدة 2 دقيقة)، ونضح قبالة المتوسطة من العمر. المقبل، إضافة 50 مل من المتوسط ​​hESC جديدة للخلايا، ومكان في قارورة T75 الجديدة. ويمكن بعد ذلك أن يكون الطعام اليومية الخلايا بعد هذا الإجراء نفسه (حتى يوم 5).

SS = "jove_title"> 2. خلايا عصبية ظهارية تحريض (D5-D17)

  1. نقل الخلايا / متوسطة إلى أنبوب 50 مل، وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 2 دقيقة في ز × 200. المقبل، نضح قبالة طاف، ونقل الخلايا إلى (ثقافة غير الأنسجة المعالجة) قارورة T75 الجديدة مع 50 مل من المتوسط ​​الحث العصبي (NIM).
  2. مرة واحدة كانت الخلايا في NIM، ينبغي الاستعاضة نصف المتوسط ​​كل يوم. ينبغي أن تصبح كبيرة بما يكفي المجاميع إلى حيث أنها سوف تنزل الى القاع من أنبوب 50 مل المخروطية من تلقاء نفسها بعد بضع دقائق (لا يطلب الطرد المركزي). بعد 2-3 أيام في NIM (D7-D8 الكل)، ينبغي أن تكون على استعداد لخلايا وحة. ويمكن استخدام Laminin أو مصل بقري جنيني (FBS) للمساعدة في الخلايا نعلق على لوحات.
  3. التعامل مع عدد من لوحات زراعة الأنسجة 6 جيدا أن هناك حاجة تعتمد على كثافة الخلايا كما ينبغي تجميع كل تكون قادرة على النمو على لوحة لعدة أيام دون لمس أي من الآخرين. وفي المتوسط، فإن من الخلاياسوف يحقق نحو قارورة T75 04-06 يونيو لوحات تستحق من الخلايا.
    1. إذا باستخدام laminin، في تمييع NIM إلى 10-20 ميكروغرام / مل لمعطف لوحة 6 جيدا (~ 0.5 مل / أيضا). بعد طلاء لمدة 2-3 ساعة والركام خلية لوحة على 6 لوحات جيدا (~ 20-30 المجاميع لكل بئر). بعد المجاميع قد تعلق، إضافة 1.5 مل من NIM.
    2. إذا باستخدام FBS، وإعداد خليط من NIM 90٪ FBS 10٪ و(1.5 مل / أيضا). إضافة 1.5 مل من المتوسط ​​مع الخلايا لكل بئر، ويهز بلطف ذهابا وإيابا لوحة لنشر المجاميع، والسماح للخلايا لإرفاق O / N في حاضنة. تأكد من تغيير وسيلة (2 مل / جيد نيم) في صباح اليوم التالي لإزالة FBS.
  4. بعد يوم أو يومين من كونه مطلي، وانتشرت كل الإجمالية لتشكيل أحادي الطبقة. في غضون بضعة أيام، فإن معظم مراكز تظهر هذه الخلايا إلى خلايا مماثلة شكليا عمودي (ممدود). خلال هذه الفترة، تغيير NIM كل يوم. بعض الخطوط PSC (خاصلاي اللجنة التوجيهية)، قد تشكل خلايا عمودية أقل كفاءة. إذا حدث هذا، يمكن إضافة BMP ومثبطات TGF (Dorsomorphin 29، 19 في SB431542 2 ميكرومتر) خلال المرحلة 2 تكون مفيدة.
  5. حول أيام 14-17، وخلايا عمودية تظهر أكثر إحكاما. في بعض الأحيان هذه الخلايا تشكل التلال أو حلقات مرئية داخل التجويف مع. وإلى جانب مورفولوجيا عمودي، والخلايا في هذه المرحلة التعبير عن علامات عصبية ظهارية، مثل PAX6 و12،26 SOX1.
  6. قبل أن تبدأ العزلة، لا بد من دراسة الخلايا أولا لتحديد ما إذا كان هناك أي خلايا عصبية ظهارية غير موجودة. ويمكن استخدام علامة الهدف للإشارة إلى المستعمرات غير عصبية ظهارية. ويمكن بعد ذلك يمكن القضاء على هذه عن طريق كشط أجبرتها على الفرار مع طرف ماصة.

3. جيل من الأسلاف الدماغ الانتهائي (D17-D24)

  1. المراكز من المستعمرات تحتوي على خلايا عصبية ظهارية، وينبغي أن تكون معزولة عن بقية المستعمرة. ويمكن أن يتم ذلك باستخداموmicropipette ومعقمة 1 مل ماصة الحافة التي تمت تصفيتها. عندما يتم تطبيق كمية صغيرة من الضغط على جزء مركز للمستعمرة، فإنه يرفع من عام بسهولة تامة. توخي الحذر لعدم السماح للجزء الخارجي للفصل المستعمرة كذلك. إذا المراكز يجري العنيد ولن تؤتي ثمارها من تلقاء نفسها، ويمكن إزالتها عن طريق استئصال لهم باستخدام إبرة تحت المجهر في غطاء محرك السيارة العقيمة. نقل أجزاء من مركز المستعمرات إلى أنبوب 15 مل وتدور في 200 x ج لمدة 2 دقيقة.
  2. وينبغي أن يستنشق وسيلة الخروج من الخلايا. ويمكن بعد ذلك لوحين من الخلايا يستحق أن يتم تحويلها إلى ثقافة غير الأنسجة التي تحتوي على قارورة المعالجة T25 10 مل من NIM مع إضافة B27 (بدون فيتامين (أ)، 1:50). استخدام مل 5-10 من المتوسطة في لوحة واحدة من الخلايا.
  3. عندما ينظر إلى الخلايا في اليوم التالي، وينبغي أن لديهم المجال مثل المظهر. لا بد من نقل هذه الخلايا في قارورة جديدة (في وجود NIM وB27 1:50،) كما هو في كثير من الأحيان الخلايا الطرفيةالتي تتسلل في ونعلق على الجزء السفلي من القارورة.
  4. وينبغي بعد ذلك أن neurospheres المستزرعة في التعليق لمدة أسبوع باستخدام NIM تستكمل مع B27 (1:50). يمكن من أجل تعزيز القدرة على التحمل الخلية والانتشار، AMP الحلقي (المخيم، 1 ميكرومتر)، وكذلك الانسولين عامل النمو (IGF1، 10 نانوغرام / مل) أن تضاف إلى متوسطة خلال ثقافة التعليق. في هذه المرحلة، وتحتوي على neurospheres الأسلاف الدماغ الانتهائي (FOXG1 +) وجاهزة للمطلي coverslips على التمايز النهائي ل.

4. مزيد من التمايز في الخلايا العصبية الدماغ الانتهائي (D25 +)

    1. إعداد coverslips المغلفة poly-ornithine/laminin (في 24 وحات جيدة) لطلاء الخلايا. يتم تنظيف 1 Coverslips، والمغلفة ثم مع الأورنيثين-حيلة (عند 0.1 ملغ / مل، 37 ° C، O / N، وتخزينها في الثلاجة).
      طلاء بولي الأورنيثين:
      1. تعقيم coverslips: ضع في coverslipsدورق يحتوي على حمض النيتريك ويهز بلطف في غطاء الدخان لمدة ساعة. من اجل الخروج من حمض النتريك، وشطف مع الماء عدة مرات DI، وترك coverslips تحت الماء لتشغيل DI لا يقل عن 15 دقيقة. وضع coverslips في الايثانول 95٪ ويهز إما لمدة 30 دقيقة (في حالة استخدام فورا) أو تخزينها في الايثانول في RT.
      2. في غطاء محرك السيارة العقيمة، من اجل الخروج محتويات أنبوب 50 مل تحتوي على coverslips تعقيمها في غطاء لوحة 6 أيضا. باستخدام ملقط معقم، واختيار واحدة ساترة في وقت وتعيين تستقيم في بئر واحد من لوحة 24 أيضا. تكرار بحيث كل بئر له ساترة.
      3. بعد أن يجف تماما، اضغط على لوحات حتى coverslips انخفضت شقة في كل بئر. إضافة 100 ميكرولتر المقبل بولي الأورنيثين (0.1 ملغ / مل العقيمة O 2 في DH) إلى كل ساترة واحتضان لوحات O / N عند 37 درجة C.
      4. في اليوم التالي، وإزالة لوحات من الحاضنة، والسماح لهم لتبرد لRT. نضح بولي الأورنيثين الخروج من كل ساترة (من على حافة رانه ساترة) التأكد من عدم لمس أو خدش coverslips في هذه العملية. السماح للcoverslips لتجف لمدة حوالي 30 دقيقة قبل غسل.
      5. إضافة 1 مل العقيمة DH 2 O إلى كل بئر، واسمحوا الجلوس لمدة 10 دقيقة، ونضح قبالة المياه من كل جانب. كرر هذه الخطوة غسل مرتين أخريين. بعد لوحات يجف تماما، (إجازة يغطي قبالة في غطاء محرك السيارة) وضع أغطية على، يغطى بورق الألومنيوم، وتخزينها في -20 درجة C.
      1. لمعطف coverslips مع laminin، إضافة 50 ميكرولتر من مزيج من التمايز العصبية والمتوسطة laminin (تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل) إلى كل ساترة بولي الأورنيثين تعامل والحرص على أن يكون السائل فقط لمس ساترة نفسها (وليس إراقة إيقاف). احتضان لهم في C ° 37 ساعة لمدة 1-2 قبل إعداد الخلايا لمرفق.
  1. جمع وأجهزة الطرد المركزي في neurospheres في 200 x ج لمدة 2 دقيقة في أنبوب 15 مل. نضح قبالة طاف.
  2. <لى>
    1. شطف الخلايا مع DMEM-F12 وأجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى. إذا كان neurospheres كبيرة جدا لنعلق بشكل صحيح، فإنها يمكن أن تكون مع فصل Accutase في هذه الخطوة.
    2. إذا باستخدام Accutase: بعد غسل الخلايا مع DMEM-F12، وneurospheres فصلها هي لمجموعات صغيرة عن طريق إضافة Accutase (~ 2 مل) وتفرخ الخلايا في C ° 37 لمدة 3 دقائق. المقبل، إضافة نفس الكمية من مثبطات التربسين (~ 2 مل) وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 3 دقائق. وينبغي بعد ذلك الخلايا إعادة علقت في NDM وكسر باستخدام ماصة P200. ويمكن بعد ذلك أن مجموعات صغيرة مطلية مسبقا على المغلفة coverslips.
  3. نضح قبالة أغلبية المتوسطة ووضع الخلايا على طبق بتري 6 سم في بضع قطرات من الوسط بحيث يصبح من الأسهل تحديدها. إضافة إلى حوالي 4-5 neurospheres كل ساترة المغلفة مسبقا. ليست هناك حاجة لنضح قبالة laminin الأولى.
  4. السماح للneurospheres إرفاق مدة لا تقل عن 2-4 ساعة. مرة واحدة لديهمttached جيدا، يجب إضافة المزيد المتوسطة (0.5 مل / ساترة). ينبغي أن يتألف من تمايز المتوسطة العصبية تستكمل مع B27 (1:50)، ومعسكر (1 ميكرومتر)، وعوامل عصبية (BDNF، GDNF، ومنتدى إدارة الإنترنت، كل في 10 نانوغرام / مل). في هذه المرحلة يمكن تغيير نصف المتوسط ​​مرة كل يومين ويمكن الحفاظ على هذه الخلايا لعدة أشهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، وبروتوكول للتمييز الأمنية الإنسان في الخلايا العصبية من خلال الدماغ الانتهائي الجلوتاميرجي عدة خطوات حاسمة: تشكيل المجاميع PSC، وتحريض الخلايا الظهارية العصبية، وتوليد الأسلاف الدماغ الانتهائي، والتمايز النهائي من هذه الخلايا العصبية في الدماغ الانتهائي الأسلاف (الشكل 1) لديه وصفت. هذا النظام هو قوية وفعالة في توليد الخلايا العصبية الأسلاف والدماغ الانتهائي الجلوتاميرجي. وكمثال على ذلك (الشكل 2)، بدون إضافة عوامل منشئ للذنب، والتفريق بين hESCs في نسب العصبية 27. في 24 أيام آخر التمايز، وكانت الغالبية العظمى من السلائف العصبية الإيجابية لFOXG1 (عامل النسخ التي أعربت عنها الدماغ الانتهائي)، ولكن السلبية لHOXB4 (علامة لخلايا الدماغ المؤخر والحبل الشوكي) مما يوحي تم إنشاؤها بنجاح الأسلاف الدماغ الانتهائي (الشكل 2D). هذه الأسلاف الدماغ الانتهائي ع ossess النمط الظاهري الظهرية، كما يدل على ذلك التعبير عن PAX6 (علامة أعربت عنها الأسلاف الظهرية) (2E الشكل)، ولكن ليس NKX2.1 (علامة لالأسلاف البطنية) (الشكل 2F). بعد التمايز مزيد من هذه الأسلاف الدماغ الانتهائي الظهرية متباينة في الخلايا العصبية الجلوتاميرجي، والتي كانت إيجابية للعلامة TBR1 الجلوتاميرجي (حوالي 80٪) 27. وكانت الخلايا العصبية التي ملطخة إيجابية لTBR1 أيضا علامات إيجابية لβIII العصبية تويولين-(الشكل 2G) أو البروتين المرتبط أنيبيب 2 (MAP2، الشكل 2H). هذه الخلايا أعرب أيضا عن نقل حويصلي الغلوتامات 1 (vGLUT1)، وهو علامة للحصول على الخلايا العصبية الناضجة الجلوتاميرجي، مما يشير إلى كفاءة توليد الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي في ثقافة (الشكل 2I).

highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50321/50321fig1.jpg "/>
الشكل 1. A الزمني التخطيطي لعملية تمايز الخلايا العصبية.

الشكل 2
الشكل 2. تسليط الضوء على الصور الخلايا خلال مراحل حرجة عديدة خلال تمايز الخلايا العصبية. (A) والمجالس الاقتصادية والاجتماعية مثقف الإنسان لمدة 4 أيام. الصور تظهر مرحلة تشكيل المجاميع ESC (B) وخلايا عصبية ظهارية (C). في 24 يوما بعد التمايز من hESCs، فإن غالبية الخلايا NE كانت FOXG1 + لكن HOXB4 - (D). وكانت أسلاف الدماغ الانتهائي (FOXG1 +) PAX6 + (E) ولكن NKX2.1 - (F) بعد 1 شهر التمايز. بعد سنتين إضافيةأسابيع (6 أسابيع الكل) من التمييز بين الخلايا على وcoverslips، ملطخة معظمهم إيجابية للعلامة TBR1 الجلوتاميرجي (G، H)، فضلا عن علامات العصبية βIII-تويولين (G) وMAP2 (H). بعد ثمانية أسابيع من التمايز، كانت إيجابية للخلايا وعلامة الجلوتاميرجي ناضجة، vGLUT1 (I). على نطاق والحانات: 100 ميكرومتر (A)، و 50 ميكرومتر (BI). (تم تكييفها DI من نشر لدينا بإذن السابقة 27).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال عملية التمايز العصبية. من المهم للتأكد من أن الإنسان متعددة الإمكانات الأمنية الخاصة لأنه قد سبق وإلا فإن الخلايا تكون متحيزة نحو التحول إلى نسب غير العصبية. ويمكن التأكد من ذلك عن طريق تلطيخ الأمنية الإنسان مع أجسام مضادة ضد علامات تعدد القدرات مثل Oct4، Sox2، NANOG، و 1-3 ترا-1-60. إذا كان الإنسان الأمنية الخاصة لا نعلق بشكل جيد للغاية بعد الركض لهم، يمكن إضافة ROCK المانع (Y27632) للمساعدة. بالنسبة لأولئك صعوبة مع الحفاظ على الخلايا المحفزة، بعض المشاكل المحتملة هي نوعية / كثافة الخلايا MEF، فضلا عن الكثير من KOSR المستخدمة كما يمكن أن يكون هناك اختلاف من دفعة لدفعة واحدة. على الرغم من استخدام الخلايا المغذية للحفاظ على MEF الأمنية الخاصة في بروتوكول أعلاه، وهذا الأسلوب يعمل أيضا لشركات الأمن الخاصة التي يتم تربيتها باستخدام نظم التغذية الخالية.

عندما يتم كسر الخلايا حتى تشكل المجاميع PSC، من المهم ليممن التعرض لdispase بضع دقائق فقط (حواف ومحاصرة). طول الوقت الذي يستغرقه قبل حواف iPSCs (حتى 10 دقيقة) أطول من ذلك عادة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية (3-5 دقائق). فمن الأمثل لإضافة لوحة dispase واحد فقط من الإنسان الأمنية الخاصة في وقت لضمان أن الخلايا ليست في إنزيم لفترة طويلة جدا لأن ذلك يمكن أن يضر أو ​​حتى قتل الخلايا. بعد الخلايا في مرحلة تجميع PSC، فمن المهم للحفاظ على الخلايا في مناطق ذات كثافة منخفضة. كثافة هو أيضا مهم جدا عند المجاميع PSC ومطلي. وتوسيع هذه الخلايا على لوحة خلال الأيام القليلة المقبلة، وينبغي اتخاذ الاحتياطات للتأكد من أنها لن تمس بعد أن تنمو وتكبر. خلال الخطوة المرفق (2.2)، لا بد من التأكد من أن الخلايا لم يكن لديك التعرض لفترات طويلة للFBS لأن ذلك قد يؤثر على التعبير الجيني. قبل عزل خلايا عصبية ظهارية، فمن المهم أيضا أن حك مجموعات غير العصبية لتسفر عن أكثر نقاءالسكان من الخلايا. إذا كان أحد يريد أن تميز ما إذا كان أو لم زنزاناتهم يتم الخوض في نسب الخلايا العصبية، ويمكن أن ينظر في العوامل المختلفة مثل Pax6 أو Sox1. Pax6 يتحول على نحو 10 خلال يوم تمايز العصبية، ويتحول على Sox1 بنسبة 2 أسابيع بعد التمايز 12،26،30.

هذا البروتوكول هو في طليعة من تمايز العصبية كما يلخص العديد من الخطوات التي تحدث أثناء تطور النظام العصبي البشري. دون استخدام العوامل منشئ للذنب (حمض الريتينويك، FGF الأساسية)، وخلايا عصبية ظهارية التفريق بكفاءة في الدماغ الانتهائي الأسلاف، والذي يتزامن مع خلايا الأديم الظاهر العصبي لأول مرة الحصول على النمط الظاهري منقاري خلال التنمية 31 في الجسم الحي. هذه الأسلاف الدماغ الانتهائي تمتلك النمط الظاهري الظهرية بسبب إشارات WNT الذاتية التي dorsalizes الخلايا 27. هذا النظام يولد الأسلاف الظهرية التي يمكن أن تكون متباينة ثم إلى مزيد من الخلايا الجلوتاميرجيق. في حين أن هذا نوع من الخلايا مهم جدا، فمن بأي حال من الأحوال نوع من الخلايا فقط أن هذا النظام قادر على تشكيل. على سبيل المثال، فقد تبين إضافة SHH لventralize الخلايا، مما يتيح لهم تفرق في الخلايا GABAergic 27،32. وقد تجلى حتى أنه يمكن زرعها هذه الخلايا العصبية hESC GABAergic المستمدة في الفئران، وأنهم قادرون على تصحيح عيوب الحركي بسبب آفات الدماغ 32. لأن البروتوكول الذي يتجلى في هذه المقالة يمر عبر نقاط التفتيش تدريجي، فإنه يوفر أداة لإنتاج مجموعة واسعة من الخلايا داخل الجهاز العصبي البشري الذي يقتصر بمجرد فهمنا للتنمية وخيالنا.

القدرة على تكوين الخلايا العصبية البشرية من يفتح الأمنية الخاصة عددا كبيرا من الأبواب من العلم على حد سواء الأساسية وكذلك وجهة نظر سريرية. وتقتصر مصادر الأنسجة بعد الوفاة ونوعية يمكن أن تختلف، في حين تمايز الإنسان PSC يسمح للباحثين لتسفر عنالعرض غير محدود وثابت من الخلايا للعمل مع. مع ظهور الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (اللجنة التوجيهية) 1،3،33،34 التكنولوجيا، فمن الممكن الآن للحصول على hESC مثل الخلايا الليفية من المريض بما فيها تلك التي الأمراض المختلفة 35-38. كما هو موضح من قبل مجموعة بها 28 وكذلك العديد من الآخرين، فقد كان الجيل الناجح من الخلايا العصبية من اللجنة التوجيهية وستظل أداة فريدة ومفيدة لأولئك الذين سعوا لفترة طويلة بعد النماذج البشرية لمرض والتنمية. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت أن عدة مجموعات الخلايا العصبية المشتقة من PSC يمكن تصميم نموذج جوانب معينة من عملية المرض 36،37،39-42 وبالتالي يمكن استخدامها لفحص المركبات العلاجية 43. هذا المشجع بشكل خاص لأنه بدون نظام نموذجا جيدا لاختبار الأدوية المرشحة للنظام العصبي المركزي مع حوالي فقط وقد ثبت 8٪ منهم أن تكون فعالة سريريا 44. ومع ذلك، يمكن لهذا الأسلوب ومثله تساعد على تحسن بشكل كبير الهو رقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور Y. Sasai بسخاء لتوفير الأجسام المضادة FOXG1. وأيد هذا العمل من قبل الجذعية أبحاث الخلايا المنح كونيتيكت (08-SCB-UCHC- 022 و 11 SCB24-) والشلل النصفي التشنجي مؤسسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9'' glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company
Centrifuge (5702 R) Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics