Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Эта процедура дает конечного мозга нейронов, проходя через контрольно-пропускные пункты, аналогичные тем, которые наблюдались во время развития человеческого потенциала. Ячейки могут спонтанно дифференцироваться, подвергаются воздействию факторов, которые толкают их к нейронной линии, изолированы, и высевали на покровные, чтобы обеспечить дифференциацию терминала и созревания.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (74), e50321, doi:10.3791/50321 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Здесь, поэтапная процедура для эффективной генерации конечного мозга глутаматергической нейронов от человека плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК) было описано. Дифференциация процесс инициируется нарушение человеческих ЭСК в сгустки которые округлить до образуют агрегаты, когда клетки помещают в суспензию культуры. Агрегаты затем выращиваются в чЭСК среды от 1-4 дней, чтобы обеспечить спонтанной дифференцировки. За это время клетки имеют потенциал, чтобы стать любой из трех зародышевых листков. С 5-8 дней, клетки помещаются в нейронной среде индукции, чтобы подтолкнуть их в нервные линии. Около 8-й день, клетки позволили прикрепить на 6-луночные планшеты и дифференцироваться во время которого нейроэпителиальных формы клеток. Эти нейроэпителиальных клетки могут быть выделены на 17-й день. Клетки могут быть как нейросферы, пока они не будут готовы к высевали на покровные. Использование щелочной среде без caudalizing факторов, нейроэпителиальных клетки specifieD на конечного мозга предшественников, которые затем могут быть дифференцированы в дальнейшем спинного конечного мозга предшественников и глутаматергической нейронов эффективно. В целом, наша система предоставляет инструмент для создания человека глутаматергической нейронов для исследователей к изучению развития этих нейронов и болезни, которые затрагивают их интересы.

Introduction

Человека плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК), в том числе и человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), обладают способностью генерировать каждый тип клеток в организме, в том числе нейронов 1-3. Направленной дифференцировки нейронов различных подтипов из человеческих ЭСК является ключом для применения этих клеток в регенеративной медицине. Поколения функциональных нейронов подтипы в процессе развития представляет собой сложный процесс, включающий индукции нейронной линии, спецификации региональных предшественников по ростро-каудальной оси и дифференциация постмитотические типов нейронов из областного предшественники 4,5. Начиная с 2001 года несколько систем были созданы для создания нейронных происхождение от ЭСК, которые обеспечили платформу для последующих поколений нейронов подтипов 6,7. На основе развития принципов, несколько типов нейронов, такие как моторные нейроны спинного 8-12, среднего DOPаминергических нейронов 13-15, и нервные клетки сетчатки 16,17 были эффективно указано из человеческих ЭСК. Это было сделано путем применения критических морфогенов, которые важны для спецификации этих нейронов типа в естественных условиях во время развития. Другие протоколы были разработаны для содействия дифференциации ЭСК в нейроны, используя либо дополнительных факторов, 18-20, такие как малые молекулы или путем совместного культивирования с другими типами клеток, чтобы помочь продвинуть дифференциация 21.

Человеческий неокортекс высоко развита и содержит много типов клеток, в том числе глутаматергической нейронов, которые играют важную роль в процессе обучения, память и когнитивные функции 22,23. Первый шаг в создании глутаматергической нейронов в культуре указать конечного мозга клеток-предшественников. Группа Yoshiki Sasai первым сообщил направленной дифференцировки предшественников из конечного мозга мыши ЭСК (mESCs) с помощью бессывороточной SuspensioРусская культура в присутствии DKK1 (который ингибирует Wnt сигнализации), а также LeftyA (который ингибирует узловой сигнализации) 24. Впоследствии, несколько групп, в том числе наша также сообщили, спецификации конечного мозга предшественников из человеческих ЭСК в бессывороточной среде 25-27. Поколение конечного мозга предшественников из человеческих ЭСК не требует использования экзогенных морфогенов и эффективность в формировании этих предшественников гораздо выше, чем от mESCs 26,27. Здесь, определенного химического системы для нейронных индукция которого была также создана группой Чжана 7 была описана. Без добавления экзогенных факторов caudalizing, этот протокол эффективно генерирует конечного мозга предшественников из человеческих ЭСК 27. Эти предшественники могут быть дифференцированы в спинной или вентральной предшественников путем регулирования сигнализации Wnt и Sonic Hedgehog (ВГГ). Спинного предшественников может дополнительно дифференцироваться в нейроны электронной глутаматергическойfficiently 27. Кроме того, этот протокол также хорошо работает для генерации глутаматергической нейронов человеческого ИПСК 28, который позволяет для генерации конкретного пациента нейронов, которые могут быть использованы для изучения механизма действия, а также потенциальных терапии для большого спектра заболеваний . Кроме того, наша система также предоставляет платформу для изучения развития и спецификации различных типов нейронов в конечном мозге.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Поколение человека агрегаты плюрипотентных стволовых Cell (D1-D4)

  1. Человека плюрипотентных стволовых клеток культивируют на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидеров в присутствии чЭСК среде с добавлением основного фактора роста фибробластов (шФРФ, 4 нг / мл). Через 5-7 дней в культуре, когда колонии большой, но все еще недифференцированных, они готовы к следующему шагу.
  2. Фермент решение должно быть сначала подготовлены. В 50 мл трубки, распустить диспазы (или коллагеназы) в дозе 1 мг / мл в DMEM/F12 среды. Так как эти решения смешивать лучше всего, когда нагревается, поместить в пробирку среды и фермента в 37 ° С водяной бане в течение 10-15 мин, а затем стерилизовать его, используя Steriflip фильтр.
  3. Аспирируйте от среды от клеток, промойте их DMEM/F12 и аспирации с этим, а также. Добавить 1 мл диспазы в каждую лунку и место в инкубаторе в течение 3-5 мин для ЭСК (до 10 мин для ИПСК). Посмотрите на клетки под микроскопом, когдакрая свернуться калачиком немного / выглядят немного темнее, клетки готовы к следующему шагу. Лучше всего, чтобы проверить клеток после 3 мин и положить их обратно в случае необходимости. При использовании этого протокола в первый раз, то лучше всего начать с одной пластиной клеток, в то время как это важно для удаления клеток из диспазы как можно быстрее.
  4. Аспирируйте от диспазы из клеток. Аккуратно (клетки являются очень уязвимыми на данном этапе и выйдет пластины относительно легко) добавить 1,5 мл DMEM/F12 средних в каждую лунку для того, чтобы смыть диспазы. Аспирируйте от DMEM/F12 и добавить 1,5 мл чЭСК среде в каждую лунку.
  5. Чтобы снять и разбить ячейки, поместите кончик пипетки на 10 мл стекло в нижней правом углу хорошо (прикосновения клеток), и переместить пипетки вверх и вниз (по вертикали) - вверх топить должны находиться в непосредственной близости в разбирательстве вниз инсульт. После того, другая сторона также будет достигнут, повторите в горизонтальной тяжеломие.
  6. После того как все клетки находятся во взвешенном состоянии, поместите их в 15 мл пробирок и центрифуги их на 200 мкг в течение 2 мин. Там должно быть осадок клеток в нижней части трубы. Аспирируйте от средней сверху гранул.
  7. Размер колбы культуры клеток, которые должны быть использованы, чтобы сохранить агрегатов в зависимости от исходного количества клеток. За 6 скважин (1 пластина) из ЭСК, не являющегося культуре ткани обрабатывали T75 колбу с 50 мл чЭСК среды должны быть использованы. Передача клетки от шага от 1,6 до колбы и инкубировать при температуре 37 ° C.
  8. Для того, чтобы избавиться от остатков клеток, клеточной среды и колбы должно быть заменено примерно 12 часов спустя. Чтобы сделать это, поместите все среды / клеток в 50 мл трубки, спина ячейки вниз (200 мкг в течение 2 мин) и аспирации от старой среды. Затем добавьте 50 мл свежей среды ЭСК в клетки, и место в новом T75 колбу. Клетки можно подавать ежедневно после этой же процедуре (до 5 дней).

  1. Передача клеток / средних и 50 мл трубки и центрифугируют клеток в течение 2 мин при 200 х г. Далее, аспирация от супернатанта, и передать клетки в новую (не-культуры тканей лечение) T75 колбу с 50 мл нейронных средней индукции (NIM).
  2. Как только клетки находятся в NIM, половина из среды должны быть заменены каждый день. Агрегаты должны стать достаточно большим, чтобы там, где они опустятся на дно 50 мл коническую трубку самостоятельно после нескольких минут (без центрифугирования требуется). Через 2-3 дней в NIM (D7-D8 общего числа), клетки должны быть готовы к пластине. Ламинин или эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) могут быть использованы, чтобы помочь клетки прикрепляются к пластинам.
  3. Число культуре ткани обрабатывали 6-луночные планшеты, которые необходимы, зависит от плотности клеток каждого агрегата должны быть в состоянии расти на пластине в течение нескольких дней, не касаясь любой из остальных. В среднем, от одной клеткиT75 колбу даст около 4-6 6-луночные планшеты стоит клеток.
    1. При использовании ламинин, растворите его в NIM до 10-20 мкг / мл, чтобы покрыть 6-луночный планшет (~ 0,5 мл / лунку). После нанесения покрытия в течение 2-3 ч, пластины клеточных агрегатов на 6-луночные планшеты (~ 20-30 агрегатов на лунку). После агрегатов приложил, добавить 1,5 мл NIM.
    2. При использовании FBS, приготовить смесь из 90% NIM и 10% FBS (1,5 мл / лунку). Добавить 1,5 мл среды с клетками в каждую лунку, слегка встряхните пластину назад и вперед, чтобы распространить агрегатов, и позволяют клеткам придают O / N в инкубаторе. Будьте уверены, чтобы изменить среду (2 мл / лунку NIM) на следующее утро, чтобы удалить FBS.
  4. Через день или два бытия покрытием, каждый агрегат будет распространено для формирования монослоя. Через пару дней, центры большинства этих клеток морфологически будет выглядеть примерно столбчатые клетки (удлиненные). В течение этого периода, изменить NIM каждый день. Некоторые PSC линий (особенноют IPSC), могут образовывать столбчатые клетки менее эффективно. Если это произойдет, добавление BMP и ингибиторы TGF (Dorsomorphin 29, SB431542 19 на 2 мкМ) в течение 2 этап может быть полезным.
  5. Около 14-17 дней, столбчатые клетки появится более компактный. Иногда эти клетки образуют гребни или кольца с видимым просветом внутри. Кроме того, морфологии столбчатые клетки на данном этапе выразить нейроэпителиальных маркеров, таких как PAX6 и SOX1 12,26.
  6. Перед изоляцией может начать, нужно сначала изучить клетки, чтобы определить, есть ли не-нейроэпителиальные клетки присутствуют. Цель маркер может быть использован для обозначения не-нейроэпителиальных колонии. Они могут быть устранены путем соскабливания их с кончика пипетки.

3. Генерация конечного мозга предшественников (D17-D24)

  1. Центров колонии содержат нейроэпителиальных клеток, и должны быть изолированы от остальной части колонии. Это может быть сделано с помощьюмикропипетки и стерильный 1 мл фильтруют пипетки. При небольшом количестве давлением наносится на центральную часть колонии, она вообще взлетает довольно легко. Будьте осторожны, чтобы не позволить внешней части колонии, а также отсоединить. Если центры упрям ​​и не будет отрываться по собственному желанию, они могут быть удалены путем вырезания их с помощью иглы под микроскопом в стерильных капот. Передача в центр часть колоний в 15 мл трубки и спина при 200 мкг в течение 2 мин.
  2. Среда должна быть отсасывают клеток. Две пластины стоит клеток, затем может быть передана без тканевой культуре рассматривается T25 колбу, содержащую 10 мл NIM с добавлением B27 (без витамина А, 1:50). Используйте 5-10 мл среды в расчете на одну пластину клеток.
  3. Когда клетки рассматриваются на следующий день, они должны иметь сферу, как внешний вид. Это необходимо перевести эти клетки в новую колбу (в присутствии NIM и B27, 1:50), как это часто клеток периферическойкоторая проникнуть и прикрепить к нижней части колбы.
  4. Нейросферы затем следует культивировать в суспензии в течение одной недели с помощью NIM дополнить B27 (1:50). В целях содействия клетки выносливость и распространения, циклический АМФ (цАМФ, 1 мкМ), а также инсулину фактор роста (ИФР-1, 10 нг / мл) могут быть добавлены в среду во время суспензионной культуры. На данный момент, нейросферы содержать конечного мозга предшественников (FOXG1 +) и готовы к высевали на покровные для терминальной дифференцировки.

4. Дальнейшую дифференциацию в нейроны конечного мозга (D25 +)

    1. Подготовка poly-ornithine/laminin покрытием покровные (в 24-луночных планшетах) для металлизации ячеек. Покровные сначала очищаются, а затем покрывают уловка-орнитин (на 0,1 мг / мл, 37 ° C, O / N, и хранить в морозильной камере).
      Поли-орнитин покрытия:
      1. Стерилизовать покровные: Поместите в покровныхстакан, содержащий азотной кислоты и осторожно встряхните в вытяжной шкаф на один час. Вылейте азотной кислоты, промыть несколько раз дистиллированной водой, и оставить покровные под проточной дистиллированной водой в течение не менее 15 мин. Поместите покровные в 95% этанола и либо встряхивают в течение 30 мин (при использовании сразу) или магазин в этаноле при комнатной температуре.
      2. В стерильных капот, вылить содержимое в 50 мл пробирку, содержащую стерилизованные покровные в крышку 6-луночный планшет. Использование стерилизованные щипцы, подобрать один покровное в то время, и установить вертикально в одной скважины из 24-луночный планшет. Повторите так, чтобы каждая скважина имеет покровное.
      3. После того как они полностью высохнуть, нажмите на пластинах до покровные упали квартиры в каждую лунку. Затем добавьте 100 мкл поли-орнитин (0,1 мг / мл в стерильные дН 2 O) для каждого покровное и инкубировать пластин O / N при температуре 37 ° C.
      4. На следующий день, снимите пластины из инкубатора и дать им остыть до комнатной температуры. Аспирируйте поли-орнитин от каждого покровное (от края тОн покровное), убедившись, не трогать или царапать покровные в этом процессе. Разрешить покровные высохнуть в течение примерно 30 мин до мытья.
      5. Добавить 1 мл стерильной дН 2 O в каждую лунку, оставьте на 10 минут, и удалите подачу воды из каждой лунки. Повторите этот шаг мыть два раза. После того, как пластины полностью высохнуть, (отпуск одеяло на капоте) разместить крышками, накрыть алюминиевой фольгой и хранить при температуре -20 ° C.
      1. Чтобы покрыть покровные с ламинином, добавить 50 мкл смеси нейронных дифференциации среднего и ламинина (конечная концентрация 20 мкг / мл) в каждый поли-орнитин рассматриваться покровное будьте осторожны, только жидкости касаясь покровное себе (и не проливая выключена). Инкубировать их при температуре 37 ° С в течение 1-2 часов перед приготовлением клетки для крепления.
  1. Сбор и центрифуги нейросферы при 200 мкг в течение 2 мин в 15 мл трубки. Аспирируйте от супернатанта.
  2. <li>
    1. Промойте клетки с DMEM-F12 и центрифуги клетки снова. Если нейросферы слишком велики, чтобы приложить должным образом, они могут быть отделены с Accutase на этот шаг.
    2. При использовании Accutase: После мытья клеток с DMEM-F12, нейросферы разобщены малых кластеров, добавив Accutase (~ 2 мл) и инкубации клеток при 37 ° C в течение 3 мин. Затем добавьте такое же количество ингибитора трипсина (~ 2 мл) и центрифугируют клетки при 200 мкг в течение 3 мин. Клетки должны быть повторно приостановлено в NDM и сломал с помощью пипетки P200. Небольшие кластеры могут быть помещены на предварительно покрытых покровные.
  3. Аспирируйте от большинства средних и поместить клетки на 6 см чашки Петри в нескольких капель среде, так что их выбор становится легче. Добавить около 4-5 нейросферы каждого предварительно покрытых покровное. Существует не нужно для аспирации от ламинина в первую очередь.
  4. Пусть нейросферы приложить, по крайней мере 2-4 часов. Как только они имеютttached хорошо, больше средних (0,5 мл / покровное) должны быть добавлены. Она должна состоять из нейронных дифференциации среднего дополнить B27 (1:50), цАМФ (1 мкМ), и нейротрофического фактора (BDNF, GDNF и IGF, все по 10 нг / мл). На данный момент половина среды могут быть изменены через день, и эти клетки могут сохраняться в течение нескольких месяцев.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь, протокол различать человеческие ЭСК в глутаматергической нейронов конечного мозга через несколько важных шагов: формирование агрегатов PSC, индукция нейроэпителиальных клеток, генерации конечного мозга предшественников, и терминальной дифференцировки этих предшественников нейронов в конечного мозга (рис. 1) имеет были описаны. Эта система является надежной и эффективной генерации конечного мозга предшественников и глутаматергической нейронов. В качестве примера (рис. 2), без добавления caudalizing факторов, ЭСК дифференцировались в нервные линии 27. На 24 дней после дифференциации, большинство нейронных предшественников были положительными для FOXG1 (фактор транскрипции, выраженные конечный мозг), но негативно для HOXB4 (маркер для заднего мозга и клеток спинного мозга), что свидетельствует конечного мозга предшественники были успешно созданы (рис. 2D). Эти конечного мозга предшественники р ossess спинного фенотип, как указано в выражении PAX6 (маркер выраженных спинных предшественников) (рис. 2E), но не Nkx2.1 (маркер вентральных предшественников) (рис. 2F). После дальнейшей дифференциации, эти конечного мозга спинной предшественники дифференцируются в глутаматергической нейронов, которые были положительными для глутаматергической маркер TBR1 (около 80%) 27. Нейроны, которые окрашивались позитивно для TBR1 также были положительными для нейронов маркеры βIII-тубулина (рис. 2G) или ассоциированный с микротрубочками белок 2 (MAP2, рис 2H). Эти клетки также выразил везикулярного транспортера глутамата 1 (vGLUT1), маркер для зрелой глутаматергической нейронов, предполагая, эффективной генерации конечного мозга глутаматергической нейронов в культуре (рис. 2I).

highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50321/50321fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схема сроки нейронных процессов дифференциации.

Рисунок 2
Рисунок 2. Изображения выделения клеток в течение нескольких критических этапах дифференцировку нейронов. (A) ЭСК человека культивировали в течение 4 дней. Фаза изображения, показывающие образование агрегатов ESC (B) и нейроэпителиальных клеток (C). На 24 дней после дифференциации от ЭСК, большая часть клеток NE были FOXG1 +, но HOXB4 - (D). Конечного мозга предшественников (FOXG1 +) были PAX6 + (E), но Nkx2.1 - (F) через 1 месяц после дифференцировки. После двух дополнительныхнедель (6 недель общего числа) дифференциации клеток на покровные, большинство из них окрашивается позитивно для глутаматергической маркер TBR1 (G, H), а также маркеры нейронов βIII-тубулина (G) и MAP2 (H). После восьми недель дифференциации клеток были положительными для зрелой глутаматергической маркер, vGLUT1 (I). Шкала баров: 100 мкм (A), 50 мкм (BI). (DI были адаптированы из нашей предыдущей публикации 27 с разрешения).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Есть несколько важных шагов в нейронных процессов дифференциации. Важно, чтобы убедиться, что человеческие ЭСК являются плюрипотентными, потому что в противном случае клетки уже могут быть смещены в сторону становится не-нейрональных линии. Это может быть подтверждено путем окрашивания человеческих ЭСК с антителами против маркеров плюрипотентности, таких как Oct4, Sox2, Nanog, и TRA-1-60 1-3. Если человек ЭСК не придаем очень хорошо после пассажей них, ROCK ингибитора (Y27632) могут быть добавлены, чтобы помочь. Для тех, кто испытывает трудности с сохранением своего плюрипотентные клетки, некоторые потенциальные проблемы являются качество / плотность клеток MEF, а также много KOSR используется как не может быть отклонений от партии к партии. Хотя клетки MEF подачи были использованы для поддержания охранных компаний в вышеуказанных протоколов, этот метод работает и для охранных компаний, которые культивировали использованием фидерных бесплатных систем.

Когда клетки нарушается, чтобы сформировать PSC агрегатов, важно Итэто их диспазы экспозиции до нескольких минут (края будут сгонять). Время, которое она занимает до краев токов (до 10 мин), как правило, больше, чем у ЭСК (3-5 мин). Это оптимальное добавить диспазы только одна пластина ЭСК человека в то время, для того, чтобы клетки не в ферменте слишком долго, так как это может повредить или даже убить клетки. После того, как клетки находятся в стадии совокупности PSC, важно сохранить клетки при низкой плотности. Плотность также весьма важно, когда PSC агрегаты покрытием. Эти клетки будет расширяться на пластине в течение ближайших нескольких дней, и следует принимать меры предосторожности, чтобы гарантировать, что они не будут трогать после того как они становятся больше. Во вложение шагом (2,2), крайне важно, чтобы убедиться, что клетки не имеют длительного воздействия FBS так как это может влиять на экспрессию генов. Перед изоляцией нейроэпителиальные клетки, важно также, чтобы отрывать не-нейронных кластеров с целью получения более чистогопопуляции клеток. Если хотели, чтобы охарактеризовать ли их клетки собираются в нейронной линии, различные факторы можно рассматривать, таких как Pax6 или SOX1. Pax6 включает около 10-й день в течение нейронных дифференциации и SOX1 включается на 2 недели после дифференциации 12,26,30.

Этот протокол находится на переднем крае нейронных дифференциации, как это повторяет многие шаги, которые происходят во время развития нервной системы человека. Без использования caudalizing факторов (ретиноевая кислота, основной FGF), нейроэпителиальные клетки эффективно дифференцироваться в предшественников конечного мозга, которая совпадает с нейроэктодермы клетки впервые приобретает ростральной фенотип в течение в естественных условиях развития 31. Эти конечного мозга предшественники обладают спинного фенотипа в связи с эндогенными Wnt сигнального которые dorsalizes клеток 27. Эта система генерирует спинного предшественники, которые могут быть затем дифференцировались в клетки глутаматергическойс. Хотя этот тип клеток очень важно, это отнюдь не единственный тип клеток, что эта система способна образовывать. Например, добавление SHH было показано, что ventralize клеток, позволяя им дифференцироваться в клетки ГАМКергических 27,32. Было даже показано, что эти ЭСК, полученных ГАМКергических нейронов могут быть пересажены мышам, и что они в состоянии исправить дефекты опорно-двигательного из-за поражения головного мозга 32. Поскольку протокол, который продемонстрировал в этой статье идет через ступенчатой ​​КПП, он предлагает инструмент для производства широкого спектра клеток в нервной системе человека которого ограничены рамками нашего понимания развития и наше воображение.

Способность формировать человеческие нейроны из ЭСК открывает большое количество дверей с обеих фундаментальной науки, а также клинические перспективы. Источники Посмертные ткани ограничены, а качество может варьироваться, в то время как человеческий дифференциации PSC позволяет исследователям для получениянеограниченный и бесперебойное снабжение клеток работать. С появлением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) технологии 1,3,33,34, теперь это возможно, чтобы получить ЭСК-подобных клеток из фибробластов пациента в том числе с различными заболеваниями 35-38. Как показано в нашей группе 28, а также многие другие, успешные поколения нейронов из ИПСК была и будет оставаться уникальным и полезным инструментом для тех, кто долго искал человека после того, как модели для болезней и развития. Кроме того, несколько групп показали, что PSC-производные нейроны могут моделировать некоторые аспекты процесса болезни 36,37,39-42 и, следовательно, могут быть использованы для скрининга терапевтических соединений 43. Это особенно поощрения, потому что без хорошей моделью системы для тестирования лекарств-кандидатов для центральной нервной системы, всего около 8% из них было показано, что клинически эффективные 44. Однако этот метод и другие подобные ему может помочь значительно улучшить йэто число.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Ю. Sasai за щедрое предоставление FOXG1 антител. Эта работа была поддержана Коннектикут исследований стволовых клеток грантов (08-SCB-UCHC- 022 и 11-SCB24) и спастический фонда параплегия.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) Gibco 11330-032
Knockout Serum Replacer Gibco 10828-028
L-glutamine (200 mM) Gibco 25030
Non Essential Amino Acids Gibco 1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M) Sigma M-7522
Neurobasal medium Gibco 21103-049
N2 Gibco 17502-048
B27 Gibco 12587-010
Heparin Sigma H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) Sigma 116K5103
Laminin (human) Sigma L-6274
Laminin (mouse) Invitrogen 23017-015
FBS Gemini 100-106
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A-7906
Dispase Gibco 17105-041
Collagenase Invitrogen 17104-019
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
ROCK Inhibitor Stemgent 04-0012
SB431542 Stemgent 04-0010
Dorsomorphin Stemgent 04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) Invitrogen 13256-029
Trypsin inhibitor Gibco 17075
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
Foxg1 antibody Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50) Developmental Studies Hybridoma Bank I12
Pax6 antibody (1:5000) Developmental Studies Hybridoma Bank PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200) Chemicon MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000) Chemicon AB9616
vGLUT1 antibody (1:100) Synaptic Systems 135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) PrepoTech Inc. 450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF) PrepoTech Inc. 450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1) PrepoTech Inc. 100-11
Cyclic AMP (cAMP) Sigma D-0260
Sonic hedgehog (SHH) R&D 1845-SH
50 ml tubes Becton Dickinson (BD) 352098
15 ml tubes BD 352097
6 well plates BD 353046
24 well plates BD 353047
T25 flasks (untreated) BD 353009
T75 flasks (untreated) BD 353133
Coverslips Chemiglass Life Sciences 1760-012
6 cm Petri dishes BD 353004
9'' glass pipetes Fisher 13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM) Millipore SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) Millipore SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1) Zeiss R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance) The Baker Company
Centrifuge (5702 R) Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics