Forberedelse af Mgm101 Recombination Protein af MBP-baserede tagging strategi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Gæren mitokondrie nucleoid protein, Mgm101, er en RAD52-typen rekombination protein, som danner store oligomere ringe. En protokol er beskrevet til fremstilling af opløselig rekombinant Mgm101 hjælp maltosebindingsproteinet (MBP)-tagging strategi kombineret med kationbytning og gelpermeationskromatografi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Mbantenkhu, M., Wierzbicki, S., Chen, X. J. Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy. J. Vis. Exp. (76), e50448, doi:10.3791/50448 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den MGM101 genet blev identificeret 20 år siden for sin rolle i opretholdelsen af mitokondrie-DNA. Undersøgelser fra flere grupper har foreslået, at Mgm101 protein er involveret i rekombinationelle reparation af mitokondrie-DNA. Nylige undersøgelser har indikeret, at Mgm101 er relateret til RAD52-typen rekombination protein familie. Disse proteiner danner store oligomere ringe og fremme annealing af homologe enkeltstrengede DNA-molekyler. Imidlertid har karakteriseringen af ​​Mgm101 blevet hæmmet af vanskeligheden i at producere det rekombinante protein. Her er en pålidelig fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant Mgm101 beskrevet. Maltosebindingsprotein (MBP)-tagget Mgm101 først udtrykkes i Escherichia coli. Fusionsproteinet indledningsvis oprenset ved amylose-affinitetskromatografi. Efter at være blevet frigivet ved proteolytisk spaltning, er Mgm101 adskilt fra MBP ved kationbytningskromatografi. Monodispergeret Mgm101 fås derpåved gelpermeationskromatografi. Et udbytte på ~ 0,87 mg Mgm101 per liter bakteriekultur kan være rutinemæssigt opnået. Det rekombinante Mgm101 har minimal kontaminering af DNA. De forberedte prøver med held brugt til biokemiske, strukturelle og enkelt partikel billedet analyser af Mgm101. Denne protokol kan også anvendes til fremstilling af andre store oligomere DNA-bindende proteiner, der kan fejlfoldede og giftige for bakterieceller.

Introduction

Homolog rekombination er vigtig for reparation af dobbelt-strenget pauser (DSBs) og interstreng tværbindinger, og for genoptagelse af DNA-replikation fra kollapsede replikationsgafler 1.. Ved konventionel homolog rekombination, er det centrale reaktion katalyseret af de ATP-afhængige rekombinaser herunder RecA i prokaryoter, og RAD51 og Dmc1 i eukaryoter 1-3. Disse rekombinaser danner nukleoproteinpartikler filamenter på ssDNA, som er afgørende for at indlede homologi søgning og strand invasion inden duplex DNA skabeloner (Figur 1, venstre panel) 4-7. Ud over den konventionelle ordning, kan homolog rekombination også foregå i et RecA/Rad51-independent måde (figur 1, højre panel). For eksempel kan gær RAD52 og Rad59 proteiner direkte katalyserer annealing af komplementære ssDNA strenge, som er udsat ved resektion af dsDNA pauser. Denne rekombination proces, kendt som syngele strand annealing, er generelt ikke involverer homolog parring med dsDNA skabeloner. Efter annealing, er heterologe haler fjernet ved exonukleaser og nicks ligeres at genoprette genom kontinuitet 8-10. Reparation af enkeltstrengen annealing mekanisme er ofte ledsaget af sletninger af genomiske sekvenser mellem direkte gentagne regioner.

RAD52 tilhører en forskelligartet gruppe af rekombinationsproteiner, der er udbredt blandt bakteriofager 11. Disse proteiner er også kendt som enkelt streng Udglødning Proteiner (SSAPs), baseret på deres aktivitet for at fremme udglødning af homologe enkeltstrengede DNA-molekyler. De bedst karakteriserede bakteriofagvektorer SSAPs er Redp og Erf fra bakteriofager λ og P22, RecT fra profag rac og Sak proteinet fra lactococcus fag ul36. De SSAPs er strukturelt karakteriseret ved en typisk β-β-β-α fold, selvom lighed næsten er undetectstand i deres primære sekvenser. Tilsammen danner store homo-oligomere ringe af 10-14 fold symmetri in vitro 12-14. De funktionelle konsekvenser af denne egenskab højere orden organisatoriske struktur er ikke godt forstået.

Vi er interesseret i at forstå den mekanisme af homolog rekombination i mitokondrie-genomet. Vi har tidligere identificeret det MGM101 gen, der er afgørende for opretholdelsen af mtDNA i Saccharomyces cerevisiae 15.. MGM101 blev efterfølgende fundet at være forbundet med mitokondrie nucleoids og er nødvendig for tolerance over mtDNA til DNA-skadende agenter 16. Imidlertid har studiet af Mgm101 været holdt tilbage i det sidste årti, som det er vanskeligt at producere rekombinant Mgm101. Vi har for nylig formået at producere opløselige Mgm101 på store mængder fra E. coli ved anvendelse af MBP-fusion strategi. Dette har gjort det muligt for os at vise, at Mgm101 aktierbiokemiske og strukturelle ligheder med RAD52-familien af proteiner 17,18. I denne rapport er en tre-trins rensning beskrevet, der producerer homogene Mgm101for biokemiske og strukturelle analyser (Figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tidligere undersøgelser har vist, at de første aminoterminale 22 rester af Mgm101 spaltes efter indførsel i mitokondrier 19.. Til ekspression i Escherichia coli, er MGM101 åbne læseramme mangler de første 22 kodoner amplificeret ved PCR og placeret nedstrøms for malE sekvens der koder for maltosebindingsprotein (MBP) i en modificeret version af ekspressionsvektoren pMAL-C2E. Dette genererer MBP-Mgm101 fusion med en linker indeholdende et spaltningssted for PreScission protease (figur 3). Plasmidet først konstrueret ved at vælge E. coli transformanter uden IPTG og Xgal blå / hvid markering. Den resulterende plasmid pMAL-C2E-MGM101 indføres derefter i E. coli-stamme BL21-CodonPlus (DE3)-RIL ved at vælge ampicillin og chloramphenicolresistente kolonier.

1.. Expression, induktion, Cell Lysis og DNase I Treatment

  1. InocUlate friske transformanter i 10 ml LB-medium (1% Bacto trypton, 0,5% gærekstrakt, 1% NaCl) suppleret med glucose (0,2%), ampicillin (100 ug / ml) og chloramphenicol (50 ug / ml). Inkuber ved 37 ° CO / N med rystning ved 200 rpm.
  2. Inokulere 10 ml forkultur i 2 liter af den suppleret LB-medium som ovenfor. Dyrke cellerne ved 37 ° C med omrystning indtil OD600 når 0,5.
  3. Inducere ekspression af MBP-Mgm101 fusionsprotein ved tilsætning Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til en slutkoncentration på 0,3 mM. Dyrke cellerne med rystning ved 30 ° C i 5 timer.
  4. Opsamle cellerne ved centrifugering under anvendelse af en Beckman JA-10 rotor (5.500 xg, 4 ° C, 10 min). Efter bortkastning af supernatanten, resuspender cellepelleten i 30 ml lysisbuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,4 og 1 mM EDTA, pH 7,4) indeholdende proteaseinhibitorer (25 uM leupeptin, 1 uM pepstatin A og 1 mM PMSF).
  5. Sonikeres cellesuspension på is i 20sek ved hjælp af en ultralyds-processor (Heat Systems, Model W-385) ved 50% duty cycle, lad den køle af på is i 30 sek, og gentag 2x.
  6. Tilsæt 1 ml DNAse 1 lager ved 2 mg / ml. Rock cellelysatet ved 4 ° C i 2 timer.
  7. Juster NaCI til en slutkoncentration på 500 mM.
  8. Fjern cellerester ved centrifugering ved 10.000 xg ved 4 ° C i 30 min.

2.. Oprensning med amylose affinitetskromatografi

  1. Ækvilibrer 1,5 ml amyloseharpiks (50% opslæmning) i lysisbuffer. Tilsæt ækvilibreret amyloseharpiks til cellelysatet. Rock forsigtigt ved 4 ° CO / N.
  2. Indlæse lysatet-harpiksblanding på en Econo-Column kromatografisøjle installeret i et koldt rum. Lad de ubundne proteiner at passere kolonnen ved tyngdekraften.
  3. Vask amyloseharpiks med 300 ml af vaskepuffer I (20 mM Tris-HCI, pH 7,4; 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF).
  4. Gentag vask med 150 ml vaskepuffer II (20 mM TRis-HCI, pH 7,4; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF).
  5. Der tilsættes 5 ml af elueringsbuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,4; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF, 10 mM maltose) til søjlen, inkuberes ved 4 ° C i 10 min, indsamle eluatet og gentag for flere gange.
  6. Kombiner eluater bestemme udbyttet og renheden af MBP-Mgm101 ved at lægge en portion af eluatet på en SDS-PAGE-gel efterfulgt af Coomassie-farvning (figur 4).

3.. PreScission Protease Spaltning og kationbytningskromatografi

  1. Tilføj 50 enheder af PreScission protease til MBP-Mgm101 eluat. Udfør spaltning ved 4 ° CO / N og tillader det at fortsætte i dialyse mod dialysebufferen (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 100 mM NaCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF)
  2. Kontrollere effektiviteten af spaltning på en SDS-PAGE-gel (figur 5A).
  3. Indlæse spaltede MBP-Mgm101 af multiple injicereioner på en Bio-Scale Mini Macro-Prep High S patron tilsluttet en Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC system.
  4. Start kationbytningskromatografi ved at anvende et trin saltgradient 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM og 1,000 mM NaCl, der er skabt ved at blande puffer A (5 mM NaCl, 10 mM Na-phosphat, pH 7,2; 1 mM PMSF) og puffer B (1 M NaCl, 10 mM Na-phosphat, pH 7,2, 1 mM PMSF). Indstil strømningshastighed på 0,5 ml / min. Indsamle Mgm101 fraktion og kontrollere renheden af proteinet på en SDS-PAGE-gel (figur 5B).

4.. Gelpermeationskromatografi

  1. Kombiner proteinfraktioner fra kationbytningskromatografi. Dialyseres proteinet i GF ækvilibreringspuffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM PMSF).
  2. Koncentrer proteinet med VIVASPIN 15R Ultrafiltration spinsøjle at reducere mængden til ~ 1 ml ved centrifugering ved 3.000 xg ved 4 ° C.
  3. Load Mgm101 ona kalibreret Superose 6 prep klasse ækvilibreret med chromatografi puffer (20 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,2 mM PMSF).
  4. Start størrelse udelukkelse med chromatografi puffer kørt ved en strømningshastighed på 0,5 ml / min.
  5. Saml fraktioner af de oprensede Mgm101 toppe. Load alikvoter af fraktionerne på en 12% SDS-PAGE for at kontrollere den endelige kvalitet af proteinet.
  6. Koncentrere proteinet med VIVASPIN 6, derefter hurtigt fryse prøverne i flydende N2 og opbevares ved -80 ° C.
  7. Brug Mgm101 prøver inden for 6-12 måneder til ssDNA-bindingsassay (figur 8) og for strukturel visualisering ved transmissionselektronmikroskopi (figur 9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mgm101 er en RAD52-relateret rekombination protein i mitokondrier. RAD52 er blevet grundigt undersøgt for sin rolle i mitokondrie-DNA-rekombination (figur 1). Rekombinant Mgm101 kan fremstilles ved en tre-trins procedure (Figur 2). Dette lettes ved anvendelse af MBP-tagging strategi, der tillader Mgm101 at blive udtrykt i en opløselig form og efterfølgende frigives fra tag ved proteolytisk spaltning (figur 3).

I et typisk præparat kan ca 2-3 mg MBP-Mgm101 fusion udvindes fra 1 liter bakteriekultur efter amylose affinitetskromatografi. På en SDS-PAGE-gel, er MBP-Mgm101 detekteret som et større bånd på ~ 70 kDa (figur 4). Forurening med andre proteiner er minimal, hvis harpiksen passende vaskes før eluering. Efter spaltning med PreScission Protease, er MBP og Mgm101 fraskilt og vist som bånd af 42 kDa og 28 kDa påSDS-PAGE (figur 5A). I tilfælde af ufuldstændig fordøjelse, angivet som ved tilstedeværelsen af ​​en ~ 70 kDa store bånd, en udvidet fordøjelse med ekstra PreScission Protease tilrådes.

For kationbytningskromatografi af spaltet MBP-Mgm101 er MBP ikke tilbageholdes af kolonnen før anvendelsen af saltet (figur 6). Typisk er Mgm101 elueret med 500 mM salt uden mærkbar forurening af MBP (figur 5B). En lille top ved 300 mM er engang synlig, hvilket svarer til en spormængde spaltet MBP-Mgm101 fusion. Det er muligt, at Mgm101 i denne fraktion er bundet af kontaminerende DNA, som reducerer bindingsaffinitet til søjlen. Således kationbytnings er et nødvendigt skridt for at minimere DNA forurening.

Figur 7 viser det sidste trin af Mgm101 oprensning ved gelpermeationskromatografi. De Mgm101 oligomerer typisk elueres i en monodisperse toppå ~ 400 kDa. Nogle mutant former af Mgm101 ses ofte med øget størrelser mellem V0 (void volumen) og 400 kDa peak. Årsagen til dette er stadig ukendt. Mutationer påvirker oligomerisering af Mgm101 kan inducere dannelsen af ​​aggregater, der elueres i V0 fraktioner. Men vi har aldrig set toppe svarende til monomere Mgm101. Mgm101 monomerer er sandsynligvis ustabile i opløsning.

Det oprensede Mgm101 har en høj bindingsaffinitet til ssDNA (figur 8). Den bindende affinitet for ssDNA kan estimeres på grundlag af titrering af frie ssDNA på gelen. Den Mgm101/ssDNA kompleks migrerer dårligt ud af brøndene. En mulig forklaring er, at Mgm101 positivt er opladet, og bindingen af ​​multiple underenheder på Mgm101 til ssDNA neutraliserer sine negative ladninger, som gør protein / DNA-komplekser immobile under elektroforeseforhold. Når passende forberedt, Mgm101 binder ssDNA med en Kd på ~ 200 nM.

Figur 9 viser den direkte strukturelle visualisering af det oprensede Mgm101 ved negativ plet transmissionselektronmikroskopi. Frisk fremstillet Mgm101 er hovedsageligt til stede som store oligomere ringe med en diameter på ~ 20 nm. I stedet ældede Mgm101 prøver udgør komprimerede filamenter. Disse filamenter er ikke dannet ved simpel stabling af ringene. Der er tydeligvis et spiralmønster i filamenterne. De betingelser, som modulerer filamentering processen er i øjeblikket under efterforskning. Det er tilrådeligt, at proteinet kvalitet kontrolleres på SDS-PAGE efter inkubation ved 4 ° C i de ældede prøver før bliver analyseret ved elektronmikroskopi.

Figur 1
Figur 1.. Forenklet skematisk diagram, der viser, at RAD52 fungerer som mægler for lastning af RAD51 rekombinasen på rekombinationssted i en canonical homolog rekombination vejen (venstre panel), og fremmer enkelt streng annealing uafhængig af RAD51 (højre panel).

Figur 2
Figur 2.. Overordnet plan for udarbejdelse af rekombinant Mgm101. Mgm101 først udtrykkes i E. coli i en MBP-fusioneret formular. Bakterielle celler lyseres ved lydbehandling. DNAse I fordøjelse anvendes for at mindske DNA-kontaminering. MBP-Mgm101 fusion oprenses derefter fra DNA-udtømte lysat ved hjælp af en amylose søjle. Efter proteolytisk spaltning, er Mgm101 frigøres og adskilles fra MBP ved kationbytningskromatografi. Dette trin er nødvendigt for yderligere at reducere kontaminering med DNA. Den eluerede Mgm101 fraktion derpå oprenses til homogenitet ved passage gennem en Superose 6 prep klasse kolonne.


Figur 3.. Fysisk kort af Mgm101-udtrykkende plasmid pMAL-C2E-MGM101. Spaltningsstedet for PreScission protease mellem MBP og Mgm101 er indiceret. Den proteolytiske spaltning udbytter MBP og Mgm101 med en molekylvægt på 42 og 28 kDa henholdsvis.

Figur 4
Figur 4.. SDS-PAGE viser renheden af MBP-Mgm101 fusionsprotein efter amylose-affinitetskromatografi. Proteinkoncentrationen bestemmes ved at måle absorbansen ved 280 nm og ca 5 ug Mgm101 er indlæst på gelen. Gelen farvet med Coomassie blue.

Figur 5 Figur 5.. SDS-PAGE-analyse af Mgm101. A) Frigivelsen af ​​Mgm101 fra MBP-Mgm101 fusionsprotein efter spaltning med PreScission protease. Efter fordøjelse med protease O / N, en alikvot indeholdende ca 5 ug protein på geleen. Gelen farvet med Coomassie blue. Mgm101 migrerer lidt langsommere end den forventede størrelse på 28 kDa, eftersom den generelle positive ladning af proteinet under standard SDS-PAGE tilstand. B) Mgm101 efter separation fra MBP ved kationbytningskromatografi.

Figur 6
Figur 6.. Chromatogram, der viser adskillelse af Mgm101 fra MBP ved kationbytningskromatografi. Det spaltede MBP-Mgm101 injiceres i en Bio-Scale Mini Macro-Prep High S patron flere gange. Et skridt salt gradient af 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mm og 1,000 mM NaCl anvendes derefter. Klik her for at se larer tal .

Figur 7
Figur 7.. Chromatogram, der viser elueringsprofilen af Mgm101 oligomerer på en kalibreret Superose 6 prep klasse kolonne. Kromatografi udføres ved ved en strømningshastighed på 0,5 ml / min. Det eluerede Mgm101 er observeret som et højdepunkt på ~ 400 kDa. V0: void volumen. Klik her for at se larer tal .

Figur 8
Fig. 8. elektroforetisk mobilitet ændring-assayet viser, at det oprensede Mgm101 har en robust bindende aktivitet til ssDNA. Den 1,25 x 10 -3 MgCl2, 1 mM EDTA, pH 8,0, 10% glycerol, 1 mM DTT, 50 ug / ml BSA, og 1 mM PMSF. Efter inkubation ved stuetemperatur i 30 minutter, prøverne påsat en 6% nativ acrylamidgel og køre i 0.5X TBE buffer ved 4 ° C.

Figur 9
Figur 9.. Elektronmikrografier viser, at den strukturelle organisering af frisk (venstre panel) og alderen (højre panel) Mgm101. Negativfarvning transmissionselektronmikroskopi udføres ved hjælp af en JEM-2100 transmission (JEOL) opererer ved 200 kV. Til negativ plet af alderen Mgm101 er proteinet opbevares ved 4 ° C i GF buffer (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCI; 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, og 0,2 mM PMSF) i 4 uger før at blive analyseret. (Courtesy of Dr. Stephan Wilkens).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det har været en udfordring at producere en stabil, indfødte rekombinant Mgm101 protein fra E. coli muligvis på grund af stoffet ikke er opløseligt i bakterieceller. I denne rapport, viser vi, at MBP-fusion strategi giver protein, der skal udtrykkes på et rimeligt højt niveau. Ved hjælp negativ farvning transmissionselektronmikroskopi og gelpermeationskromatografi, har vi tidligere vist, at MBP-fusionsproteinet danner ensartede oligomerer in vitro 18. Det er muligt, at foldning og oligomerisering af Mgm101 kan være langsommere i de bakterielle celler sammenlignet med den mitokondrie matrix. Den unoligomerized Mgm101 hurtigt kan danne aggregater, der er giftige in vivo. MBP-tagging kan beholde Mgm101 i en opløselig konformation, der tillader produktive oligomerisering og mindsker dets toksicitet.

Et vigtigt kriterium for god kvalitet Mgm101 forberedelse er at have minimal forurening med DNA. A 280 / A 280 / A 260-forholdet er under dette niveau, udvidet fordøjelse med DNAse I anbefales. I fremtiden kan det være nyttigt at se, om fordøjelse med S1 nuclease og RNase yderligere kan reducere kontaminerende nukleinsyrer.

Vi har tidligere vist, at lagring af Mgm101 ved 4 ° C i et par uger inducerer dannelsen af lange spiralfilamenter 17. Mekanismen af ​​endeløse dannelse er ikke godt forstået. Over-filamentering påvirker proteinets opløselighed. Derfor er det stærkt anbefales, at prøver af frisk fremstillet Mgm101 protein er hurtigt frosset i flydende nitrogen, efterfulgt af opbevaring ved -80 ° C. Det DNA-bindende aktivitet af proteinet forbliver uændret efter 6-12 måneders opbevaring under disse betingelser.

Denne protokol kan også anvendes til fremstilling mutantproteiner af Mgm101. Oligomeriseringen tilstand og stabiliteten af ​​Mgm101 ofte påvirket af mutationer. Milde mutationer kan forårsage en delvis udfældning af de oprensede proteiner Efter spaltning fra MBP. I disse tilfælde, kultur volumen stigende til 6 liter kan tillade tilstrækkelig udbytte af de stabile rensede proteiner fra gelpermeationskromatografi. Alvorlige mutationer påvirker oligomerisering tillade fremstilling af proteinerne i en MBP-fusioneret form, men kan proteinet ikke være stabil efter fjernelse af MBP.

Sammenfattende er den nuværende protokol pålidelige som tillader højniveauekspression af store Mgm101 oligomere ringe i E. coli. Denne protokol kan tilpasses til fremstilling af Mgm101 orthologer 20, 21 og andre oligomere proteiner, især når opløseligheden af disse proteiner er lav i de bakterielle celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Stephan Wilkens om hjælp til transmission elektronmikroskopi. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Grant R01AG023731.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expression vector pMAL-c2E New England Biolabs #N8066S
PreScission Protease GE Healthcare Life Sciences #27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells Strategene #230245
Leupeptin Roche Applied Science #11034626001
Pepstatin Roche Applied Science #11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Applied Science #10837091001
DNAse I Sigma #DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Roche Applied Science #11411446001
Amylose resin New England Biolabs #E8021L
Econo-Column chromatography column BIO-RAD #7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml) BIO-RAD #732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS15RH02
Superose 6 prep grade column Amersham Bioscirnces #17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO) Sartorius Stedium #VS0611

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics