Приобретение флуоресценции интервальной съемки бутонизации дрожжей и анализ Одноклеточный динамики с использованием ПРОТЕЗОВ

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы представляем простой протокол для получения флуоресцентного микроскопа фильмы растущих клеток дрожжей и на основе графического интерфейса программного пакета для извлечения одноклеточные данных временных рядов. Анализ включает в себя автоматизированные линии и временного разделения назначения интегрирована с визуальным осмотром и ручным курирование гусеничном данных.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (77), e50456, doi:10.3791/50456 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Флуоресценции покадровой микроскопии стал мощным инструментом в изучении многих биологических процессов на уровне одной клетки. В частности, фильмы изображающие временную зависимость экспрессии генов дают представление о динамике ее регулирования, однако, есть много технических проблем в получении и анализе фильмов флуоресценции одиночных клеток. Здесь описан простой протокол с использованием коммерчески доступной культуры микрожидкостных устройств для получения таких данных, и MATLAB основе, графический пользовательский интерфейс (GUI) на основе пакета программного обеспечения для количественного флуоресцентного изображений. Программное обеспечение сегментов и дорожек клетки, позволяет пользователю визуально отбора с ошибками в данных, и автоматически присваивает линии и разделения времени. GUI дальнейшем анализируются временные ряды для производства целого следы клеток, а также их первые и вторые производные по времени. В то время как программное обеспечение было разработано для S. CEREVISIAE, ее модульность и универсальность должна позволить его тØ служить в качестве платформы для изучения других типов клеток, с некоторыми изменениями.

Introduction

Одноклеточные анализ экспрессии генов содействовало нашему пониманию многих аспектов регуляции генов. Статические снимки флуоресцентных выражения репортера использованием проточной цитометрии или микроскопии дать полезную информацию о распределении одноклеточные выражения, но не хватает истории и эволюции временных рядов данных, необходимых для непосредственно информировать динамики экспрессии генов. Флуоресценции покадровой микроскопии представляет собой средство для получения как одноклеточные измерений и их истории. Различные экспериментальные и аналитические методы были разработаны для получения и количественной флуоресцентной фильмы выражения репортером, передавая, таким образом взглянуть на особенности регуляции генов (см. 1 для обзора), такие как клетки к клетке изменения 2,3, бактериальной формирования стойкая бактерия 4, транскрипция инициирование и удлинение 5, транскрипционные разрыва 6,7, клеточного цикла зависимость 8,9, 10 и наследуемости. Тем не менее, OBTAining качество одноклеточные флуоресценции временной ряд включает в себя значительные технические проблемы в культивирования монослой клеток в контролируемой окружающей среде и в высокой пропускной количественного приобретенных фильмов флуоресценции. Здесь мы описываем процедуру для получения и анализа флуоресценции фильмов С. CEREVISIAE, без необходимого опыта в клеточной культуре производства устройства или в разработке программного обеспечения (рис. 1).

Во-первых, мы подробно пример протокола для создания фильмов флуоресценции временных рядов для начинающих дрожжей, экспрессирующих один или более флуоресцентных журналистам. Хотя индивидуальные микрожидкостной камер культуры были построены и успешно использовались ранее 11-13, мы используем имеющиеся в продаже устройства от микрожидкостной CellAsic (Hayward, Калифорния). Система пределы клетки монослоя роста и обеспечивает постоянный контроль перфузии среды. Микроскопии протокола мы представляем собой простой способ получить fluorescENCE фильмы бутонизации дрожжи, но любое изменение экспериментальный протокол (индивидуальные устройства культуры, альтернативные условия среды и т.д.). обеспечивая такую ​​же данных флуоресценции фильм одиночных клеток дрожжей может быть замещен.

Далее мы приводим анализ фильмов с помощью графического интерфейса пользователя (GUI) на основе пакета программного обеспечения в MATLAB (Mathworks, Натик, штат Массачусетс), получивший название графический интерфейс для быстрого анализа флуоресценции временных рядов (черенки) для извлечения данных временных рядов для отдельных клеток. ПРОТЕЗОВ имеет аналогичные характеристики с универсальным, открытым исходным кодом пакета Cell-ID 14 в сегментации и отслеживания клетки и в извлечении интенсивности флуоресценции и геометрическую информацию. Тем не менее, важно ПРОТЕЗОВ предоставляет дополнительные возможности. Во-первых, он предлагает легкий интерактивного редактирования сегментации и отслеживания результатов для проверки точности данных, а не только статистические стробирования выброс регионе следов после анализа. Более того, она расширяет анализ automaticallY назначают происхождение и клеточного цикла достопримечательности бутонизации дрожжей. Определение, когда мать и дочь делятся, для формирования двух независимых регионах ячейки имеет решающее значение для определения целой клетки (мать включая любые связанные BUD) измерений в течение всего клеточного цикла 8. Номер состоит из трех модулей для выполнения этих задач. Первая ячейка сегменты регионов на основе контраста между целенаправленной и сфокусировано яркие образы поля, а также позволяет пользователю определить и визуально проверить параметры сегментации. Вторых путей (. Блэр и использованием MATLAB реализации Dufresne о Крокер и др. рутинных IDL, по адресу: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) и измеряет ячейку регионов во времени; автоматически назначает линий, а также дает возможность визуального контроля и коррекции ошибок. Простое построение GUI включен в запрос одноклеточные свойствами. Третий модуль приписывает появление бутон и деления Tiмес, и выводит целой клетки временные ряды данных, а также их первых и вторых производных по времени (как описано в 9). Модуль анализа выводит данные в виде разделенных пробелами текстовый файл для последующего исследования статистическим программным обеспечением выбора. Таким образом, пакет позволяет пользователю извлекать данные высокого качества времени последовательно через графический интерфейс. Мы использовали этот метод оценки в реальном времени цены транскрипции в одном перспективных дрожжевых клеток в зависимости от клеточного цикла 9. В то время как модуль оптимизирован для начинающих дрожжи, параметров или, при необходимости, свободно доступны код может быть адаптирован для других организмов и типов изображений. Алгоритмы сегментации, отслеживания и назначения линии могут быть специфическими для типов изображений и назначен рассматриваемого организма. Существующие алгоритмы можно было бы заменить, но все еще сохраняют GUI интерфейс, который позволяет удобный визуальный контроль и коррекция сегментации и отслеживания ошибок, которые неизменно OCCUR с любым алгоритмом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получить флуоресцентная микроскопия Фильмы одиночных клеток дрожжей, растущих в Микрофлюидных палата

  1. Инокулируют 1 мл среды SC (синтетический средах определенного состава с 2% глюкозы и полное дополнение аминокислот) с клетками из только что растущий пластине и инкубировали в течение ночи культуры ~ 16 часов на каток при 30 ° С. Подготовка культуры так, чтобы конечная OD 600 нм ~ 0,1 для ранней фазе логарифмического роста.
  2. Развести закваску по мере необходимости и вырастить в 1 мл свежей пробирку дополнительно 6-8 часов в OD 600 нм = 0,1. Это обеспечивает клеток, растущих на богатой питательными веществами стационарном состоянии при плотности подходит для загрузки в микрожидкостных устройств. (В качестве альтернативы, замените шаги 1.1-1.2 с процедурой, необходимо подготовить клетки, необходимые для эксперимента.)
  3. Подготовить Y04C микрожидкостной пластины культуры от CellAsic: снимите транспортировочные решения; промыть лунки стерильной водой, а с помощью системы перфузии ONIX потокаводы через 1-6 скважин в 6 фунтов на квадратный дюйм в течение 5 мин, чтобы смыть каналов. Затем поток от загрузки и 8 на 6 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 сек (загрузка канал имеет гораздо более высокие скорости потока и следует промыть отдельно).
  4. Удалить воду из всех лунок и заменить 250 мкл SC на входе скважины 1-6 и 50 мкл культуры с шага 1,2 в ячейке загрузки и 8. (Также можно разместить нужный носитель во входной 1-6 скважин для проведения экспериментов, требующих переключения между различными условиями.)
  5. Уплотнение коллектор ONIX к плите, и начинают грунтовки каналов и культуры камере течет от входной скважины в 1-6 6 фунтов на квадратный дюйм в течение 2 мин, а затем по крайней мере 5 мин при 6 фунтов на квадратный дюйм только из впускных и проведения исходной среды для эксперимента. Поток это не постоянно, пока шаг 1.7.
  6. Подготовьте микроскоп для эксперимента. Мы используем Zeiss Axio Observer.Z1 широкопольных микроскоп с каскадом II задней подсветкой EMCCD камере (Фотометрия, Тусоне, штат Аризона) и 200 люмен металлогалогенных дугиЛампа (ПРИОР Научные, Rockland, MA) для возбуждения флуоресценции ослабленный до 10%, чтобы предотвратить фотообесцвечивания. Чтобы свести к минимуму время переключения необходимых для приобретения в нескольких флуоресцентных каналов, мы пару одного, трех-полосовой дихроичным фильтром куба соответствующие возбуждения / испускания фильтров для CFP, YFP, и RFP (Chroma Technology Corp, сильфонные Falls, VT, набор 89006) установлен во внешнем, быстрой коммутации фильтра колесах (Ludl электронных продуктов, Новичок, CA).
  7. Поместите несколько капель иммерсионной жидкости на объективные (в случае необходимости, мы используем Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 масла ДВС-синдром), и установите устройство надежно микрожидкостной в стадии инвертированного микроскопа. Обеспечение пластины не сдвигается вообще в сцене в течение всего эксперимента улучшает клеточный отслеживания в процессе анализа данных. Мы просто лента пластины к стадии монтажа с целью предотвращения его смещения.
  8. Фокус на самой левой трети первой камере культуры (где высота камеры является самым маленьким) с помощью одного из встроенных положениешильдика. Отключите поток от входного СМИ Ну, а поток от нагрузки сотовой ячейки и в 8 в 6 фунтов на квадратный дюйм в 5 очередей сек. Переместить на сцену, чтобы осмотреться культуры камеру для клеток. Увеличение времени загрузки потока и давления до желаемой плотности клеток не будет достигнуто, но избегать перегрузок и засорения левый барьер, где свежие среды поступает в камеру.
  9. Начать течет из впускного медиа лунку, содержащую исходное сред при 6 атм.
  10. В MetaMorph (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния) или других автоматизации микроскопии и управляющее программное обеспечение, установить многомерные приобретением для съемки нескольких кадров на нескольких позициях этапе с течением времени. Установите количество и интервал между моментами времени. Выберите несколько позиций сцене с ~ 10 ячеек, каждая (больше будет переполнять быстро). Обычно мы используем 5-минутными интервалами и изображения до 16 положений, каждое из которых требуют ~ 11 секунд для приобретения в каждый момент времени.
  11. Установка приобретения таким образом, чтобы на каждом этапе позиции на каждом й момент времениА Программа: сосредоточится на проходящем свете светлом поле (BF) изображения с помощью MetaMorph встроенный в автофокусом метод (осуществление автоматической фокусировки, а специально написанный журнал в начале каждого этапа положение обеспечивает больший контроль над точность фокусировки); приобрести BF Изображение на +1 мкм до фокальной плоскости (ФП); приобрести BF не в фокусе (BFOOF) изображения при -4 мкм до FP (используется специально написанный журналах менять фокусировку, между изображениями) и приобрести одну оттенках серого изображения для каждого флуоресцентного репортера на FP с использованием настроек, оптимизированный для быстрого приобретения с минимальными фотообесцвечиванию.
  12. При необходимости получения изображений фона и коррекции паразитного сигнала для каждого флуоресцентного репортера в области культуры камере, без клеток.
  13. Подготовка управляющих программ для эксперимента в программном обеспечении управления ONIX. Одновременно начать сбор данных в программу MetaMorph и управляющей программы в программное обеспечение управления ONIX.
  14. В конце эксперимента, исправить ипдаже фон и тени в флуоресцентные изображения (при необходимости), и, возможно, объединить. TIF файлы для каждого канала изображения на каждом этапе положение в. STK видеофайла (например, создают BF, BFOOF, CFP, YFP и RFP фильмы для позиции 1 ).

2. Формат и сегмент данных для слежения с помощью FormatData GUI в MATLAB (рис. 2)

  1. Запустите файл FormatData.m в MATLAB, чтобы открыть графический интерфейс ввода данных. В верхней, уточнять или перейдите в папку, содержащую файлы изображений для установки данных каталога, а затем использовать графический интерфейс для указывать типы данных и графических файлов, зарегистрированных в эксперименте.
  2. Направо, установите переключатель рядом с "Покадровый", чтобы указать, какой тип анализа выполнить. "Покадровый" будет относиться к серии изображений в качестве временных рядов (например, фильм клеток, растущих в микрофлюидном камера). "Static" будут относиться друг к серии изображений в виде набора снимков, сделанных из популяции (например, несколько изображений, полученных при разferent позиции на одном образце слайдов). В этой версии трансплантатов, покадровой данных для нескольких позиций могут обрабатываться, но в виде отдельного файла для каждой позиции (см. шаг 2.14).
  3. Установите флажок для регистрации изображения для коррекции неточных движений этапе путем сдвига каждого изображения в кино, чтобы минимизировать видимого движения клетки в кадре. Мы настоятельно рекомендуем это, поскольку это значительно улучшает отслеживание (снижение ручного курирование трек позже), но добавят случайных, «белый шум» значений пикселей для заполнения, где изображения были сдвинуты на границе. Это также может быть выбран после просмотра сегментированные изображения BF в пункте 2.7 или в любой момент до шага 2,13.
  4. Проверьте "светлом поле" окно в "каналов передачи данных" панели. Нажмите кнопку "Выбрать", чтобы только заполнить BF изображений. Для *. TIF файлов, выбрать все BF изображения, соответствующие один фильм, удерживая клавишу Shift при выборе, то нажмите кнопку "Открыть". Для *. STK файлы, просто выберите стек BF интересов. Если изображения успехаполного признания, имена файлов будут перечислены во всплывающем меню справа в "Data опознано" панели. . * Для TIF файлов, убедитесь, что имена файлов отображаются в правильном порядке (за исключением файлов с последовательными именами во время сбора - BF_t001 и т.д.).
  5. Проверьте "светлом поле (из фокус)" поле и используйте кнопку "Выбрать", как в пункте 2.4 для загрузки BFOOF файлов, которые будут перечислены во всплывающем вправо. (BFOOF получены как BF -4 мкм относительно р при 63X сегменты а.)
  6. Проверьте "Сотовые Маска" коробка. В "Маска Источник" панели выберите переключатель рядом с "Сегмент БФ". Нажмите на кнопку "Параметры", чтобы открыть сегментации GUI. (В качестве альтернативы, выберите предварительно сегментированных маска фильм выбрав переключатель рядом с "Выбрать файл маски", нажатие последней, и выбор фильмов, как в пункте 2.4. В этом случае BFOOF фильм не нужен, и Можно перейти к шагу 2.8.)
  7. Установить различные параметры сегментации (описания каждого можно посмотретьЭд, нажав кнопку "Описание параметров"), и проверить качество сегментации, нажав кнопку "Тест" (рис. 3). Успешно сегментированных регионов будет зеленым с пурпурным границ. Обязательно воспользуйтесь ползунком, чтобы проверить различные моменты времени в фильме. При сегментации удовлетворительное, выберите «Готово», чтобы восстановить параметры сегментации FormatData GUI.
  8. Проверьте "цветных изображений" коробка. Введите название цвета первого канала флуоресцентного изображения в текстовое поле редактирования, а затем нажмите кнопку "Добавить и выберите пункт" для загрузки файлов цвета, как в пункте 2.4. Название цвета будет добавлена ​​в списке слева, и имена файлов будут добавлены в таблице справа. Если допущена ошибка при загрузке файлов цвета, выберите название цвета в списке слева и нажмите кнопку "Удалить цвет" для удаления файлов. Повторите эти действия для каждого цветового канала.
  9. Если дополнительные суб-области маски на основе одного из флуоресцентных цветов (например, флуоресцентно меченных ядро → нуклухо маска региона) желательны, установите флажок "Цвет Маска" коробка. Если нет, перейдите к шагу 2,12. В "Color Mask Источник" панель, введите субрегиона маску имя в поле редактирования текста. Выберите цвет из всплывающего меню в "Color Mask Источник" панели (требуется цвета были добавлены в шаге 6) и нажмите кнопку "Параметры", чтобы открыть порог тестирования GUI.
  10. Нажмите кнопку "Auto-порог" для автоматического определения порога методом Отсу 15, и изображение будет четко определить районы сохранились выше порога (рис. 4). Порог может быть скорректирована вручную, используя поле редактирования. Используйте полосу прокрутки для подтверждения порога подходит для всех моментов времени. Когда удовлетворены, нажмите кнопку "Готово", чтобы вернуть порог FormatData GUI.
  11. Нажмите кнопку «Добавить и сегмента" чтобы сгенерировать субрегиона маску, используя порог модуль применяется к выбранному цветные изображения. Название цвета маски и источника будет отображаться в таблице слева, с соответствующими Recognized имена файлов, представленных в таблице справа. (В качестве альтернативы, нажмите кнопку "Добавить и выберите", чтобы загрузить готовые субрегиона файлы маски.)
  12. Внизу, укажите или выберите нужную папку для использования в качестве каталога сохранения.
  13. Нажмите кнопку "Формат данных" читать файлы изображений (с использованием кода, разработанного tiffread2.m Франсуа Неделека, по адресу: http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298 ), обработка данных, а также создавать * . мат файла в указанную папку. Этот файл будет служить в качестве вклада в ProcessTimeSeries GUI.
  14. Повторите шаг 2.4-2.13 для множества фильмов для каждого этапа положение.

3. Трек Клетки и линии передачи во времени с ProcessTimeSeries GUI, и хранения ID и Lineage Задания (рис. 5)

  1. Запустите файл ProcessTimeSeries.m в MATLAB, чтобы открыть отслеживания GUI. Установить следующие параметры после открытияGUI:
    • "Высота камеры" ("Файл I / O" панели, вверху слева) - это свидетельствует о высоте камеры, в которой клетки в ловушке. Он используется в качестве ограничения при аппроксимации объем ячейки в качестве 3D эллипсоида на основе большой и малой оси клетки области, как и в 8.
    • "Мкм / пиксель" ("файловый ввод / вывод" панель) - коэффициент калибровки пиксела мкм расстояние в изображениях таким образом площадь поперечного сечения и объем можно рассчитать в 2 мкм и 3 мкм соответственно.
    • "Фильтры панели" (ниже "Файл I / O" панель) - минимальной и максимальной параметры, чтобы отфильтровать нежелательные регионов в маске: "Площадь" - площадь региона в пикселях; "ИКЦ" - эксцентриситет фактором, более круглым, как → 0 ; "SF" - коэффициент формы, более круглым, как → 1.
  2. Нажмите кнопку "Загрузить изображения" в "File I / O" панели и выберите файл *. Мат файла данных интерес выходе FormatData GUI. Маска региона (и любой субрегион маски) наносится на каждый цветовой канал, А также ряд различных измерения производятся (табл. 1). Файл данных затем сохраняется. (При загрузке файла в ProcessTimeSeries от предыдущей сессии он будет просить, если анализ следует начать с начала. ОСТОРОЖНО:. Это удалит любой трек курирование уже завершен и рассматривать данные как если бы оно было только что из FormatData Если GUI от случайного запуска, быстро ударил Ctrl + C в окне MATLAB команду, чтобы предотвратить ранее Спонсор *. мат файл от перезаписи.)
  3. Далее, отслеживать клеток. В "Track Клетки" панели (рядом с «Фильтры» панели), установите следующие параметры:
    • "Перемещения Макс" - максимальное расстояние в пикселях клетка может путешествовать между соседними изображениями, прежде чем помечены как другой ячейке. Высшее средства перемещения алгоритм может составлять клетки движется все дальше, но это также увеличивает сложность соответствующая ячейка регионов в толпу. Мы начинаем в 12 и уменьшаться в случае возникновения ошибки в отслеживании (см. шаг 30,4).
    • "Минимальная длина" - минимальное количество вхождений для ячейки след, чтобы считаться действительным рядов данных. Мы используем 1, чтобы предотвратить удаление любых реальных следов, но это может быть увеличена, если результаты сегментации в недолгим, ложные следы региона.
    • "Память кадров" - максимальное количество последовательных кадров ячейки региона может исчезнуть и иметь такой же ID, когда он возвращается. Если она исчезает дольше "в память рамки", то он будет дан новый ID по возвращении. Мы используем 2, чтобы позволить регионам будет хватать на сегментации 2 кадра, прежде чем вернуться.
  4. Нажмите "Track Клетки", чтобы отслеживать регионов от одной системы отсчета к другой с помощью регионе центроидами (Блэр и Dufresne MATLAB реализации Крокер, Грир, и Недели IDL рутины, по адресу: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) , назначить линий для вновь появляющиеся бутоны, и, чтобы сохранить данные. Lineages автоматически назначаются минimizing расстояния между предполагаемыми почки и потенциальных матерей в каждом кадре. (Если появляется сообщение об ошибке в окне MATLAB команду из-за "трудных комбинаторика" уменьшить "перемещения Макс" и повторить слежения.) Изменение параметров во всплывающем окне при необходимости для ваших данных.
  5. Curate слабо сегментирован регионов и ошибки в линии ID или заданий с использованием различных инструментов с графическим интерфейсом или сочетания клавиш (показан в всплывающем окне, нажав на кнопку сверху "Выбранная информация Cell" панели).
    • Слайдер, "Prev Изображение", "Следующая" (Ctrl + влево / вправо) - используется для отображения и перемещения между кадрами в серии изображений.
    • "Изображение #" - показывает номер кадра текущего изображения в левом и правом направлениях. Переместить в указанный период, введите его номер в правом "Изображение #" окна редактирования.
    • "Дельта кадр" - показывает разницу в номер кадра между правой и левой осям (Δ = правый - левый).
    • "Скрыть текст" (Ctrl + T) - переключение между режимами отображения идентификаторов сот вправо осей или нет.
    • "Скрыть этикетки" (Ctrl + L) - переключает между отображением идентификаторов сот в левой оси или нет.
    • "Маска" всплывающее меню - выбор между не отображать никакой маски, клеточная маска, или любого пользовательского суб-маски для отображения в левой панели.
    • "Overlay" всплывающее меню (Ctrl +1-9) - Выберите для отображения BF и цвет слоя в левом фрейме. Показать BF является единственной, которая переключает слоя BF или выключить по обеим осям. Переключаться между выводом или нет, выбрав имя надпечатки в меню снова ("*" означает наложение отображается). Ctrl +1 переключает BF наложения, переключения с 2-9 цвета накладки в порядке.
    • "Set Colors" - использовать, чтобы определить цвет для наложения дисплее. Появится всплывающее окно будет запрашивать которые флуоресценции канал для настройки, а затем цветовой палитре появится для определения пользователя.
    • "Изменить регионов и треки" панели - эти элементы управления эффектом изменения на маске области соты и трассировки:
      • "Обновление треков" (Ctrl + U) - использовать повторноназначить идентификаторов сот. При отсутствии выделенных ячеек выбираются в правой оси, GUI запросит идентификатор соты изменить. Когда ID X изменяется на Y, все последующие экземпляры X будет изменен на Y, и все последующие экземпляры текущего Y, будет переключено на X. (Иногда одна ячейка будет переключаться между 2 идентификаторами, неоднократно. Это связано с отслеживанием пытающийся разместить несколько идентификаторов в oversegmented регионе, а не ошибка в функции ID обновления.) Несколько ячеек можно выбрать и их идентификаторы изменяются одновременно, но не забудьте, чтобы дать каждому уникальный идентификатор. Чтобы назначить региона ID, который не существует в текущем файле, введите "0" и будет сгенерирован. Используйте Ctrl + W, чтобы поменять идентификаторы двух выделенных клетках.
      • "Delete Selected Tracks" (Ctrl + D) - используется для удаления выбранной ячейки или нескольких регионах ячейку в текущей правого фрейма осей. (Если клетки не выбраны, запрашивает имя.) Для безвозвратного удаления всех экземпляров ID след, установите флажок рядом с DeLete выбранную кнопку дорожки (текст изменится на «Удалить»). Это полезно для того, чтобы избавиться от стойких регионах мусор, но сначала проверить будущих кадров, чтобы убедиться, ID не переходит в действительную ячейку или бутон региона.
      • "Объединить Регионы" (Ctrl + A или M) - разглаживает и сочетает в себе клетки регионах. Щелкните ячейку или ячейки в правой оси для выбора (регион становится красной, если выбрана). Слияние на одном регионе будет морфологически близка к заполнить трещины и небольшие отсутствующих частей помощью диска-образный элемент. Слияние двух или более близких регионах будет объединить их в одном регионе и дать наименьшим идентификатором в новом регионе. Это полезно для более сегментированных областей (часто, когда клетки имеют большие вакуоли).
      • "Нарисуй регионе", - использовать мышь, чтобы нарисовать область в правой оси при наличии желания и дважды щелкните, чтобы закончить. Введите уникальное ID нет в наборе данных (от 1 до 65535). Отменить, нажав Delete на клавиатуре.
    • "Lineage Tracking" панели - после слежения,линии заданий создаются автоматически. Когда новые регионы ID появляются, новый идентификатор соты появляется в розовые и красные линии обращается на мать региона. Новые регионы слишком велики, чтобы быть почки или слишком далеко от потенциальных матерей появляются в зеленых и присваивается идентификатор матери "NaN" ("не число", см. таблицу 2). Регионы существующих в первый момент времени есть мать ID "0". Чтобы исправить индивидуальные задания, введите мать и бутон идентификаторы в тексте поля редактирования и нажмите кнопку "Исправить". Чтобы стереть матери клетки, введите "0", как его мать. Быстрый метод заключается в выборе двух регионов на правом изображении и нажмите Ctrl + F. Это позволит автоматически назначать старших регионе, как матери, так и новые области, как дочь, в то время стирания все ранее мать поручениям в дочернюю клетку. ВНИМАНИЕ: нажав на кнопку "Рассчитать Lineages" в любое время будет пересчитывать все линии заданий, в том числе пользователь ранее куратор.
    • "Выбранный Сотовые информации" панели - "Get ЯБПО "будет отображать некоторые измерения областей выбранного в правой осей." Измерения ... "позволяет пользователю определить, какие измерения отображается (а также определить список по умолчанию для других операций, таких как« Экспорт данных »). Может быть использован определить правильные идентификаторы и линий (например, если в ячейке X имеет бутона в момент времени T, оно, скорее всего, не имеет другого бутона в момент времени T + 5 мин).
    • "Сохранить изменения" (Ctrl + S) - обновляет * мат файл, чтобы отразить изменения пользователем.. Используете чаще (нет функции отмены)!
    • "Создание участков" - открывает GeneratePlots GUI. Используется для быстрого участок выбранной переменной информации и простые расчеты для одноклеточных регионах, выделенных в правой оси ProcessTimeSeries GUI, их средний или среднее всех областей в каждом кадре. Это GUI можно вычислить грубую первых производных, но не забудьте указать правильный промежуток времени в левом верхнем углу. Земельные участки могут быть выведены на фигуру для сохранения, нажав кнопку «Создать рисунок».
    • Чтобы правильно курировать данные: объединить любой oversegmented регионов; удалять любые регионы не захватывая всю ячейку, будьте уверены, мать-буд отношений назначены должным образом (красная линия между ними возникает во время появления бутона, когда ID бутона розового см. Таблица 2), и устранить любые зеленый идентификаторов путем фиксации ID, назначение области мать, не назначение не матери ("0") или удаление регионе. Bud данные будут добавлены к этой матери во время конечном счете так не сливаются бутон региона к матери (это приведет к неточной оценке объема).
    • Осмотрите данных для каждого кадра до последнего времени интерес, но это не требуется для всего временного ряда, если не используется более поздних кадрах.
    • Будьте уверены, чтобы сохранить изменения.
    • Повторите шаги 3.1-3.7 для *. Мат файл для каждого этапа положение.

4. Экспорт данных для анализа

  1. Чтобы просто экспортировать сырье измерений региона для каждой ячейки через Тимае, нажмите кнопку "Экспорт данных". Измерения интересов может быть выбран в графический интерфейс, который открывается, и они будут выводиться в разделенных пробелами *. TXT файлов с переменным имена, как заголовки столбцов.
  2. Для анализа временных рядов для целых клеток с течением времени, расчета клеточного цикла информации и взять производные, нажмите кнопку "Анализ временных рядов". Откроется окно, позволяющее выбирать измерения интересов и входных параметров анализа (рис. 6).
  3. Введите последней временной точки куратором в GUI (все последующие кадры будут проигнорированы). По умолчанию параметры сглаживания и клеточного цикла назначение хорошо работать для наших гаплоидных и диплоидных штаммов отображается в 5-минутными интервалами, но они, возможно, должны быть изменены для достижения наилучших результатов. (Убедитесь, что значения параметров вручную соответствующие определения бутонизации и временным разделением для набора тестовых данных и сравнение с выполнением автоматизированного алгоритма.)
  4. Когда все параметры установлены, нажмите кнопку "Анализ", чтобы:
    1. Минусыtruct массивы для каждого измерения и сырые вычитания фона (измеряется как средняя интенсивность не-зоне соты первым кадром в каждой флуоресцентной кино, или может быть указана для учета средней флуоресценции на клетку пиксель).
    2. Установить сглаживание сплайна выбранных измерений устранить высокочастотный шум измерения (как описано в 9).
    3. Автоматическое определение появления бутонов и раз деление клеток для каждой ячейки на основе изменения наклона временного ряда объему, как описано в пункте 9. Бутон измерений будет добавлена ​​к измерениям матери между возникновением и деление каждого цикла для целого ряда смежных время клетки. Нормированные ход клеточного цикла рассчитываются также в диапазоне от 0 до 2 из деления до деления.
    4. Установить сглаживание сплайна принять стабильное 1-й и 2-й производных выбранных измерений. (Для целей хорошо определенных производных, временные рядывыполнены непрерывными на разделение путем сдвига данных для следующего клеточного цикла для удовлетворения конечную точку для предыдущего цикла.)
    5. Выводит в сырой и серии сглаженные временем для всех регионов и целых клетки сглаженный, непрерывной и дифференцированные временные ряды в качестве массива для каждого измерения. Первым элементом является показателем цвета для вычитания фона, остальная часть первой строки имеет идентификаторов сот, остальные первый столбец номер кадра, а остальные элементы проводить временного ряда для каждой отдельной ячейки в столбце с каждой строкой соответствующий кадр в первом столбце. Аналогичный массив клеточного цикла временных рядов и линии информация также будет выходом. Массив "LineageArray" содержит таблицу с каждой строке, представляющей мать-буд отношения и с первого по пятый столбцы матери ID, ID бутон, кадр первый регион, бутон, по оценкам, начинающий кадров, а также предполагаемая кадров дивизии. Данные экспортируются в *. Мат файла (MATLAB файл данных).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Успешно проведен эксперимент проанализировал даст основном непрерывного времени для одно целых клеток с реально назначены появление бутонов и разделение раза. В качестве примера, мы провели выше протокол с гаплоидный штамм дрожжей, экспрессирующих интегрированную копию Серулин флуоресцентный белок (CFP) с приводом от конститутивного промотора ADH1 наблюдать, как рост и глобальную выражение может изменяться с течением времени в отдельные клетки (табл. 4, Y47 ). Мы провели анализ временных рядов для получения целой клетки (рис. 7А) измерений с течением времени, и зависимость от клеточного цикла возникает как для объема и выражения, которые содержатся в 9. После бутонизации, общий суммарный объем (мать + бутон) растет быстрее, чем раньше появления бутона (в соответствии с 8,16), а концентрация белка или средней интенсивности, немного уменьшается (рис. 7В и 7С). Рост комбинированного IntegraТед белка (Том X концентрации в данном случае) также ускоряет после начинающим (рис. 7D). По сравнению с матерью региона отдельно (рис. 7B & D), эти результаты показывают важность правильного включения бутон вкладов в целом измерительной ячейки и подчеркивают необходимость для правильного формирования бутона и заданий с временным разделением. Как мы уже сообщали 9, мы можем использовать дифференцированные временные ряды для расчета мгновенной относительной уровне мРНК М (Т) и скорость транскрипции (T), которые оба также увеличится после начинающим (7E 7F и рис):

Уравнение 1
где Р (Т) общего белка в момент времени T и γ M является скорость деградации мРНК 0,04 мин -1

Способность генерировать стабильные производные по времени измерения временных рядов также приносит пользу кинетические исследования. Мы используем штамм дрожжей выражения наблюдаемых, химерические транскрипционного фактора с отключаемым активности транскрипции (табл. 4, Y962). Фактор транскрипции мастер пути фосфата голод, Pho4p, контролируется с помощью ядерно-цитоплазматических локализации в ответ на внеклеточный concentratio фосфат N 18. Мы заменили ДНК-связывающий домен Pho4p с тетр, который связывает Tet оперона (Teto) и С-конца слиты новый фактор транскрипции для желтого флуоресцентного белка для создания Pho4-тетр-YFP 9. При переключении уровень фосфата в перфузии СМИ, тогда мы могли бы переключать выражение интегрированного CFP обусловлено синтетической промоутера состоит из 7 Teto сайтов связыванияй CYC1 минимальный промотор (7xtetOpr-СФП). Анализ временных рядов показывает, когда фактор транскрипции локализуется в ядре (с использованием слияния ППП и ядерный белок Nhp2p создать ППП на основе ядерной маску подсети, как на стадии 2.9-10), а когда ген-мишень запускает и останавливает транскрипции (рис. 8). На основе анализа производных серии с течением времени, активации и деактивации раз целевой промотора в каждой отдельной ячейки можно сделать вывод, даже когда концентрация стабильного флуоресцентные репортер высока.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема протокола. Протокол описывает шаги 1) микрожидкостной культуры, 2) флуоресценции, покадровой микроскопии, 3) анализ данных и

Рисунок 2
Рисунок 2. FormatData GUI. Интерфейс используется для импорта, формат и сегмент данных изображения для последующего расчета и визуального осмотра. Цифры указывают протокол шаг соответствующие каждому компоненту. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. SegTest GUI. Интерфейса используется для проверки ячейки сегмента Ation параметры и визуально подтвердить сегментации точности, как в пункте 2.7.

Рисунок 4
Рисунок 4. ColorThreshTest GUI. Интерфейса используется для проверки пороговой интенсивности, необходимых для создания субклеточную маски от выбранного канале флуоресценции, как в пункте 2.10.

Рисунок 5
Рисунок 5. ProcessTimeSeries GUI. Интерфейса используется для измерения, отслеживания визуальный осмотр и редактировать ячейки регионов и рода заданий. Числа указывают на протокол шагом соответствующие каждому компоненту.целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 6
Рисунок 6. AnalysisParams GUI. Интерфейс используется для ввода параметров, необходимых для анализа временных рядов, как в шагах 4.3 и 4.4.

Рисунок 7
Рисунок 7. Одноклеточные временных рядов гаплоидных дрожжей, экспрессирующих ADH1 пр-CFP микрожидкостной в культуре на протяжении нескольких поколений. (A) Светлое поле (верхний ряд) и CFP (нижний ряд) микрофотографии показаны в указанные моменты времени для ячейки в течение всего эксперимента . Для сегментированных материнской клетки (синие, очерченныхNE) и почек (зеленый контур), прилежащей целом ячейка обведена красным. Сырье матери и бутона (B) объем и (С) концентрация белка временные ряды были сглажены, чтобы удалить измерения шума и (D) интегрированная CFP флуоресценции рассчитывается как произведение объема и концентрации. Вся камера (красный) следа распространяется прошлом подразделение хранения общего, что легко помещается в дифференцируемых сплайнов во всех подразделениях (В и D). (E) относительный уровень мРНК и (F) мгновенная скорость транскрипции рассчитываются с использованием уравнений (1-2) и сплайн вписывается в (D).

Рисунок 8
Рисунок 8. Промоутер скорость транскрипции ответ на ядерно-цитоплазматическихчелночного Pho4-YFP слияния в одиночных клетках дрожжей. (A) микрофотографии от четырех указанных каналов приобретения показаны для ячейки с переключаемых YFP слившихся Pho4-тетр трансактиватора, что (B) локализуется в RFP-ядра отмечены в ответ к низким содержанием фосфата и (С) управляет экспрессией 7xtetOpr CFP-репортера. (D) Предполагаемая скорость транскрипции изменения с локализацией в среднем (черная линия) и на уровне одной клетки (красные и пурпурные линии, где красный представляет смежных ячейку области, выделенных красным цветом). Резкие перепады CFP выражение в B совпадает с клеточным делением, когда некоторые белка теряется в дочернюю клетку.

Название измерения Описание
Время Число кадров изображения
Область Общее количество OF пикселей содержащие региона
Объем (4/3) πabc, где а = ½ длиной главной оси регионе, B = ½ длина малой оси, а с = Ь или ½ "Высота камеры" (выбирается меньшее)
(X) _ (Y) означает, Средняя интенсивность пикселя для региона маску (Y) в цветовой канал (X)
(X) _ (Y) средний Медиана пиксель для региона маску (Y) в цветовой канал (X)
(X) _ (Y) STD Стандартное отклонение интенсивности пикселей для региона маску (Y) в цветовой канал (X)
(X) _ (Y) IQR Межквартильный диапазон интенсивности пикселей для региона маску (Y) в цветовой канал (X), 75-й процентиль - 25-й процентиль значения
(X) _ (Y) T20pct Средняя интенсивность для 20% от интенсивности пикселей для маска региона (Y) в цветовой канал (X). Использоватьполезными в сравнении с следующего измерения для определения внутриклеточной локализации без маску.
(X) _ (Y) B80pct Средняя интенсивность для нижних 80% интенсивности пикселов в области маски (Y) в цветовой канал (X). Полезное по сравнению с предыдущим измерением для определения внутриклеточной локализации без маску.
(X) _ (Y) M50pct Средняя интенсивность для среднего 50% от интенсивности пикселей для маска региона (Y) в цветовой канал (X)
(X) _cellint Комплексная флуоресценции цветовой канал (X) (средняя интенсивность пикселя х объем) для всей клетки (мать и на любой подключенный BUD)
(Z) Сырье Сырье данных временных рядов на выходе "анализу временных рядов" для переменных (Z)
(Z) Гладкий Сплайн сглаженный сырых данных временных рядов на выходе "анализу временных рядов" для переменных (Z)
(Z) Всего Целой клетки (м+ прилагается другой бутон (Z) Rawsmooth) временных рядов данные, выводимые "анализу временных рядов" для переменных (Z)
(Z) Cont Суммарные данные ячейки Время непрерывной серии сделаны в подразделениях («нарастающим итогом») на выходе "Анализ временных рядов" для переменных (Z)
(Z) WhSmooth Сплайн-сглаженной (Z) целая клетка данных временных рядов на выходе "анализу временных рядов" для переменных (Z)
(Z) ДДТ Первый раз производных сплайн-сглаженной (Z) целая клетка данных временных рядов на выходе "анализу временных рядов" для переменных (Z)
(Z) d2dt2 Второй производной по времени сплайн-сглаженной (Z) целая клетка данных временных рядов на выходе "анализу временных рядов" для переменных (Z)

Таблица 1. Измерение переменного номенклатуры в ProcessTimeSeries GUI.

Цвет Cell ID Lineage статус
желтый Мать назначен
розовый новая почка (красная линия, проведенная к установленному матерью)
зеленый Нет матери назначена

Таблица 2. Cell ID цветовой код для линии статуса задания.

Имя файла Описание
FormatData.m Ввод данных графический интерфейс, который форматов фильмов и сегментов BF изображений для обработки ProcessTimeSeries.m
FormatData.fig FormatData GUI расположение окон
BFsegment.m BF модуль сегментации, с extractregions2.m и segmentregions.m
SegTest.m Сегментация качества тестирования GUI
SegTest.fig SegTest GUI расположение окон
extractregions2.m Первый компонент модуля сегментации BF определить регионы
segmentregions.m Второй компонент модуля сегментации BF для разделения и чистых регионов клетке
color2submask.m Флуоресценции на основе подмаску модуль сегментации
ColorThreshTest.m Флуоресценции на основе порога маски тестирования GUI
ColorThreshTest.fig ColorThreshTest GUI расположение окон
tiffread2.m Экстракты данных *. TIF или *. STK файлы для использования в MATLAB
imalign.m Изображение регистрацию с использованием 2D взаимной корреляции
ProcessTimeSeries.m Обработка данных, которая отслеживает GUI регионов, назначает линий, а также позволяет визуальной коррекции ошибок. Также обеспечивает графический интерфейс построения возможностей и выводит цельноклеточная данных временных рядов
ProcessTimeSeries.fig ProcessTimeSeries GUI расположение окон
cleanMask.m Устраняет маску регионов на основе параметров в ProcessTimeSeries GUI
track.m Треки клетки регионов на основе региона центроидами
OptimizeLineages.m Модуль Lineage назначение определяет оптимальную мать-буд отношения, основанные на физических расстояний и прошлые и будущие события начинающих
getClosestObjects.m Находит соседних ячеек для каждого нового идентификатора соты (BUD)
SelectVariables.m GUI для выбора единиц измерения для выбора переменных, представляющих интерес
SelectVariables.fig SelectVariables GUI расположение окон
GeneratePlots.m Построение графического интерфейса для данных в окне ProcessTimeSeries
GeneratePlots.fig GeneratePlots GUI расположение окон
AnalyzeCellSeries.m Анализ временных рядов модуль определяет время клеточного деления, и выводит все измерения клетки, как описано в тексте
assignDivisionsInf2.m Назначает почки прорастают и время деления клеток
AnalysisParams.m Сотовые анализ временных рядов входной параметр
AnalysisParams.fig AnalysisParams GUI расположение окон

Таблица 3. ПРОТЕЗОВ описаний файлов.

Штамм ID Генотип (W303 основе) Ссылка
Y47 MAT leu2 :: ADH1pr-CFP-hisG :: URA3 :: KanR :: hisG 19
Y962 MAT ADE + NHP2 :: RFP-NAT spl2Δ :: LEU2 pho4 :: TRP1 pho84Δ:: Klura3 phm4 :: HIS3MX6 leu2Δ :: TEF1m7pr-PHO4ΔP2-тетр-cYFP URA3 :: 7xtetOpr-CFP 9

Таблица 4. Штаммы дрожжей, используемый в данном исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Выше протоколе описывается простой метод для получения и анализа данных флуоресценции временных рядов с ограниченным опытом в микрофлюидики или в разработке программного обеспечения. Это позволяет получить покадровой фильмы флуоресценции одиночных клеток дрожжей; извлечь соответствующий размер ячейки и выражения измерений; викария отслеживания и рода работу, а также анализа поведения целых клеток в течение долгого времени с использованием коммерчески доступного устройства микрожидкостной культуры и универсальный графический пользовательский интерфейс (GUI). В то время как экспериментальные, сегментация и отслеживание шаги были подходить по-разному ранее 11,13,14, описанная выше процедура разработана, чтобы сделать эти технологии более доступными для более широкого подмножество биологии сообщества. Хотя приведенные выше процедуры оптимизированы для конкретного устройства микрожидкостной культуры, общий анализ может быть адаптирована для подобных устройств, как имеющийся в наличии микрожидкостной Технологии Культура стать дешевле и более настраиваемый. Фундаментentally, сегментация и алгоритмы области измерений мы используем, являются аналогичными существующим методам 13,14, но трансплантаты программного обеспечения добавлена ​​возможность визуально курировать отслеживания региона и рода задания и назначить клеточного цикла фазы точно. Обе эти функции являются ключевыми для точного расчета времени производные серии данных.

Есть несколько шагов в протоколе, который существенно повлиять на качество получаемых данных временных рядов. Первоначально перегрузки культуры камере с клетками снизится перфузии в камере (особенно заметно в кинетических экспериментов где камеры Время обновления важно), а разрастание произойдет ранее в ходе времени эксперимента. Лучше всего этого можно избежать, начиная с более низким давлением нагрузки сотовой ячейки для сокращения времени и постепенно увеличивается одно или оба до соответствующей клеточной плотности, пока не будет достигнута. Этап выбора позиции для работы с изображениями является связанной и в равной степени важны значиeration. Зная время удвоения напряжения, план сколько ячеек будет в кадре изображения с течением времени и предвидеть, как повлияют скученности СМИ диффузии. Десять Диспергированные клетки вырастет на десять микроколоний, но десять клетки изначально группируются превратится в одну большую колонию (мы заметили питательных ограничения диффузии в 6 фунтов на квадратный дюйм к центру колонии, когда она больше, чем ~ 14 клеток в диаметре) . Дополнительные усилия в верхнем шаги протокол также облегчает ручной курирования данных позже, и улучшает время выхода серии. Убедитесь, что пластина прочно закреплено на сцену и использовать опцию регистрации изображений в FormatData GUI, чтобы значительно улучшить точность автоматического отслеживания отдельных клеток с течением времени. Проведите время в выборе наилучших параметров сегментации также уменьшить количество ошибок, которые требуют внимания. Отслеживания программного обеспечения лучше всего работает с небольшим oversegmentation клеточных регионах, а не потому, что undersegmentation remergingразделение клетка является более простой задачей, чем рисование линий разделить регионах, однако, увеличение oversegmentation увеличивает ошибки в линии назначений в связи с наличием ложных, новые регионы. Кроме того, убедитесь, что все матери-буд отношений назначены должным образом, так что измерения для всей клетки будет точно. Если почка пропущенные сегментации или растет вне границы изображения, рассмотреть вопрос о прекращении ряда данных матери, чтобы предотвратить ложные результаты. Это легко сделать, изменив матери регион уникальный идентификатор (ID введите "0") на ошибочных кадров, и использование "Удалить все", чтобы удалить все будущие случаи нового ID. Пристальное внимание к этим шагам будет в значительной степени повысить точность исходных данных временных рядов.

Чтобы установить действительны интерпретация выходных данных, нажав кнопку "Анализ временных рядов", мы рекомендуем несколько дополнительных запросов. Проверка появление бутонов и разделение раз точно определяется на основании пользовательского InpuТ параметрах. Ручная запись бутонизации и разделение раз для набора тест фильм и сравнить с результатами алгоритма. Чтобы визуально оценить время цитокинезу завершает между матерью и дочерью, посмотрите на их границе с узким и темным. (NB:. Тестируемого штамма с флуоресцентной отмечены ядра помогает в руководстве наблюдение с временным разделением Другой метод будет флуоресцентной отметить плазменные мембраны и искать разрыв между матерью и дочерью, чтобы закрыть клетку.). Кроме того, проверки общей флуоресценции на клетку лучше рассчитывается как средняя интенсивность область, умноженную на объем (когда захваченный свет исходит из тонкого поперечного сечения клетки) или в качестве интегрированного флуоресценции в регионе (когда захваченный свет исходит от всей клетки). Если флуоресценции профиль через ячейки соответствует кривой полуэллипса описывается большой и малой осей области 7, захваченный свет исходит от всей клетки, а общее флуоресценции шоüld рассчитывается как (средняя интенсивность) х (области). В нашем случае при 63X с глубиной резкости гораздо меньше, чем высота ячейки, флуоресценция профиль является относительно плоской и общей флуоресценции рассчитывается как (средней интенсивности) х (объем). Другим аспектом является фотообесцвечивания флуорофором. Программное обеспечение не считает фотообесцвечивания в анализе, и, следовательно, выход флуоресценции временных рядов представляет только наблюдаемые репортера. Фотообесцвечивание процессов сильно зависит от приобретения и настройки временной интервал используется для получения флуоресцентных изображений, характер флуорофора и различные другие эксперимент конкретных параметров. Фотообесцвечивание также не может быть хорошо описывается простой, скорости первого порядка выражение, которое предотвращает общий алгоритм его лечения. Поэтому мы не учитывают фотообесцвечивания в выходной временных рядов, но аналитический метод может быть использован для измерения кинетики этого процесса для интерпретации пользователем. Наконец, выберите smoothiнг параметрам подходят для наблюдаемого временного ряда. В идеале, сглаживающих сплайнов позволит устранить высокочастотный шум измерения при сохранении реальных особенностей в данных. Параметры, необходимые для достижения этой цели зависит от характеристик конкретного временного ряда и может изменяться между экспериментами.

Программное обеспечение было предназначено, чтобы быть гибким для анализа различных покадровой флуоресцентной микроскопии. Любое количество цветовых каналов могут быть включены и любой может быть использован для создания суб-области маски. В то время как алгоритмы хорошо работают для фильмов перспективных дрожжевых клеток, многие из функциональных должно распространяться на фильмы других организмов. Область измерений (за исключением объема), отслеживание и курирование зависят только от ячейки маску и, таким образом, адаптации. Сегментация, Lineage назначения, определение клеточного деления, и время модули серии анализ может быть независимо изменены в соответствии с конкретными потребностями. Кроме того, вместо использования включен себеgmentation модуль, предварительно сегментированных маска фильм может быть введен, и фазово-контрастной или дифференциального интерференционного контраста изображения может быть заменен на светлом поле. Графические интерфейсы могут быть использованы в первую очередь для отслеживания и хранения ID и рода заданий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

Мы благодарим Эмили Джексон, Джошуа Зейдман, а Николай Реном для комментариев на программное обеспечение. Эта работа финансировалась GM95733 (в Нью-Мексико), BBBE 103316 и Массачусетский технологический институт запуске фондов (в нм).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Y04C Yeast Perfusion Plate CellAsic Y04C-02
ONIX Microfluidic Perfusion Platform CellAsic EV-262
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC objective Zeiss 440762-9904-000
Cascade II EMCCD camera Photometrics
Lumen 200 metal-halide arc lamp PRIOR Scientific
Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set Chroma Technology Corp set #89006 Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 controller and filter wheels Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a Mathworks 64-bit version handles large data files better than 32-bit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7, (5), 383-392 (2009).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307, (5717), 1962-1965 (2005).
  3. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  4. Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8, (5), 431-433 (2012).
  5. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332, (6028), 475-478 (2011).
  6. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123, (6), 1025-1061 (2005).
  7. Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332, (6028), 472-474 (2011).
  8. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38, (8), 2676-2681 (2010).
  9. Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. Submitted (2013).
  10. Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5, (9), e239 (2007).
  11. Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1, (1), 2005.0024 (2005).
  12. Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, (7131), 46-51 (2007).
  13. Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3, (1), e1468 (2008).
  14. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4, (2), 175-181 (2007).
  15. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9, (1), 62-66 (1979).
  16. Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23, (12), 1408-1422 (2009).
  17. To, T. -L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327, (5969), 1142-1145 (2010).
  18. O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271, (5246), 209-212 (1996).
  19. Raser, J. M., O'Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304, (5678), 1811-1814 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics