Levende Cell Imaging af Early Autophagy begivenheder: Omegasomes and Beyond

1Signalling Programme, The Babraham Institute, 2MRC Group, Cardiff School of Biosciences, Cardiff University
Published 7/27/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Time-lapse mikroskopi af fluorescens-mærkede autophagy markører muligt at overvåge den dynamiske autophagy respons med høj tidslig opløsning. Ved hjælp af konkrete autophagy og organel markører i en kombination af 3 forskellige farver, kan vi følge det bidrag af et protein til autophagosome dannelse i en robust rumlig og tidsmæssig sammenhæng.

Cite this Article

Copy Citation

Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond. J. Vis. Exp. (77), e50484, doi:10.3791/50484 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Autophagy er et cellulært respons udløst af mangel på næringsstoffer, især fraværet af aminosyrer. Autophagy er defineret ved dannelsen af ​​dobbelt membran strukturer, kaldet autophagosomes, der udskille cytoplasma, langlivede proteiner og protein aggregater, defekte organeller, samt virus eller bakterier. Autophagosomes sidst fusionere med lysosomer, der fører til hovedparten forringelse af deres indhold, med de producerede næringsstoffer bliver genbrugt tilbage til cytoplasmaet. Derfor autophagy er afgørende for cellehomeostase og dysregulering af autophagy kan føre til sygdom, især neurodegeneration, aldring og kræft.

Autophagosome dannelse er en meget omfattende proces, hvor cellerne har afsat en specifik gruppe af proteiner, kaldet kernen autofagi maskineri. Kernen autophagy maskineri er funktionelt suppleres med yderligere proteiner involveret i diverse cellulære processer, fx i membrane menneskehandel, mitokondrie-og lysosomale biologi. Koordinering af disse proteiner til dannelse og nedbrydning af autophagosomes udgør den meget dynamisk og sofistikeret respons autophagy. Levende celler gør det muligt at følge den molekylære bidrag af hver autophagy-relateret protein ned til niveauet for en enkelt autophagosome formation begivenhed og i realtid, denne teknik giver derfor en høj tidslig og rumlig opløsning.

Her bruger vi en cellelinie stabilt udtrykker GFP-DFCP1 at etablere en rumlig og tidsmæssig sammenhæng til vores analyse. DFCP1 mærker omegasomes, som er precursor strukturer fører til autophagosomes dannelse. Et protein af interesse (POI) kan mærkes med enten en rød eller cyan fluorescerende tag. Forskellige organeller, såsom ER, mitokondrier og lysosomer, er alle involveret i forskellige trin i autophagosome dannelse, og kan mærkes med en specifik tracker farvestof. Time-lapse mikroskopi AUTOPHagy i denne eksperimentelle opsætning giver oplysninger, der skal udvindes om den fjerde dimension, nemlig tid. Derfor kan vi følge bidrag POI til autophagy i tid og rum.

Introduction

Autophagy er en meget dynamisk proces, som kræver koordinering af en lang række proteiner for det endelige resultat af autophagosome dannelse 1-3. Mikroskopi er nok den teknik mest anvendte til at studere autofagi 4.. Lokaliseringen af ​​de fleste autophagy proteiner er blevet grundigt undersøgt i fikserede celler, både ved immunofarvning de endogene proteiner og ekspression af fluorescens mærkede exogent protein. Derudover har elektronmikroskopi (EM), alene og i kombination med immuno-guld mærkning, beskrevet de fine detaljer i disse strukturer 5,6. Trods det faktum, at disse teknikker har etableret vores forståelse af autophagosome dannelse i de 3 dimensioner af rummet, har de undladt at give tilstrækkelig mængde af information om den 4. dimension - tiden. Levende cell imaging overvinder denne barriere, da det giver mulighed for at følge dannelsen af ​​et autophagosome så tæt som muble på realtid 7.. Denne teknik blev først ansat til at studere autophagy ved Yoshimori og kolleger 8, og har været stigende grad fremover.

Time-lapse-mikroskopi indfanger lokaliseringen af ​​IP i levende celler og over en tidsperiode. Ved at sammenholde disse oplysninger med en velkarakteriseret autophagy og / eller organel markør, kan levende cell imaging analyse sætte POI i den større rumlige og tidsmæssige sammenhæng autophagosome formation. Levende celler Analysen er baseret på den gentagne indfangning af POI lokalisering langs alle trinnene autophagosome dannelse, mens billeddannelse af fikserede celler er baseret på en enkelt capture. Derfor kan levende celler bevise bidrag POI på bestemte trin i autophagosome dannelse, mens billeddannelse af faste celler kun kan påtage sig rollen som POI, baseret på dens gennemsnitlige lokalisering i mange autophagosomes samtidigt fanget på forskellige stadier i deres lifecycle.

Selvom levende celler er en metode til høj analytisk magt, har det nogle iboende begrænsninger, som bør tages i betragtning. Først og fremmest, levende celler kræver ekspression af et eller flere eksogene fluorescensmærkede proteiner. Fluorescerende mærker tendens til at være store i størrelse, og de kan undertiden ændre adfærden af ​​et protein grundet steriske årsager. Denne situation er endnu tydeligere for membranproteiner, som de behøver for at fungere i den begrænsede plads i 2 dimensioner membraner. Det skal bemærkes, er autophagosomes hindeagtige strukturer, og følgelig deres dannelse kræver et stort antal af membran-associerede proteiner.

Et andet sæt af problemer er forbundet med ekspressionsniveauerne af POI. I princippet bør et exogent protein udtrykkes på niveauer svarende til det endogene protein. Dette sikrer, at vigtige regulatorer af sin sub-cellulære lokalisering ikke bliver mættet, og the analysen vil være biologisk relevant. Desuden bør overekspression af autophagy proteiner undgås, som når de udtrykkes over endogene niveauer, har de tendens til at hæmme autophagy respons 9.. Omvendt bør da ekspressionsniveauerne af POI være høj nok til at tillade efter lokalisering for en god tidsrum uden foto-blegning, et kompromis må nås. Opnåelse af optimale ekspressionsniveauer af et eksogent protein i pattedyr celler kræver en masse finjustering, men det kan lade sig gøre ved at etablere og screening cellelinjer stabilt udtrykker forskellige niveauer i POI.

Den rumlige opløsning, der kan opnås med standard fluorescensmikroskopi er en anden begrænsende faktor. Opløsning kan begrænses af en række årsager, men i bedste fald vil lateral opløsning være omkring 250 nm. Dette betyder, at genstande med en indbyrdes afstand mindre end dette vil forekomme tilsluttet (eller som en enkeltobjekt) og objekter mindre end 250 nm, vil blive repræsenteret i billedet større, end de faktisk er. Derfor billederne altid bør fortolkes med dette i tankerne og supplerende teknikker såsom EM vil være forpligtet til at løse fine ultra-strukturel detalje.

Endelig levende celler selv kræver eksponere en celle for lys, muligvis for en længere periode. Dette kan ændre de fysiologiske reaktioner i en celle, et fænomen kendt som foto-toksicitet.

Vi har med succes brugt levende celler billeddannelse af PI3P-bindende protein DFCP1 at beskrive for første gang, at autophagosomes stammer fra PI3P-rige ring-lignende strukturer betegnes omegasomes, som er i tæt samarbejde med ER tråde 10,11. Vi har klart vist, at LC3-positive strukturer begynder at danne i tæt samarbejde med omegasomes. Vi her foreslår, at ansætte en cellelinie stabilt udtrykker GFP-DFCP1 for den levende cellebilleddannelse af proteinet af interesse, etablerer en robust rumlige og tidsmæssige ramme til karakterisering af sin rolle i autophagosome formation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Cell Preparation

  1. Frø lavt antal passager af HEK-293T celler, der stabilt udtrykker GFP-DFCP1 på 22 mm runde dækglas, kultur celler natten over i Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM), til en konfluens på 30-40% (sigte mod en sammenflydning på 80% efter 2 dage - dag i levende celler).

2.. Celletransfektion

  1. Forbered transfektion kompleks blanding for hver plade, som indeholder 100 ul OptiMEM jeg reduceret serum medium, 3 pi X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent og 0,5 ug pECFP-LC3 plasmid DNA Bland forsigtigt ved pipettering op og ned og inkuberes 15 minutter ved stuetemperatur. [Note: Vi har gentagne gange konstateret, at andre transfektionsreagenser såsom Lipofectamine 2000 har en masse toksicitet, og desuden, de producerer fluorescerende partikler på deres eget, som interfererer med mange mikroskopi teknikker.]
  2. Aspirer mediet fra pladerne og tilsæt frisk DMEM forvarmet ved 37 ° C.
  3. Tilsæt transfection komplekset til celler ved pipettering, Cellerne inkuberes i 24 timer.

3.. Cell Inkubation med Organelbiosyntese Marker (valgfri)

  1. Tilføj MitoTracker / lysotracker til DMEM ved en endelig koncentration på 75 nM, og holde på is i en falk rør dækket med aluminiumsfolie, langs hele eksperimentelle dagen, for at undgå udsættelse for lys og gentagne frysning og optøning cyklusser.
  2. Fjern en portion af 2 ml af MitoTracker / lysotracker-holdigt medium og varme op ved 37 ° C, aspireringsstilling medium fra transficerede celler og erstatte med MitoTracker / lysotracker-holdigt medium og inkuberes celler i 30 - 60 min.

4.. Udarbejdelse af rugekammeret til Live Cell Imaging (figur 1)

  1. Ren metal og plast O-ringe med 75% ethanol og anvende silikonefedt på randen af ​​metal O-ring.
  2. Ved hjælp af pincet fjerne dækglasset fra pladen og tørre den overskydende medie fra bunden af ​​dækglasset,undgå at blande for meget medium med fedt, da dette vil øge sandsynligheden for lækage.
  3. Lad dækglasset at hvile på afsatsen af ​​plast O-ring og passer metal O-ring på toppen af ​​plast O-ring, med dækglasset mellemlæg, for at skabe et lukket kammer.
  4. Top op kammer med mediet fra pladen, fra dette punkt og, forlænget inkubation af cellerne i DMEM-medium undgå uden et buffermiddel, for at forhindre ændringer i pH at forekomme, da det bicarbonatbuffer system DMEM kræver kunstig CO 2-koncentration på 5-10% og CO 2-koncentration af luften er meget lavere.

5.. Udsultning af celler

  1. Sæt rugekammeret på objektbordet.
  2. Aspirer det komplette medium og vaskes med 2 ml af sult medium 3 gange, for at sikre, at ingen aminosyrer er forblevet fra DMEM, som til sidst vil hæmme autofagi reaktion; indstiltimeren ON.

6.. Microscopy

  1. En passende imaging system konfigureret til levende celler bredt felt epi-fluorescens vil være påkrævet. Dette vil typisk omfatte et forsknings-grade inverteret mikroskop frame, en intens bredspektrede lyskilde, spejle og filtre er specifikke for det fluorescerende protein (r) / farvestof (r) af interesse, en høj kvalitet objektiv, en følsom CCD / sCMOS kamera og en rugekammeret. Alle de store mikroskop producenter tilbyder komplette bred agersystemer passende for levende celler, men det er også muligt at home-bygge et system ved hjælp af komponenter fra en række producenter og styre det ved hjælp af open source software, såsom Micro-Manager ( http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki / ). Det vigtigste aspekt i vores udtalelse er at bruge et system med høj følsomhed, således at udtrykket niveauer af fluorescerende journalister kan holdes på et minimum.
  2. Selecting de passende celler til image.
    1. Vælg store og flade celler, der vil give mere autophagosome dannelse begivenheder, der skal tages. Også vælge celler, der allerede er begyndt at producere et større antal omegasomes.
    2. Start videooptagelse efter 30 min eller godt ind i autophagy respons, med henblik på at erobre en større andel af autophagosome dannelse begivenheder pr video.
  3. Imaging.
    1. Brug en høj forstørrelse linse (100x 1,4 NA).
    2. Justere intensiteten af ​​excitationslyset til 10-20% af maksimum for at forhindre fotoblegning.
    3. Indstil kameraet (Hamamatsu ORCA ER, pixelstørrelse 6.45 um) til 100-500 msek eksponering 2x2 Binning og 100 gevinst.
    4. Indstil billede erhvervelse sats til 1 frame hver 10 sek.

7.. Oprettelse montager af autophagosome dannelse hændelser med ImageJ

[Dette kan gøres på en ikke-systematisk måde ved blot at scanne den fusionerede video til eventilationskanaler af interesse, men det kan også være systematiseret som beskrevet nedenfor.]

  1. Åbne billedstakke for 3 (eller 2) erobrede kanaler i ImageJ / Fiji.
  2. Anvend grøn, rød og blå LUT (opslagstabeller) til den tilsvarende kanal fusionere 3 farver og gem.
  3. Fra analyse-fanen, vælg Værktøjer> ROI leder ... > Angiv, og vælg derefter en tilfældig område defineret størrelse i det første billede af stakken.
  4. Fra fanen Billede, skal du vælge to eksemplarer, med henblik på at duplikere det valgte område i stakken.
  5. Fra fanen Billede, Stakke vælge> Lav montage ... at skabe en foreløbig montage indeholdende alle rammer fanget. Scan alle rammer i montage for en komplet autophagosome formation begivenhed, holde noter af første og sidste frame af begivenheden.
  6. Fra analyse-fanen, vælg Værktøjer> ROI leder ... vælge det samme område i det første billede af stablen for de andre 2 farver samt for det fusionerede farver billedet og duplikere stakke.
  7. Fra tHan Fil fanen, vælg Nyt> Billede og indstillet til bredden i forhold til antallet af pixels oprindeligt udvalgte hjælp ROI leder, der er fastsat for højden 4 gange højden indstillet i ROI leder plus 3 pixels for plads i mellem de 3 farver og de flettes, og sæt Skiver som antallet af frames i hver stak.
  8. Fra fanen Billede, skal du vælge Stakke> Værktøjer> Indsæt ..., derefter indsætte hver sub-stack oven på hinanden, efterlader plads på 1 pixel i mellem.
  9. Fra fanen Billede, Stakke vælge> Lav montage ... at skabe en montage start og efterbehandling med den første og sidste billede i autophagosome dannelse fanget begivenhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I protokollen beskrevet, har vi brugt time-lapse mikroskopi til at følge lokalisering af FFP-mærket LC3 i en cellelinje stabilt udtrykker GFP-mærkede DFCP1 under autophagy inducerende betingelser. Resultatet af dette eksperiment er erobringen af ​​2. serie eller stakke af billeder, et fra den grønne og en fra den blå kanal, svarende til GFP-DFCP1 og CFP-LC3. Vi har yderligere analyseret disse videoer ved hjælp ImageJ, for at skabe montager, der svarer til en enkelt autophagosome dannelse begivenheder, som beskrevet i protokollen afsnit. Denne analyse tillod os at bevise, at en LC3-positive autophagosome stammer fra en DFCP1-positive omegasome. I montagen vist i figur 2, bliver dannelsen af en omegasome fremgår den anden ramme, i form af en lille plet. Den omegasome begynder at udvide for at danne den karakteristiske ringlignende struktur, og når sit maksimum diameter efter 6 min. Dernæst omegasome starter collapsing og sidst det forsvinder, efter ca 10 min. Sætte nu dannelsen af ​​LC3-positive struktur eller autophagosome i forbindelse med den omegasome dannelse, vi observerer, at autophagosome vises efter omegasome, og bliver tydeligt efter ca 1,5 min. Den autophagosome begynder at udvide i tæt samarbejde med omegasome, første spot og derefter ring, og når omegasome begynder kollapse autophagosome knopper af. Til sidst autophagosome bliver tilbage, tilsyneladende for at fusionere med lysosomerne, efter omegasome forsvinder. Denne analyse giver en klar indikation om det funktionelle forhold mellem de 2 strukturer, hvorefter LC3 positive autophagosomes stammer fra tilsvarende omegasomes.

I et andet eksempel, har vi tilføjet en Lysosom tracker for at fange den tidslige og rumlige sammenslutning af de dannende autophagosome med lysosomer (figur 3

Dog kan den samme slags analyse producere uninterpretable resultater, på grund af en række forskellige årsager. I eksemplet vist i figur 4, bliver resultaterne uninterpretable skyldes et skred i fokus. Videoen starter med held fange dannelsen af ​​et autophagosome dog et skred i fokus sker efter 3 min mark. Den videooptagelse fortsætter ud af fokus for de næste 6 min, men til sidst er fokus manuelt korrigeres efter de 9 til 10 min mark. Denne analyse dog gør det umuligt at skelne, om den autophagosome formation hændelse fanget, når fokus er rettet er denindledende begivenhed, som er næsten afsluttet, eller en ny, som er startet efter afdrift i fokus.

Yderligere problemer kan tilskrives sammenflydning af de dyrkede celler. For eksempel, når celler dyrkes ved højere end optimal sammenflydning er de tvunget til at ekspandere på toppen af ​​en tilstødende celle, hvilket gør fokuserer ganske udfordrende. Desuden celler, der er dyrket ved høj konfluens tendens til at blive stresset, øge niveauet af baggrunden autophagy aktivitet før indledningen af ​​sult.

Endelig fluorescens-relaterede emner er ganske almindelige. FFP har svagere fluorescens aktivitet sammenlignet med GFP, og ofte får foto-bleget i senere faser af den video optagelser. Analyse af sådanne videoer kan føre til falske negative konklusioner om den rumlige sammenslutning af POI med dannende autophagosomes. Dog kan disse problemer løses ved hjælp af en af ​​varianter, såsom mTurquise2. Et andet fælles phenomenon skyldes, at fluorescensen af ​​røde mærker ikke standses ved lavere pH af lysosomer. Mange autophagy proteiner fysiologisk afslutte deres livscyklus i lysosomer, mens autophagosomes sidst fusionere med lysosomer. Desuden er ikke-funktionelle proteiner ofte målrettet til nedbrydning i lysosomer. Derfor kan man ende op efter ikke-relaterede sammenslutning af autophagosomes med lysosomer, i stedet for en egentlig fysisk sammenslutning af mellem en rød-tagget POI og omegasomes.

Figur 1
Figur 1.. Rugekammeret. Den plastiske O-ringen passer rundt om kanten af metal O-ring og har forneden en tynd afsats, der strækker sig indad. Dækglasset placeres på afsats af plast O-ring, og dernæst plastik O-ring er monteret i bunden af ​​metal O-ring. Denne måde, dækglasset er sandetwiched mellem de 2 O-ringe, hvilket skaber et lukket kammer.

Figur 2
Figur 2. Celler, der udtrykker GFP-DFCP1 og den fælles fiskeripolitik-LC3 blev sultet i 30 min og filmede med en hastighed på 1 frame hver 10 sek. En montage af en repræsentativ autophagosome formation Arrangementet præsenteres. Signaler fra grønne og blå kanaler er pseudo-farvet grøn og rød tilsvarende. Pile angiver den første mærkbare omegasome og autophagosome. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3.. Celler, der udtrykker GFP-DFCP1 og den fælles fiskeripolitik-LC3, blev inkuberet med lysotracker rød, sultet i 30 min, og filmede med en hastighed på 1 frame hver 15 sek. En montage af en repræsentativ autophagosome formation Arrangementet præsenteres. Signaler fra grøn, rød og blå kanaler er pseudo-farvet grøn, blå og rød tilsvarende. Pile angiver den første mærkbare omegasome og autophagosome. Arrowhead angiver det første fangst af autophagosome fusion med lysosomet. Klik her for at se større figur .

Figur 4
Figur 4.. Celler, der udtrykker GFP-DFCP1 og den fælles fiskeripolitik-LC3 blev sultet i 30 min og filmede med en hastighed på 1 frame hver 10 sek. En montage af et eksempel på sub-o ptimal capture præsenteres. Signaler fra grønne og blå kanaler er pseudo-farvet grøn og rød tilsvarende. Pile angiver den første mærkbare omegasome og autophagosome. Klik her for at se større figur .

Video 1. Video af autophagosome formation hændelse beskrevet i figur 2.. Afspilningen sats er 4 frames per sekund. Klik her for at se filmen .

Video 2. Video af autophagosome dannelse begivenhed præsenteret i fig. 3. Pilen angiver første, dannelsen af den omegasome, og for det andet, fusion af autophagosome med lysosomet. Afspilningen sats er 4 frames per sekund."> Klik her for at se filmen.

Video 3. Video af autophagosome formation hændelse vist i figur 4.. Afspilningen sats er 4 frames per sekund. Klik her for at se filmen .

Tabel 1. Liste over specifikke reagenser og udstyr, der kræves for den protokol, sammen med den tilsvarende udbyder og katalognummer.

BUFFERS

Buffer Sammensætning Trin Bruges
Sult medium 20 mM HEPES pH 7,4 5.2
140 mM NaCI
1 mM CaCl2
1 mM MgCl2
5 mM glucose
1% BSA

Tabel 2. Liste af buffere anvendes i denne protokol. De anvendte buffere er deres sammensætning og det første skridt, hvor de anvendes i protokollen opført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden i denne protokol giver mulighed for visualisering af et protein lokalisering under autophagosome formation. Vi har prøvet forskellige metoder til at visualisere begivenhederne beskrives, herunder point-konfokal, spinning disk konfokal og total intern refleksion Fluorescens (TIRF) mikroskopi. Vi har fundet, at til generelle formål standard Vidvinkelbilledet epi-fluorescens giver det bedste kompromis mellem følsomhed og opløsning. Dette sikrer god signal til støj minimal photo-bleaching/photo-toxicity og hurtig overtagelse. Manglen på optiske sektionering er ikke et problem, hvis passende områder af cellen er valgt for billedet, dvs periferien hvor cellen er spredt og flad. Men det er vigtigt, at billeddannelse anvendte system er konfigureret til (både med hensyn til den anvendte hardware og systemets indstillinger).

For bedst rumlig opløsning, anbefales det at bruge en høj forstørrelse, hIGH blændetal olieimmersion linse (nedsænkning i vand linser vil tilbyde nogen fordel imaging på tæt nærhed til dækglasset). Det foreslås at balancere intensiteten af belysningen (f.eks med neutralfiltre), kameraindstillingerne (eksponeringstid, arkivering og forstærkning) for at maksimere signal-støj og minimere blegning. Dette vil have til at ske empirisk, men som en guide, vi når du bruger en 100x 1,4 NA linse reducerer typisk magt i vores excitationslys til 10-20% af den maksimale og indstille kameraet (Hamamatsu ORCA ER, pixelstørrelse 6.45 pm) til 100-500 msek eksponering, 2x2 arkivering og 100 gevinst.

Billedet købet sats bør fastsættes i intervallet 1 frame hver 1-10 sek. Erhvervelse billeder ved højere frame rates vil sikre en bedre kontinuitet mellem billederne (bedre tidsopløsning), men vil udsætte celler til mere lys og dermed øge photo-bleaching/photo-toxicity.

Hvis imaging mere fluorescence-kanaler, skal det sikres, at forsinkelsen mellem kanalen capture er minimeret (reducere eksponeringstiden, passer hurtige filter skiftere). Dette vil reducere risikoen for bevægelsesartefakter optræder i det sammensatte billede. Hvis bevægelsesartefakter er vanskelige at undgå overveje at bruge et billede splitter (en enhed til at lette den samtidige køb af to fluorescens kanaler ved hjælp et kamera) eller en dobbelt kamera adapter.

Imaging blå kanal kræver udvælgelsen af ​​egnede filtre og spejle for at undgå cross-emission af det blå fluorescens til den grønne kanal. Vi har med held brugt et Olympus CellR mikroskop, der bruger Till Polychrome V illuminator, så specifik udvælgelse af bølgelængde, båndbredde og intensitet, og så er meget fleksibel. Imidlertid lyskilden er utæt "med nogle hvide lys, der kommer igennem i tillæg til den valgte wavelengths.For denne grund har vi monteret (multi) bandpass excitationsfiltre iterninger, så der er yderligere filtrering af excitationslyset. Følgende kombination af spejle / filtre blev brugt (alle Semrock). For GFP & mCherry: Exciter FF01-479-585, Emitter FF02-525/40 (GFP) og FF01-607/36 (mCherry) Dichroic Mirror FF505/606-Di01. For den fælles fiskeripolitik: Exciter FF01-416/501, Emitter FF01-523/610, Dichroic Mirror FF440/520-Di01. Vi har også brugt en anden CellR mikroskop, hvilket har givet sub-optimale resultater, med cross-emission af blå fluorescens til den grønne kanal. Dette mikroskop bruger en hvid lyskilde og har en hurtig filterhjul at vælge excitation wavelengths.This betyder, at bølgelængden markeringen er begrænset til de 8 filtre i hjulet, men der er en separat hjul at regulere intensiteten. Følgende kombination af spejle / filtre blev brugt. For GFP (Semrock): Exciter FF01-470/40, Emitter FF02-525/50, Dichroic Mirror FF495-DI02. For den fælles fiskeripolitik og mCherry: Exciter FF01-427/10 (CFP, Semrock) 572/23 (mCherry, Chroma) emitter FF01-472/30 (Fælles fiskeripolitik, Semrock) 632/60 (mCherry, Chroma) Dichroic Mirror 89006bs (Chroma).

Betydningen af ​​denne teknik i forhold til andre billeddannende teknikker er dobbelt: For det første kan det fange lokalisering af proteinet af interesse i levende celler, og det andet, kan det øge uddraget tilføje fjerde dimension af tid. Men som med exogene proteiner der er altid mulighed for mislocalization, enten på grund af øgede ekspressionsniveauer eller på grund tagging, bør derfor levende celler kombineres med immunofarvning af det endogene POI i fikserede celler, med henblik på at bekræfte resultaterne . Endelig er det værd at bemærke, at levende celler kan kombineres med immuno-EM, for at øge den rumlige opløsning af analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Vores arbejde er støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council. Vi vil gerne takke Prof Tamotsu Yoshimori for venligt forsyne os med plasmidet til ekspression af FFP-LC3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 41965
OptiMEM I Invitrogen 31985-062
MitoTracker Red FM Invitrogen M22425
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent Roche Applied Science 6365787001
22 mm coverslips VWR 631-0159
35 mm plates Fisher NUNC 153066
Silicon grease RS Components Ltd. RS 494-124
O-rings Custom made
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A-7816 Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope Olympus IX81 Inverted microscope
Objective Olympus UPLSAPO 100XO N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera Hamamatsu ORCA-R2 C10600 10B Progressive scan interline CCD
Illuminator TILL Photonics Polychrome V Ultrafast monochromator
Incubation chamber Solent Scientific Cell^R IX81
Software Olympus SIS xcellence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizushima, N. Autophagy: process and function. Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).
  2. Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. The role of Atg proteins in autophagosome formation. Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).
  3. Klionsky, D. J. Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).
  4. Klionsky, D. J. Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve. Autophagy. 4, 740-743 (2008).
  5. Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. 3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum. Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).
  6. Hayashi-Nishino, M., et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).
  7. Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).
  8. Mizushima, N., et al. Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells. The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).
  9. Itakura, E., Mizushima, N. Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy. 6, 764-776 (2010).
  10. Axe, E. L., et al. Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).
  11. Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue. Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats