La manipulación genética en Δku80 Las cepas de Análisis Genómico Funcional de Toxoplasma gondii

El objetivo general de este procedimiento es el reemplazo de genes eficiente y confiable utilizando cepas de tipo uno y tipo dos delta dos 80 de ndii toxoplásmico. Esto se logra construyendo primero una molécula de ADN objetivo que fusiona el marcador seleccionable HX GPRT en la orientación hacia adelante entre distintos flancos de ADN dirigidos a cinco genes principales y tres primos. El segundo paso del procedimiento es transfectar la molécula de ADN objetivo en una cepa de toxoplasma DYI de tipo uno o tipo dos.

El tercer paso es seleccionar pacientemente los eventos de recombinación homóloga de doble cruzamiento y aislar los clones individuales. El paso final es validar la presencia del evento de selección de genes en los clones mutantes aislados. En última instancia, los resultados de este procedimiento pueden mostrar la función de los genes del parásito mediante el análisis de knockouts de genes específicos, reemplazos de genes y genes de etiqueta a través de una variedad de aplicaciones posteriores.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes que utilizan cepas de tipo salvaje de este parásito es que los antecedentes de parásitos de tipo uno y tipo dos delta dos 80 permiten ahora una selección extremadamente fiable de eventos de recombinación homóloga de doble cruzamiento dirigidos para producir cepas precisas y definidas genéticamente. Esta técnica acelerará en gran medida el descubrimiento de nuevas dianas para la terapia farmacológica con plasmas antitoxinas y el desarrollo de cepas vacunales atenuadas seguras y eficaces, especialmente cuando se combinan con los recursos genómicos bien concebidos que se encuentran online@toxodb.org. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades con la ingeniería de moléculas de ADN dirigidas o manipulaciones genéticas con Toxoplasma Gandhi.

Sin embargo, la práctica de los pacientes y el diseño de moléculas diana fiables garantizarán el éxito. Comience el protocolo mediante PCR amplificando los cinco flancos de orientación genómica principales y tres principales para el gen de interés del ADN genómico. A continuación, la PCR amplifica el marcador seleccionable HX GPRT con sus cinco flancos principales y tres primarios DHFR del casete de genes HX GPRT CD NA.

Utilice la recombinación de levaduras o un método similar para fusionar las moléculas de NA 3D en su orientación correcta de cinco primos a tres primos con el plásmido PRS cuatro 16, generando así el plásmido p delta GOI que dirigirá la deleción al gen de interés. A continuación, prepare una muestra de 100 microlitros que contenga de 15 a 30 microgramos de plásmido de orientación linealizada para su transfección en T gia 68 a 72 horas después de inocular un matraz de 25 centímetros de células HFF confluentes. Verificar la presencia de parásitos recién mentidos confirmando visualmente que entre el 90 y el 95% de las células HFF han sido mentidas; Los parásitos viables son esenciales para la selección de genes.

Agite los parásitos viables hasta convertirlos en solución agitando vigorosamente el matraz cerrado sin salpicar líquido en el interior de la tapa o en el cuello del matraz. Recoja los parásitos del matraz y prepárelos para la transfección como se describe en el protocolo de texto. Electroporó el plásmido objetivo en la cepa de toxoplasma delta CO 80.

Transfiera la mezcla electroporada a un matraz de 150 centímetros que contenga celdas HFF confluentes y 30 mililitros de infección. Medio. Incubar el cultivo infectado durante la noche a 37 grados centígrados, unas 20 horas después de la transfección. Reemplace el medio con el medio de selección MPA plus X.

Ahora permita que los parásitos incuben a 37 grados centígrados durante unos ocho días. Imperturbado. Una vez que las placas son visibles, agite el matraz para desalojar los parásitos extracelulares de la monocapa generando una solución de parásitos. Transfiera aproximadamente medio mililitro de la solución del parásito a un nuevo matraz de 25 centímetros de células HFF confluentes que contenga cinco mililitros de MPA más medio de selección X.

Designe esta cultura como PA uno A aproximadamente tres días después. Repita la transferencia de medio mililitro de la solución antiparasitaria del matraz original a otro matraz de células HFF con el mismo medio de selección. Designe esta cultura como PA una B durante los próximos cinco días.

El monitor pasa uno A y un B para pfu. Seleccione pasar una A o una B para la subclonación en función de un número adecuado de más de 25 zonas de infección. Siempre que los parásitos licíen las células HFF, pase el cultivo a un nuevo matraz de 25 centímetros de células HFF confluentes con medio de selección tres semanas después de la transfección subclon de parásitos recién mezclados diluyendo los parásitos a la concentración adecuada en medio MPA más X, y distribuyendo uniformemente la solución de parásitos en una bandeja de 96 pocillos que contenga células HFF confluentes.

Prepare una bandeja a una concentración de un parásito por pocillo y prepare una segunda bandeja a una concentración de dos parásitos por pocillo. Incubar ambas bandejas a 37 grados centígrados después de la fecha de transfección original. No subclone los parásitos antes del día 20 para los parásitos de tipo uno o el día 25 para los parásitos de tipo dos.

Continúe pasando el matraz de 25 centímetros en un horario semanal como se describe en el texto en línea hasta que se haya validado la deformación de knockout. Después de aproximadamente una semana, marque las 96 bandejas de pocillos con un aumento de 40 a 60x. Seleccionar solo pocillos que contengan una sola UFP identificada como una sola zona de infección utilizando una pipeta configurada a 50 microlitros.

Mezcle el contenido de estos pozos dirigiendo el flujo de fluido sobre la PFU para dispersar los parásitos alrededor del pozo. Cuatro o cinco días después de mezclar los pocillos seleccionados, elija una docena de clones con células mentidas. Transfiera 12 clones de la bandeja de 96 pocillos a 12 pocillos de una bandeja de 24 pocillos. Para ello, rasque con la punta de una pipeta el fondo del pocillo y extraiga seis microlitros.

Transfiera la solución a un pocillo de una bandeja de 24 pocillos con celdas HFF confluentes en un mililitro de MPA más X selección. Medio: incubar la bandeja de 24 pocillos a 37 grados centígrados y controlar la lisis de las células HFF. Pase los parásitos de un pocillo lisado en la bandeja de 24 pocillos en un horario semanal.

Utilice la técnica de rascar y dibujar para transferir dos microlitros de la solución antiparasitaria a una nueva placa con selección de MPA y X. Después del paso, coseche los parásitos de los 24 originales. Bandeja de pocillos y transferencia a pequeños tubos para la recolección de ADN.

Para finalizar, utilice la PCR para probar la deleción del gen de interés para comprobar la integración de los cinco flancos principales y los tres principales del objetivo. Y para comprobar el marcador seleccionable HX GPRT. Este protocolo es para la eliminación del marcador HX GPRT de la cepa delta Q 80 manipulada y se describe en el texto en línea.

P delta GOYC tiene como objetivo la eliminación de HX GPRT del parásito mediante selección negativa utilizando seis medios TX. A continuación, se utiliza la PCR para confirmar la pérdida de HX GPRT, como se muestra en una banda de pares de 1,2 kilobases en la que HX GPRT no se eliminó del locus. Hay una banda de par de 3,4 kilobases.

La parte final de este protocolo, el marcaje C terminal de proteínas, también se describe en detalle en el texto en línea después de seguir el protocolo descrito para realizar una deleción de genes dirigidos, se utilizó PCR para validar la deleción de un knockout de tipo uno R 18. Un lado bajo que generalmente es difícil de apuntar. La PCR uno muestra la ausencia del producto de PCR del gen R 18.

La PCR dos muestra la presencia de los tres flancos principales de la diana genómica R 18 La PCR tres y la PCR cuatro muestran la presencia del marcador seleccionable correctamente integrado entre los cinco flancos principales y los tres flancos principales de la diana genómica, lo que define la deleción del R 18. Con el fin de reutilizar el marcador seleccionable para realizar deleciones posteriores en una cepa, primero se debe eliminar el HX GPRT original del locus. Después de seguir el protocolo descrito.

HX GPRT se eliminó de la GRA delecionada dos locus en la cepa delta dos 80 delta GRA dos HX. Se utilizó G-P-R-T-P-C-R para confirmar la pérdida de HX GPRT mostrada por una KILOBASE de 1,2 por banda. Cuando no se eliminó H-X-G-P-R-T, hubo una kilobase de 3,4 por banda después del paso inicial de selección de genes. Se pueden aplicar métodos adicionales de selección de genes para construir múltiples knockouts en la misma cepa de tipo uno o tipo dos, o para etiquetar o complementar una cepa mutante para responder a preguntas adicionales como, ¿dónde se localiza esta proteína en la célula?

¿O cuál es el dominio o actividad clave de esta proteína o vía que explica su función biológica? Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo aumenten la exploración de la función de los genes del parásito en el complejo AP modelo y el toxoplasma del parásito. Ojo de Gandhi.

No olvide que trabajar con toxoplasma puede ser peligroso y que se deben mantener precauciones como seguir todas las pautas de BSL durante todo el procedimiento.