Логометрический биосенсоры, которые измеряют митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и АТФ в живых клетках дрожжей

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы опишем использование двух логометрических, генетически кодируемых биосенсоров, которые основаны на GFP, следить митохондриальных окислительно-восстановительное состояние и уровни АТФ в субклеточные разрешение в живых клетках дрожжей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vevea, J. D., Alessi Wolken, D. M., Swayne, T. C., White, A. B., Pon, L. A. Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (77), e50633, doi:10.3791/50633 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Митохондрии играют роль во многих клеточных процессах, с метаболизмом энергии и гомеостаз кальция для контроля клеточной продолжительность жизни и запрограммированной клеточной смерти. Эти процессы влияют и зависят от окислительно-восстановительного статуса и АТФ в митохондриях. Здесь мы описываем использование двух логометрических, генетически кодируемых биосенсоры, которые могут обнаружить митохондриальных окислительно-восстановительное состояние и уровни АТФ в субклеточные разрешение в живых клетках дрожжей. Митохондриальных окислительно-восстановительное состояние измеряется с использованием окислительно-восстановительных чувствительной зеленый флуоресцентный белок (roGFP), который направлен на митохондриях. Mito-roGFP содержит цистеина в положениях 147 и 204 GFP, которые подвергаются обратимым и экологически зависимой окисления и восстановления, которые в свою очередь изменяют спектр возбуждения белка. MitGO-Ateam является энергией резонанса Ферстера переводом (лад) датчик, в котором ε субъединицы F O F 1-АТФ-синтазы зажат между FRET донором и акцептором флуоресцентныхrescent белков. Связывание АТФ с ε субъединицы приводит к изменениям в конформации белка, которые приносят лад донора и акцептора в непосредственной близости и позволяют резонансный перенос энергии флуоресценции с донора на акцептор.

Introduction

Митохондрии являются существенными для органелл производства АТФ, биосинтеза аминокислот, жирных кислот, гем, железо серные кластеры и пиримидинов. Митохондрии также играют ключевую роль в гомеостазе кальция, а в регуляции апоптоза. 1 больше доказательств ссылки митохондрии старения и возрастных заболеваний, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и болезнь Хантингтона. 2 В то время как люди живут всю свою жизнь с мутации в митохондриальных белков, которые связаны с нейродегенеративные заболевания, симптомы болезни возникают только в будущем. Это означает, что изменения происходят в митохондриях с возрастом, которые позволяют патологии болезни появляться. Действительно, митохондриальная фитнес коррелирует с общего состояния здоровья и продолжительности жизни клетки дрожжей и в клетках млекопитающих. 3,4 Здесь мы опишем, как использовать генетически кодируемых, логометрических флуоресцентные биосенсоры для оценки двух важных особенностях Митокhondria в живых дрожжевых клеток: окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ.

Функции митохондрий в аэробных мобилизации энергии хорошо известна. Митохондриальных окислительно-восстановительное состояние является продуктом сокращения и окислителей в органеллы, в том числе NAD + / NADH, FAD / ГВС 2, NADP + / NADPH, глутатион / глутатион дисульфида (GSH / GSSG) и активные формы кислорода (ROS). Разобщение митохондрии или гипоксия влияет на митохондриальную дыхательную активность и изменяет отношение NAD + до NADH в органеллы. АФК, которые получают из неэффективного переноса электронов между комплексами цепи переноса электронов во внутренней митохондриальной мембраны, а также от дезаминирование аминов через моноаминоксидазы в наружной мембраны митохондрий 5, повреждения липиды, белки и нуклеиновые кислоты и имеют были связаны со старением и связанных с возрастом нейродегенеративных заболеваний 6,7,8. ROS также играют важную роль в передаче сигнала в мitochondria, через окисление GSH. Например, NADH дегидрогеназы не только способствует продукции АФК, но и регулируется за счет взаимодействия с бассейном глутатиона 9,10. α-кетоглутаратдегидрогеназы и аконитазу, компоненты ЦТК, проявляют пониженную активность в окислительных средах 11,12.

Действительно, окислительно-восстановительный потенциал-зависимого регулирования аконитазу активность сохраняется от бактерий до млекопитающих 13,14. Таким образом, наблюдая окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ митохондрий крайне важно для понимания их функции и роль в патологии болезни.

Биохимические методы были использованы для оценки окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ целых клеток или изолированными митохондриями. Широко используются методы оценки окислительно-восстановительное состояние целых клеток или изолированных митохондрий, основанные на измерении уровней окислительно-восстановительной пары GSH / GSSG 15. Люциферин-люциферазы системы обычно используют для измерения митохондриальнойУровней АТФ в любом проницаемыми целых клеток или изолированных митохондрий. 16,17,18,19,20 В этом анализе люциферазы связывается с АТФ и катализирует окисление и хемилюминесценции с люциферин. 21 интенсивность излучаемого света пропорциональна количеству АТФ в реакционной смеси. 22

Эти методы показали основную информацию о функции митохондрий, включая обнаружение того, что пациенты с нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, имеют аномально низких уровней АТФ. 23 Тем не менее, они не могут быть использованы для изображения жизни, интактных клеток. Кроме того, методы, основанные на цельноклеточной анализа обеспечивают в среднем окислительно-восстановительное состояние или уровень АТФ во всех отсеках ячейки. Измерения в изолированных органелл являются потенциально проблематично из-за митохондриальных окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ может изменяться в процессе внутриклеточного фракционирования. Наконец, недавние исследования, проведенные в нашей лаборатории и другие показывают, чтомитохондрий в отдельные клетки являются гетерогенными в функции, которые в свою очередь влияет на продолжительность жизни матери и дочерним клеткам. 3 Таким образом, существует необходимость измерения митохондриальной АТФ и окислительно-восстановительное состояние в живых клетках с субклеточных разрешение.

Биосенсоры для митохондриальной функции, описанные здесь, как на основе GFP. Редокс-чувствительный GFP (roGFP) 24,25 GFP является вариант, в котором экспонированы на поверхности цистеина добавляют в молекуле. roGFP, как дикого типа GFP, имеет два пика возбуждения (при ~ 400 нм и ~ 480 нм) и один пик излучения при ~ 510 нм. Окисление остатков цистеина в roGFP приводит к увеличению возбуждение при ~ 400 нм. Сокращение этих цистеина способствует возбуждению при ~ 480 нм. Таким образом, отношение 510 нм, излучение при возбуждении roGFP при 480 нм и 400 нм показывает относительное количество восстановленной и окисленной roGFP, которая отражает окислительно-восстановительное состояние окружающей среды флуорофор о.

Два испионами roGFP широко используются: roGFP1 и roGFP2. Оба содержат те же вставки цистеина. roGFP1 на основе дикого типа GFP и roGFP2 основана на S65T GFP, который имеет более эффективное возбуждение при 480 нм и менее эффективное возбуждение при 400 нм по сравнению с wtGFP 24. roGFP1 меньше, чем рН-чувствительные roGFP2 и его динамический диапазон простирается далее в диапазоне значений приведенного. Таким образом, roGFP1 может быть более полезным для мониторинга более восстанавливающих отсеки, такие как митохондрии или цитозоле, и отсеков с переменным рН, такие как эндосомам. roGFP2 имеет более яркое сигнала и, в некоторых исследованиях, больший динамический диапазон, чем roGFP1 24,26. Исследования, проведенные в Arabidopsis THALIANA показывают, что время, требуемое для реакции на изменения в окислительно-восстановительное состояние одинакова для обоих датчиков (т ½ для окисления, 65 и 95 сек и т ½ для уменьшения, 272 и 206 сек, для roGFP1 и roGFP2, соответственно). 26

MitGO-ATeam2 является малоинвазивным, надежныедатчик, который измеряет митохондриальной АТФ в начинающие CEREVISIAE дрожжей Saccharomyces. GO-Ateam является энергии Ферстера резонансной передачи (FRET) зонд, который состоит из ε-субъединицы F о F 1-АТФ-синтазы FRET зажатой между донором и акцептором флуоресцентного белка (GFP и оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) соответственно) 27. Связывание АТФ с ε субъединицы приводит конформационные изменения в белке, которые приносят лад донора в непосредственной близости от акцептора и позволяют передачу энергии от донора к акцептора. Есть два варианта GO-Ateam, GO-GO и ATeam1-ATeam2. GO-ATeam2 имеет более высокое сродство к MgATP чем GO-ATeam1, что делает ее более пригодной для измерения обычно ниже, [АТФ] в митохондриях по сравнению с цитозоль 27.

Для зондирования митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, мы построили слитого белка (Mito-roGFP1), состоящий из roGFP1 слитый с последовательностью лидера ATP9й экспрессируется из центромеры основе (низкое число копий), дрожжевой экспрессирующий плазмиду под контролем сильного глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GPD) промотор (p416GPD, Addgene). Мы использовали roGFP1 для исследования окислительно-восстановительного состояния митохондрий в контексте старения CEREVISIAE модель грибок cerevisiae. Мы считаем, что roGFP1 может обнаружить изменения в митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, которые происходят в процессе старения и в ответ на наличие питательных веществ, но не имеет никакой очевидной пагубное влияние на дрожжевые клетки. Мы также видим, изменчивость в окислительно-восстановительного состояния митохондрий в индивидуальные клетки дрожжей жизни, открытие, которое подчеркивает важность биосенсоров субклеточную с пространственным разрешением.

MitGO-ATeam2 является вариант GO-ATeam2, который имеет сигнальную последовательность митохондриальной цитохром с оксидазы субъединицы VIIIA вставляется в аминоконцу GO-ATeam2. 27 Мы изменили mitGO ATeam2-зонд (любезно предоставленные лабораторией H. Noji, Институт OF научных и промышленных исследований, Университет Осака, Япония) для использования в дрожжах субклонированием к ней через Xba1 и HindIII сайтах, в вектор экспрессии дрожжей pAG415GPD-БДКК (Addgene, Кембридж, Массачусетс, США), которая является низкой плазмидой содержащие сильного конститутивного промотора GPD. Мы выразили mitGO-ATeam2 у почкующихся дрожжей, и найти, по контрастного с ДНК-связывающим красителем DAPI, что он локализуется исключительно в митохондрии, где он служит эффективным зондом для измерения физиологических изменений в митохондриальной уровня АТФ.

roGFP и GO-Ateam оба генетически закодированы. В результате, они могут быть введены и стабильно сохраняться в интактных клетках, и предоставлять информацию о окислительно-восстановительное состояние или уровней АТФ в отдельных, живые клетки. Более того, и биосенсоров отслеживать изменения в окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ, которые происходят в физиологических условиях. +28 Оба зонда также радиометрические. В результате измерений, выполненных с этих зондов не влияет на чаНГРЭС биосенсоров в концентрации или освещения образца или толщины. Наконец, и биосенсоры обеспечить субклеточных пространственным разрешением. Действительно, roGFP была ориентирована в митохондрии, ER, эндосомы и пероксисом 24, и может обнаружить изменения в окислительно-восстановительное состояние каждого из этих органелл, в значительной степени зависит от рН.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Трансформации дрожжевых клеток с Биосенсоры

  1. Преобразование нужный штамм дрожжей с плазмиду, несущую митохондрий roGFP или mitGO-ATeam2 методом ацетат лития 27.
  2. Чтобы подтвердить преобразование с плазмидой биосенсор и предотвратить потерю плазмиды, выбрать и сохранить трансформантов на соответствующих селективных синтетических полной среде (SC-Ura для митохондрий roGFP или SC-Leu для mitGo-ATeam2). Если флуоресцентного зонда была субклонировали в другую плазмиду, чем описанные здесь, используют соответствующие селективной среде. Визуализируйте трансформантах с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы подтвердить, что они выражают люминесцентные биосенсоров и обладают нормальной морфологии митохондрий.

2. Рост клеток и подготовка для работы с изображениями

Функции клеток и ответ на медикаментозное лечение во многом зависит от плотности клеток и метаболической активности. Лучшие результаты получены, когда клеткиактивно делятся (в середине логарифмической фазы, ~ 0,5 - 1 × 10 7 клеток / мл). Наиболее надежный способ генерации середине логарифмической фазы роста культуры последовательной плотности для инокуляции от стационарной фазы предварительной культуры.

  1. Подготовьте стационарной фазы предварительной культуры: выбрать одну колонию трансформированных клеток от пластины и прививку селективном жидком носителе (5 мл в 50-мл конической нижней трубки). Расти при 30 ° C при встряхивании со скоростью 225 оборотов в минуту, пока оптическая плотность культуры при 600 нм (OD 600) не достигало плато (24-48 ч).
  2. Подготовьте середине логарифмической фазы роста культуры для наблюдения: использовать соответствующий объем предварительной культуры для инокуляции 5 мл селективной среды в 50 мл коническую-дно трубки. YPD носитель аутофлуоресцентной и не должны использоваться для этих исследований. Использование синтетических полной, глюкоза основаны, падением напряжения (SC-УПА) средства массовой информации. Рост клеток при 30 ° С, встряхивая при 225 оборотах в минуту, в течение 4-16 ч, пока они не достигают середины логарифмической фазы роста (~ 0,5 - 1 × 10 7 клеток / мл). Плотность клеток может быть определенапутем измерения OD 600; откалибровать спектрофотометр для определения правильного OD 600 считывания. На нашем Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), в середине логарифмической фазы соответствует OD 600 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 чувств колебания в органеллы в ответ на метаболические изменения. Например, в данном анализе митохондриальных окислительно-восстановительные изменения состояния, когда дрожжи растут на брожению источники углерода (например, глюкоза, как и в средах SC) по сравнению с несбраживаемые источники углерода (например, глицерин, как и в SGlyc среды), и даже в разные партии одного и того же средств массовой информации. Таким образом, использование той же партии СМИ для всех экспериментов.

  1. Клетки готовы к концентрации (см. шаг 2.4) и изображения, если лечение не может быть исполнено. Если клетки лечат, инкубировать клетки с соответствующей обработки и перехода к следующему шагу.
  2. Концентрат 1 мл культуры путем центрифугировани при 6000 х г в течение 15 сек иресуспендирования осадка клеток в 20 мкл среды. Эти условия максимизировать число различаемых сот в поле зрения.
  3. Нанести 2 мкл ресуспендировали клетки слайдов. Покрытие с покровным (№ 1,5, предпочтительно высокопроизводительной 170 ± 5 мкм толщиной) и герметизации краев покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей или valap (см. реагенты). Чтобы скрепить с valap, расплав небольшое количество на металлического шпателя, держа его над пламенем горелки Бунзена, то распространение небольшое количество по краям покровного стекла.
  4. Поддержание клетки при 30 ° С в течение изображений. Цель нагревателя на 100x иммерсионной линзы масло, используемое для работы с изображениями хорошо работает для этого приложения. В этих условиях, морфологии митохондрий, окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ остаются неизменными во время съемки в течение 10-15 мин.

3. Настройка изображения

  1. Настройка для работы с изображениями Mito-roGFP1 на широком поле флуоресцентного микроскопа
    Шаги здесь приспособлены к AxioObserver.Z1 микроскоп с возбуждением Colibri светодиодных источников, широким полем Orca ER камеру и AxioVision приобретение программного обеспечения. Фотообесцвечивание обоих каналов и фотопреобразование окисленных Mito-roGFP1 значительно сокращается с использованием светодиодной подсветки по сравнению с ртутной лампой освещения (см. ниже).
    Для максимального сигнала и разрешение, использовать самую высокую числовую апертуру возможно в объективном, а самое низкое увеличение которое обеспечивает достаточное пространственное разрешение. Кроме того, для Mito-roGFP изображений, убедитесь, что цель передает также при 365 нм. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar цели (Zeiss) работает хорошо для этого приложения.
    Формирование захвата программное обеспечение для захвата окисленных и восстановленных Mito-roGFP1 видов. Мы используем следующие условия.
    1. Настройка канала для окисленных Mito-roGFP использовать возбуждение при 365 нм (100% силы СИД) и выбросов фильтр, пригодный для GFP, таких, как 38 HE Набор фильтров (Zeiss), с включенным возбуждениян фильтр удаляется из куба. Снятие возбуждения фильтр позволяет возбуждения на обоих 365 нм и 470 нм, без необходимости переключения фильтра, тем самым увеличивая достижимое разрешение времени.
    2. Настройка канала для снижения митохондрий roGFP использовать возбуждение при 470 нм (100% индикатор мощности) и, как упоминалось выше, тот же фильтр твердых куб использоваться для окисленного митохондрий roGFP. Установите камеру 1x1 биннинге для оптимизации пространственного разрешения.
    3. Установить программное обеспечение для измерения AZ стек, состоящий из 11 кусочков 0,5 мкм с расстоянием, собирая обоих каналов в каждом положении Z. Этот способ приобретения медленнее, чем приобретение каждого стека г, в свою очередь, но он предотвращает артефакты, связанные с митохондриальной движение между приобретением окисленных и восстановленных каналов.
    4. Изображение нескольких ячеек для определения соответствующего времени экспозиции, производя сильное, но не насыщение сигнала. Важно поддерживать соотношение времени экспозиции для окисленной и восстановленной митохондрий roGFP1 для всех экспериментовс. Например, если время экспозиции для окисленной и восстановленной митохондрий roGFP1 в 300 и 100 мс соответственно, то время экспозиции для окисленных митохондрий roGFP1 должна быть в 3 раза, что для уменьшен митохондрий roGFP для всех экспериментах.
  2. Настройка для работы с изображениями mitGO-ATeam2 от спектрального конфокальной микроскопии
    Для количественной оценки уровня АТФ использованием mitGO-ATeam2, флуоресценция GFP (максимум излучения 510 нм) следует отличать от, что из р (максимум излучения 560 нм). Есть флуоресценции наборы фильтров, которые разрешают флуоресценции от этих флуорофорам. Однако мы считаем, что спектральный детектор, доступный на многих лазерной сканирующей конфокальной микроскопы, лучше всего подходит для этого приложения. Спектрального детектора отделяет флуоресцентного излучения на множество компонентов (как правило, 32 или более) в зависимости от длины волны. Несколько соседних полосах длин волн могут быть объединены в один канал изображения. Длины волн должны быть объединены выбираются эмпирически так, чтобы максимизировать сигнала от GFP и ОФП, избегая при этом кроссовер сигнал, что бы посрамить FRET измерения. Используйте высокие числовые апертуры линзы доступны. Мы используем 100x/1.49 или 60x/1.49 Apo-TIRF линзы. Мы используем Nikon A1R конфокальной микроскопии NIS работает Элементы программного обеспечения. Формирование захвата программное обеспечение для захвата АТФ-связанного и несвязанного ATP-mitGO-ATeam2 видов. Мы используем следующие условия.
    1. Установить обскуры до 1,0 единиц Эйри (АС), который в нашей системе соответствует AZ разрешение около 0,42 мкм.
    2. Установить сканирования зум образом приблизиться к пределу Найквиста, которая будет максимально пространственной информации в изображении. В нашей системе размер пикселя 0,12 мкм.
    3. Поскольку митохондрии могут двигаться во время съемки, это может быть полезно для увеличения скорости визуализации, обрезка полей до 512 х 256 пикселей. Общее время, необходимое для изображения одного кадра в системе составляет 1,0 сек, в том числе два раза сканирования среднего. В зависимости от желаемого пространственное разрешение, поле может быть обрезано по дальнейшему увеличениемэлектронной временным разрешением.
    4. Excite при 488 нм, и собирать излучение от 500 - 520 нм для GFP, и от 550 - 580 нм для ОФП. Фактическое оптимальные значения могут изменяться в зависимости от характеристик системы формирования изображения.
    5. Оптимальной мощности лазера для нашей системы от 6,0 до 6,4%. Оптимальная мощность лазера будет разным для каждого микроскопа системы, но в идеале быть как можно ниже, в то время как до сих пор производит интерпретируемые изображения. Используйте внутренний или внешний измеритель мощности для мониторинга изменений в мощности лазера, которые происходят обычно в течение долгого времени в любой оптической системы.
    6. Регулировка усиления детектора и интенсивности освещающего света максимально обнаружен диапазон значений пикселей, но избежать насыщения сигнала, на столько ячеек, сколько возможно. Не анализируйте любые клетки, содержащие более 1% насыщенных пикселей. Изображение всех образцов с использованием той же цели, мощность лазера, сканирование зумом, размер пикселя, усиления и смещения.

4. Image Acquisition

  1. Найдите Фокусное пла дной из интересующих клеток с использованием проходящего света для минимизации отбеливания флуоресцентного зонда.
  2. После обнаружения одного или более интересующих клеток, собирают г серии по всей глубине средней клетки (около 7 мкм), используя размер шага 0,5 мкм.
  3. Изображение другие интересующие клетки на слайде, но не изображение одного слайда дольше 15 мин. Через 15 минут на слайде, клетки теряют жизнеспособность.

5. Анализ

Митохондриальной АТФ определяется путем измерения отношения mitGO-ATeam2 излучение при 560 нм к поглощению при 510 нм +27 окислительно-восстановительное состояние органеллы определяется как сводится к окислению (R / O) Отношение митохондрий roGFP;. Т.е. излучения на длине волны 510 нм при возбуждении на 470 нм деленное на излучение на длине волны 510 нм при возбуждении при 365 нм. Перед расчетом отношения, вычесть фона и определения порогового значения для пикселов, принадлежащих флуоресцентный митохондрий.

палатка "> открытом доступе (например ImageJ 30) или коммерчески доступными (например Volocity, Perkin-Elmer) программное обеспечение может быть использовано для анализа Mito-roGFP1 или mitGO-ATeam2. В зависимости от используемого программного обеспечения для получения изображений и анализа изображений может сначала должны быть преобразованы в другие форматы, такие как TIFF, до их открытия в анализе программного обеспечения. Если изображения преобразуются, важно, чтобы убедиться, что значения пикселей не изменяются во время преобразования. Анализ Mito-roGFP1 данных, используя обе программы описан ниже. Программы меню и опций, чтобы выбрать в каждом меню выделены жирным курсивом.

5.1 Анализ ImageJ

  1. Открытие изображений и изменения типа до 32 бит: Тип изображения → → 32 бит.
  2. Нарисуйте области интереса (ROI) в районе, где нет клеток. Рассчитать среднюю интенсивность в этой ROI: Анализ → Измерить.
  3. Вычтите расчетным средним фоном из стека: Процесс → Математика → вычитать.
  4. Использование вычитается обеспечение Z-Stack, найти середину кусочек и на порог митохондрий: Изображение → Настройка → Порог и нажмите кнопку Применить на пороге окна. Применить ко всем ломтиков в стеке. Проверьте установить фоновую пикселей NaN.
  5. Создать соотношение Z стека: Процесс → Image Calculator Разделите пониженной стек окисленные Z стек для Mito-roGFP1 анализа. Разделите 560 нм (АТФ связанной) изображение, 510 нм (АТФ несвязанного) изображение для mitGO ATeam2-анализа.
  6. Нарисуйте ROI вокруг области интереса. Выберите Анализ → Инструменты → ROI менеджер, и нажмите кнопку Добавить, чтобы записать ROI. Несколько регионов могут быть сохранены в менеджере. В диспетчере ROI, выберите все трансформирования, затем выберите Mруды → Multi-измерения для измерения всех стек ломтиками. Экспорт данных в электронную таблицу для анализа.

5.2 Анализ Volocity

  1. Импортировать изображения в Volocity библиотеки и создать последовательность изображений с 2 ​​каналами.
  2. Нарисуйте области интереса (ROI) в районе, где нет клеток. Выберите: Инструменты → Ratio.
  3. Используйте Volocity для расчета фона: Получить Рой.
  4. Регулировка порога включить митохондриальных структур.
  5. Проверьте возможность применить LUT радуги отношению канала. Интенсивность модулированных каналов может привести к менее шумные изображения для презентации ции, но оно не должно использоваться для количественного определения среднего отношения.
  6. Выберите вкладку измерений, выбрать формат канала и привлечь ROI вокруг области интереса. Измерение отношения канала, за исключением нулевых значений. Множественные участки могут быть выбраны и измереныв то же время. Экспорт данных в электронную таблицу для анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Измерение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния митохондрий-roGFP

Здесь мы показываем, что Мито-roGFP1 имеет динамический диапазон для обнаружения изменений в митохондриальных окислительно-восстановительное состояние от полностью окисляется до уменьшена в живых дрожжевых клеток, не влияя на рост дрожжей клетки или морфологии митохондрий. Сначала мы находим митохондрии клеток, экспрессирующих GFP-целевых и roGFP1 расти по обычным ставкам (рис. 1А). Максимальная скорость роста, измеряемые максимальный наклон кривой роста во время входа в фазе роста и время достижения максимальной скорости роста, похожа в клетках, экспрессирующих Mito-GFP и Mito-roGFP1. Кроме того, в митохондриях дрожжей, экспрессирующих Mito-roGFP1 выставку дикого типа морфологии (рис. 1В). В частности, они являются трубчатыми, выровняйте по матери-буд оси, а накапливаются на кончиках мать и дочь клеток. Поскольку митохондриальная дисфункция часто вызывает фрагментацию, это нормальная морфология поддерживает идею, что Мито-roGFP1 делаетНе возмущают функции митохондрий.

Для оценки динамического диапазона митохондрий roGFP1, мы рассмотрели середине логарифмической фазы клетки дикого типа дрожжей с перекисью водорода (H 2 O 2) и дитиотреитола (DTT), соответственно, и измеренное среднее митохондриальной R / O соотношение для оценки митохондриальной окислительно-восстановительного состояния (рис. 2). Титрование H 2 O 2 или DTT от 0 до 10 мМ приводит к дозозависимое изменение средней сотовой R / O соотношении с измеренным в диапазоне от 0,6 (в окислительных условиях) до 1,23 (в восстановительных условиях). Таким образом, мито-roGFP1 является эффективным биосенсора для анализа митохондриальных окислительно-восстановительное состояние в живых клетках.

Mito-roGFP1 также предлагает субклеточную разрешение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния. Это разрешение субклеточную показывает, что митохондрии в индивидуальные клетки дрожжей отличаются относительной окислительно-восстановительного состояния. Если митохондрий в одной клетке дрожжей функционально различны, то возможно, чтоу пассивно или активно сегрегированный (рис. 3). Подобное разделение может способствовать мать-дочь возрастом асимметрия и омоложение дочерних клеток. Этот факт подчеркивает необходимость биосенсоров с субклеточных разрешение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния.

Давно известно 31, что свет может вызвать изменения в хромофора GFP. Под воздействием высокой интенсивности света 400 нм, roGFP1 подвергается фотопреобразование к видам с различным спектром излучения 26. Когда фотопреобразования происходит, происходит уменьшение в зеленое излучение из окисленных митохондрий roGFP1 и увеличение зеленое излучение при возбуждении пониженной митохондрий roGFP1, который изменяет отношение R / O митохондрий roGFP1 (фиг.4В). Использование низкой интенсивности возбуждения (например, освещение на 40% при использовании 400 нм светодиод в источник света колибри), нет никаких существенных фотопреобразования анализируемый период (фиг.4С). P называют способ уменьшить фотопреобразование является возбуждение окисленной формы roGFP при 365 нм (см. обсуждение).

Измерение с митохондриальной АТФ-mitGO ATeam2

MitGO-ATeam2 локализуется в митохондриях при экспрессии в клетках млекопитающих. 27 Мы считаем, что mitGO ATeam2-локализуется с DAPI-окрашенных митохондриальной ДНК у дрожжей, и находится в трубчатых структур, характерных дрожжей дикого типа митохондрий (рис. 5а). Таким образом, мы убедились, что митохондрии от млекопитающих цитохром с оксидазы субъединицы VIIIA локализует зонд митохондрий у дрожжей без нарушения морфологии митохондрий. Кроме того, мы находим, что скорость роста клеток, экспрессирующих mitGO-ATeam2 аналогична клеток, экспрессирующих митохондрий целевых GFP в глюкозу и глицерин СМИ (рис. 5В). Таким образом, выражение mitGO-ATeam2 не появляется вредного воздействия на клетки или митохондрий.

_content "> Далее, мы проверяли, действительно ли mitGO-ATeam2 FRET реагирует на изменение уровня митохондриальной АТФ. Чтобы сделать это, мы с обработанными клетками антимицином, агент, который связывается с цитохром С редуктазы, тормозит окисление убихинол в электрон-транспортной цепи , нарушает протонный градиент и ингибирует митохондриальный производства АТФ. 20 FRET средний коэффициент уменьшается в клетках, обработанных антимицин (фиг. 6C).

С учетом имеющихся данных, что mitGO-ATeam2 является эффективным биосенсоров для митохондриальных АТФ, мы использовали этот зонд для мониторинга уровней митохондриальных АТФ в дрожжи, которые были распространены использованием брожению или неферментируемым источник углерода (рис. 6А и 6В). Сокращение общего люминесцентные области в глюкозо-Выросшие клетки подтвердил, что репрессии глюкозой приводит к снижению митохондриального изобилия. Отметим, от клетки к клетке изменения в уровне mitGO-ATeam2. Интересно, что наши предварительные данные показывают, что есть ма у быть различия в уровни АТФ в различных митохондрий в пределах одной клетки (рис. 6D).

Рисунок 1
Рисунок 1. Mito-roGFP1 обнаруживает митохондриальных окислительно-восстановительное состояние, не затрагивая клетки роста или митохондриальной морфологии. (A) рост дрожжей, экспрессирующих митохондрий целевых GFP или ро-GFP1 измеряли как изменение оптической плотности при 600 нм в зависимости от времени роста SC-УПА жидкой среде при температуре 30 ° C. (В) Верхняя панель: Нормальный морфологии митохондрий и локализация канала в необработанных изображений. Нижняя панель: соотношение изображения показывают пониженная передача, деленная на окисленные канал (цвет ссылки справа). На снимках изображены эффект порога выбор на результаты. Оптимальный порог включает митохондриальной структуры и исключает фоне.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 2

Рисунок 2. Mito-roGFP1 обнаруживает изменения в митохондриальных окислительно-восстановительного состояния в ответ на лечение перекисью водорода или дитиотреитол. (AB) в середине логарифмической фазы клетки дрожжей, экспрессирующих Mito-roGFP1 инкубировали в SC-УПА средах с отсутствием лечения (0) или с указанными концентрациями Н 2 О 2 или DTT в течение 20 мин при 30 ° С (А) Максимальный проекции интенсивности R / O митохондрий roGFP1 соотношение изображения накладываются на проходящем свете изображений, которые показывают клетки контуров. Цвет ссылки для Mito-roGFP1 показан в правом верхнем углу. Бар:. 5 мкМ (B) Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 3
Рисунок 3. Mito-roGFP1 предлагает субклеточную разрешение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния. Максимальной проекции интенсивности R / O Mito-roGFP1 соотношение канал накладывается на проходящего света изображения. Цвет ссылки для Mito-roGFP1 показан в правом верхнем углу. Бар: 5 мкм. Это конкретная ячейка имеет средний R / O Mito-roGFP1 отношением 0,88. Однако отдельные митохондрии внутри этой ячейки показывают различные окислительно-восстановительные государств. Цифры указаны расчетные R / O Mito-roGFP1 соотношение для различных митохондриальных Reрегионов. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 4
Рисунок 4. Высокой интенсивности возбуждения приводит к фотопреобразования и измененных R / O митохондрий roGFP1 соотношениях. В середине логарифмической фазы дрожжей, экспрессирующих митохондрий roGFP1 облучали светом 400 нм при 40% (A) или 100% (В) энергии от источника света СИД и флуоресценцию от восстановленного и окисленного Mito-roGFP1 был захвачен каждые 4 сек. На иллюстрациях показаны максимальные прогнозы, в которых цвета представляют R / O отношение Mito-roGFP1 (см. цветовую гамму в правый нижний угол). Бар:. 5 мкм (с) R / O отношение Mito-roGFP1 оставался постоянным в течение периода изображений при освещении при 40% мощности светодиодные. Тем не менее, при освещении на 100% светодиодный власти, мынаблюдать зависимое от времени изменение R / O отношение митохондрий roGFP1, который отражает photoswitching из флуорофора. Черные квадраты, 40% силы СИД;. Серые алмазы, 100% силы СИД Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 5
Рисунок 5. MitGO-ATeam2 локализуется в митохондриях в дрожжах и не влияет на дрожжах цены рост клеток. (А) Клетки дрожжей выразив mitGO-ATeam2 выращивали до середины логарифмической фазе, закрепляются параформальдегиде и окрашивали ДНК-связывающих красителей DAPI, как описано ранее . 19 На иллюстрациях показаны максимальные интенсивности проекции деконволюции Z-серии. Для простоты, mitGO-ATeam2 изображения были получены с помощью обычного фильтра GFP, так что они представляют собой только население несвязанный к АТФ. Cell Outлиниями показаны белым цветом. N: ядерная ДНК. мтДНК: митохондриальной ДНК. Бар: 1 мкм (B) Кривые роста дикого типа, клетки дрожжей, экспрессирующих митохондрий целевых GFP или mitGO-ATeam2 на основе глюкозы (SC), и на основе глицерина (SGlyc) жидкой среде при 30 ° С.. Эти данные представляют собой среднее quadruplicates для каждого штамма в каждый момент времени, и является представителем двух независимых экспериментов. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 6
Рисунок 6. MitGO-ATeam2 измеряет изменения уровней АТФ в митохондриях дрожжей на субклеточном и suborganellar разрешение. (AB) Выброс mitGO-ATeam2 с GFP (510 нм) и ОФП (560 нм) и количественного 560/510 нм эмиссия соотношение дрожжей Клетки выращивали в течение ночи в глюкотаковой на основе (SC) (A) или на основе глицерина (SGlyc) (B) информации. Цвет ссылки для 560/510 соотношение канал указан в правом нижнем углу. Бар:. 1 мкм (C) Количественный анализ 560/510 соотношение клетки размножают в SGlyc среды с или без антимицин (2 мкг / мл) в течение 1 часа при 30 ° С. Снижение уровня АТФ на антимицином лечения является статистически значимым (Крускала-Уоллиса критерий значимости). (D) 560 нм nm/510 отношение mitGO-ATeam2 в середине логарифмической фазы клеткой дикого типа распространяются на СК-средах. Цвет ссылки для 560/510 соотношение канал указан в правом нижнем углу. Ячейка контур показаны белым. Среднее 560/510 нм коэффициент для всей клетке 0,43. Цифры, приведенные в 560/510 нм соотношения конкретных регионов в митохондриях. Бар: 1 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем методы использовать Mito-roGFP1 и mitGO-ATeam2 в качестве биосенсоров для оценки митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ в живых клетках дрожжей. Мы считаем, что выражение плазмидой Mito-roGFP1 или mitGO-Ateam результатов в количественном ориентации на митохондрии, без очевидного эффекта на морфологии митохондрий или распространения на сотовые темпы роста. 3-Mito roGFP1 может обнаружить изменения в митохондриальных окислительно-восстановительного состояния от высоко окисляется до очень льготным государств. Аналогично, mitGO-Ateam могут измерить изменения в митохондриальных уровни АТФ, которые происходят в дрожжах проходит дыхание экономического роста, и дрожжи обрабатывают ингибитором дыхания. Кроме того, так как биосенсоры предлагаем субклеточную разрешение, они могут обнаружить неоднородности в окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ митохондрий внутри отдельных клеток. Наконец, так как биосенсоры логометрических датчиков, они не зависит от изменений в концентрации или изменчивость толщины образца или плохоumination. Эти датчики обеспечивают минимально инвазивный подход к изучению функций митохондрий с субклеточных резолюцию в живых клетках.

Для успешного применения этого способа изображения должны быть получены с максимально возможной сигнал-шум. Первым важным шагом является изучение клетки от 10-20 трансформантом колоний под микроскопом и выбрать те, с надежной флуоресценции и нормальной морфологии митохондрий и темпам роста. Далее, изображение условий должны быть оптимизированы для получения высокого, но не насыщение, интенсивности, не вызывая фотоповреждения для флуоресцентного белка или клетки. Несколько клеток в популяции (<1%) могут иметь необычно высоким или низким общим флуоресценции вследствие изменения числа копий плазмиды, эти можно пренебречь в пользу захвата изображения интерпретируемого большинства клеток.

Хотя преимущества Mito-roGFP ясны, важно также, чтобы быть в курсе потенциальных ловушек. Мы обнаруживаемРазличия в митохондриальных окислительно-восстановительный потенциал не только с источником углерода индуцированного различий в метаболизме клеток, а также при распространении дрожжей в различных партий той же среде. Таким образом, необходимо соблюдать осторожность при выборе СМИ для роста клеток митохондриальных окислительно-восстановительных измерений. Кроме того, хотя митохондрий roGFP предлагает беспрецедентный пространственное разрешение митохондриальных окислительно-восстановительное состояние, временное разрешение roGFP не является достаточным для обнаружения всплесков ROS, которые связаны с ROS сигнала 31. Наконец, следует соблюдать осторожность при выборе длины волны возбуждения и интенсивности для окисленной формы roGFP. Освещение при 400 нм оптимально возбуждает окисленный видов roGFP. Однако, это также возбуждает уменьшена roGFP в большей степени по сравнению с возбуждением при 365 нм. Это приводит к снижению чувствительности при измерении митохондриальных окислительно-восстановительного состояния. Кроме того, воздействие Mito-roGFP1 высокой интенсивности освещения при 400 нм приводит к фотопреобразование белка в спецификациих годов с измененными спектральными свойствами. Мы не видели фотопреобразование на высокой интенсивности освещения при 365 нм. Поэтому мы рекомендуем использование возбуждения 365 нм, если возможно.

MitGO-ATeam2 также имеет свои ограничения. Например, с mitGO-ATeam2 сама белка она может быть повреждена в том числе сотовой оскорбления активные формы кислорода, которые могут влиять на его деятельность биосенсоров. Кроме того, GFP и ОФП излучения длин волн (510 и 560 нм), должны быть разрешены для FRET анализ, который может быть трудно на обычных флуоресцентных микроскопов.

В отличие от анализов пробирке фермента, эти живых клеток анализов сообщают относительные изменения в митохондриальных АТФ или окислительно-восстановительного состояния, и измеряют не абсолютные концентрации АТФ или уменьшена цистеина. Хотя стандартной кривой теоретически может быть сгенерирована путем измерения отклика датчика белков в растворе, это не может применяться к различным молекулярным среды в митохондриях. Там Efore, эти анализы обеспечивают средство сравнения клетки в различных условиях. Кроме того, визуализация условия меняются, поэтому точных значений соотношения приобрел на одном визуализации установки не могут быть воспроизведены на другой.

Эти методы визуализации соотношения могут быть адаптированы для других радиометрические показатели, в том числе других roGFP или GO-Ateam изоформ и других функциональных проб. Выбор широким полем или конфокальной микроскопии будет зависеть от зонда и пространственное разрешение. Широким полем метод был использован здесь для митохондрий roGFP, поскольку он позволяет возбуждение при 365 нм, что повышает чувствительность и устойчивость к датчику. Конфокальной метод со спектральным детектор, используемый здесь mitGO-Ateam, обеспечивает удобный способ устранить выбросы кроссовера путем регулировки спектрального окна обнаружения. Тем не менее, можно выполнить аналогичные эксперименты в широком поле микроскопа с помощью пользовательских фильтров или устранение кроссовера вычислительном.

ntent "> Наиболее распространенные трудности в этом типе визуализации эксперимента недостаточна сигнала. изображений аппаратных средств (особенно объектива и детектором) имеет решающее значение для сбора достаточный сигнал для интерпретации данных.

Пороговой шаги имеют большое влияние на результаты, как включение пикселей фона может ослабить любые тенденции в соотношениях получены. Автоматические методы являются более предпочтительными, но из-за ограниченного сигнала, ручная порога часто наилучшим доступным методом. Если ручной пороги используются, критерии, используемые должны быть сформулированы так же как это возможно, и анализ может должны быть выполнены слепым или разными экспериментаторами, чтобы продемонстрировать воспроизводимость. Контрольные эксперименты с антимицин (для mitGO-Ateam2) и H 2 O 2 или DTT (для митохондрий roGFP) могут быть использованы для подтверждения прогнозируемых изменений флуоресценции соотношениях.

Mito-roGFP и mitGO-ATeam2 неинвазивные, логометрических датчиков для мониторинга MitoФитнес митохондрий в живых клетках дрожжей. Радиометрические датчики, используемые здесь, были направлены на митохондрии путем слияния митохондрий-специфических последовательностей сигнала. Другие клеточные компартменты могут быть изучены с добавлением соответствующих направляющих последовательностей на исходный датчиков. Кроме того, можно сочетать любой из этих датчиков с дополнительными флуоресцентных маркеров (например, для органелл или сигнальных факторов) или датчиков (например, кальций) для одновременного измерения нескольких процессов в живых клетках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана награды от HHMI 56006760 в JDV, Национального института здоровья (NIH) (2 TL1 RR 24158-6), чтобы DMAW, а с Эллисон Медицинский фонд (AG-SS-2465) и NIH (GM45735, GM45735S1 и GM096445) в LP. GM45735S1 была выдана из NIH в оздоровлении американской экономики и реинвестировании 2009 года. Микроскопы используются для этих исследований были частично поддержана через NIH / NCI грант (5 P30 CA13696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagents
Antimycin A Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 1397-94-0 Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave.

Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glycerol
0.05% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
Valap Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients:
Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
  Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) 3050 Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm Zeiss (Thornwood, NY) 474030-9000-000 These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) 12-545E Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective Nikon (Melville, NY)  
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)  
Volocity 3D Image Analysis software Perkin Elmer (Waltham, MA) Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software National Institutes of Health (Bethesda, MD) http://rsb.info.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, (9), 566-578 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, (6), 1145-1159 (2012).
  3. McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10, (5), 885-895 (2011).
  4. Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
  5. Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29, (3-4), 222 (2000).
  6. Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131, (7-8), 536-543 (2010).
  7. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443, (7113), 787-795 (2006).
  8. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70, (6), 1033-1053 (2011).
  9. Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278, (22), 19603-19610 (2003).
  10. Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279, (46), 47939-47951 (2004).
  11. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20, (24), 8972-899 (2000).
  12. Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276, (26), 23357-23361 (2001).
  13. Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301, (1), 98-102 (1993).
  14. Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270, (22), 13399-13405 (1995).
  15. Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30, (11), 1191-1212 (2001).
  16. Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
  17. Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
  18. Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
  19. Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
  20. Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
  21. Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).
  22. DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
  23. Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
  24. Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, (13), 13044-13053 (2004).
  25. Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279, (21), 22284-22293 (2004).
  26. Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231, (2), 299-316 (2008).
  27. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6, (7), 709-715 (2011).
  28. Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6, (2), 161-166 (2009).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  30. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  31. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297, (5588), 1873-1877 (2002).
  32. Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143, (3), 141-153 (2004).
  33. Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. 45-57 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics