Induzione farmacologica di melanina epidermica e di protezione contro le scottature in un modello di topo umanizzato

Published 9/07/2013
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Medicine

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Summary

Melanina epidermica è indotta mediante applicazione topica di forskolina in un modello murino di umano UV-sensitive pelle chiara. Manipolazione farmacologica dei livelli di cAMP nella pelle e dell'epidermide oscuramento fortemente a proteggere contro l'infiammazione UV-mediata (scottature), come misurato dalla dose minima eritematosa (MED) dosaggio.

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Amaro-Ortiz, A., Vanover, J. C., Scott, T. L., D'Orazio, J. A. Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. (79), e50670, doi:10.3791/50670 (2013).

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Abstract

Correttezza di pelle, sensibilità UV e rischio di cancro della pelle tutti correla con la funzione fisiologica del recettore melanocortina 1, una proteina di segnalazione G s-accoppiato trova sulla superficie dei melanociti. MC1R stimola ciclasi e produzione di cAMP che, a sua volta, up-regola la produzione melanocitico di melanina nella pelle. Al fine di studiare i meccanismi attraverso i quali la segnalazione MC1R protegge la pelle contro i danni UV, questo studio si basa su un modello di topo con la "pelle umanizzato", basato sulla espressione epidermica di fattore della cellula staminale (SCF). K14-SCF topi transgenici mantengono melanociti nel epidermide e quindi hanno la possibilità di depositare melanina nell'epidermide. In questo modello animale, di tipo selvaggio risultati dello stato MC1R in robusto deposizione di nero eumelanina pigmento e un fenotipo con protezione UV. Al contrario, gli animali K14-SCF con difettoso segnalazione MC1R capacità presentano una pigmentazione rossa / bionda, molto poco eumelanina nella pelle eun fenotipo sensibile ai raggi ultravioletti. Ragionamento che eumelanina deposizione potrebbe essere rafforzato da agenti topici che imitano la segnalazione MC1R, abbiamo scoperto che l'applicazione diretta di estratto forskolina alla pelle di MC1R-difettoso topi di carnagione chiara provocato induzione eumelanina robusto e protezione UV 1. Qui si descrive il metodo per la preparazione e l'applicazione di un estratto di radice naturale forscolina contenente al K14-SCF topi con la pelle chiara e segnalare un metodo per misurare la sensibilità ai raggi UV determinando la dose minima eritematosa (MED). Utilizzando questo modello animale, è possibile studiare come induzione epidermica cAMP e melanizzazione della pelle influiscono risposte fisiologiche all'esposizione UV.

Introduction

L'incidenza del melanoma, la forma più letale di cancro della pelle, è aumentato drasticamente negli ultimi decenni negli Stati Uniti, in particolare tra gli individui di pelle chiara. Prova molecolare ed epidemiologiche forte implica radiazioni UV come un importante fattore ambientale causale 2-5. Esposizione ai raggi UV Aumento in forma di esposizione al sole e l'uso lettino abbronzante è probabile che sia responsabile di gran parte degli aumenti di incidenza melanoma 6-7. Rischio di melanoma sembra particolarmente legata scottature 8, in particolare quelli in giovane età 9-10. Rischio di scottature è legata non solo alla dose e intensità di esposizione UV, ma anche da fattori ereditari che influenzano reazione cutanea alle radiazioni UV. Pigmentazione della pelle è uno dei fattori determinanti più importanti di sensibilità ai raggi UV, il rischio di scottature e rischio di cancro. Il melanoma si verifica circa venti volte più spesso nelle persone di pelle chiara rispetto a individua pelle scuraLS 11-13.

La melanina, un pigmento prodotto dai melanociti nell'epidermide, è il principale determinante della carnagione. La melanina viene in due varietà principali: (1) eumelanina, un marrone / nero pigmento scuro efficace per assorbire l'energia della radiazione UV, e (2) Feomelanine, un rossastro / pigmento bionda meno efficace ad impedire la penetrazione di fotoni UV nella pelle. Il colore della pelle, la sensibilità ai raggi UV e rischio di melanoma sono in gran parte determinate dal contenuto epidermica eumelanina 14-15. Eumelanina più nell'epidermide, meno fotoni UV può penetrare nella pelle. A causa dei bassi livelli innate di eumelanina, individui dalla pelle chiara sono molto più inclini a effetti acuti e cronici delle radiazioni UV 16-18.

Pigmentazione della pelle, rischio di melanoma e la capacità di "tan" dopo l'esposizione ai raggi UV tutto correlano con la capacità di segnalazione del recettore melanocortina 1 (MC1R), G s-coupled sette transmembrana srecettore urface su melanociti 19-22. Quando MC1R vincola il suo affine ligando ad alta affinità, α-melanocita ormone stimolante (α-MSH), vi è l'attivazione di adenilato ciclasi e la produzione del secondo messaggero cAMP 23. La normale risposta fisiologica della pelle dopo l'esposizione UV comprende la produzione epidermica di α-MSH dai cheratinociti 24-29. Noi e altri ipotizziamo che cheratinociti derivata α-MSH lega a MC1R su melanociti epidermici, avviando la produzione a valle del secondo messaggero cAMP attraverso l'attivazione di adenilato ciclasi 30. livelli di cAMP controllano molti aspetti di differenziazione dei melanociti, comprese le vie di sopravvivenza, la riparazione del DNA e la sintesi del pigmento. Segnalazione MC1R e cAMP inducono chiaramente i livelli degli enzimi del pigmento e la produzione di eumelanina. Quando la segnalazione MC1R è intatto e livelli di cAMP melanocitici sono robusti, eumelanina viene prodotta e la pelle si scurisce. Tuttavia, se la segnalazione MC1R è difettoso elivelli di cAMP citoplasmatici restano bassi, feomelanina è prodotto invece 1. Sintesi di eumelanina può essere stimolata farmacologicamente da agenti che aumentano i livelli di cAMP 1,14,31-35.

Poiché la proteina MC1R è un importante regolatore del rischio di melanoma negli esseri umani 36-46, siamo interessati a meccanismi attraverso i quali MC1R protegge contro i melanociti carcinogenesi indotta da UV. Come base per i nostri studi, abbiamo generato un MC1R-variante di modello murino transgenico su un C57BL / 6 background genetico puro 1. In questo modello, fattore delle cellule staminali (SCF) è costitutivamente espressa nell'epidermide basali e melanociti epidermici interfollicolari vengono mantenuti nella pelle per tutta la vita 47, in contrasto con i topi non transgenici in cui melanociti localizzare al derma nei follicoli piliferi. Con il transgene K14-Scf incorporato, la epidermide diventa pigmentato con la particolarità melanina pigmenti del pigmentoceppo degli animali 1. topi K14-SCF sullo sfondo genetico C57BL / 6 con il tipo selvatico segnalazione MC1R avere la pelle nerissima caratterizzata da livelli molto elevati di pigmento eumelanina. Non sorprendentemente, questi animali sono altamente resistente ai raggi UV. Al contrario, geneticamente abbinati K14-SCF C57BL / 6 animali che ospitano un mutante inattivo MC1R non hanno quasi alcun eumelanina nell'epidermide. Invece, questi animali "estensione" (MC1R e / e) hanno una carnagione chiara della pelle causata da deposizione di pigmento feomelanina (Figura 1A) e sono molto più UV-sensitive 48-49.

Composti farmacologici con proprietà chimiche che consentono la penetrazione nella pelle hanno mostrato di indurre potentemente eumelanina nell'estensione (MC1R e / e) K14-Scf modello animale manipolando direttamente i livelli di cAMP in melanociti epidermici nella pelle. La melanina upregulation in questo modello è stato reported dall'attivazione ciclasi 1 nonché della fosfodiesterasi 4 inibizione 35. In questo articolo, dimostriamo la preparazione e l'applicazione topica di forskolina in estensione (MC1R e / e) animali K14-SCF quale modello umano UV-sensitive pelle chiara. Abbiamo dimostrato che l'applicazione due volte al giorno del farmaco promuove melanizzazione accelerata, che oscuramento della pelle è dovuto alla epidermica deposizione di pigmento melanina e quella indotta melanina epidermica protegge contro le scottature solari UV-indotta attraverso la misurazione di "dose minima eritematosa" (MED) 48.

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Protocol

1. Preparazione di forskolina per topica Amministrazione da un greggio estratto di radice della pianta Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii)

  1. Protocolli per esperimenti murini hanno seguito le linee guida per una condotta etica nella cura e l'uso di animali e sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso l'Università del Kentucky (protocollo # 00768M2004). L'estratto di radice è composto al 40% peso / volume in una base dermatologica tenore di etanolo al 70%, 30% di glicole propilenico.
  2. Pesare 200 g di estratto di radice forskolina greggio e trasferirlo in un becher. Per fare 500 ml di 40% (w / v), risospendere 200 g di estratto di radice forskolina grezzo aggiungendo maggior parte ma non tutto il volume del veicolo (70% etanolo, 30% di glicole propilenico) e portare la soluzione al circa 450 ml.
  3. Agitare per un'ora a temperatura ambiente. La soluzione sarà leggermente viscoso e può richiedere agitazione manuale "lift" dell'estratto in soluzione primal'ancoretta è in grado di prendere il sopravvento.
  4. Dopo un'ora di agitazione, si versa la miscela in un cilindro graduato e portare il volume a 500 ml con veicolo che è stato utilizzato per "lavare" il becher utilizzato per mescolare l'impasto (per massimizzare il recupero di forskolina dal bicchiere) .
  5. Trasferire l'impasto per 50 ml provette per centrifuga in polipropilene. Centrifuga (1.500 xg, a temperatura ambiente, 15 min) utilizzando una centrifuga da tavolo. A questo punto, il materiale insolubile sarà abbastanza compatta, permettendo il supernatante di essere facilmente travasato.
  6. Filtrare la soluzione attraverso una membrana di acetato di cellulosa 0,22 micron per rimuovere il materiale insolubile residuo dall'estratto. Utilizziamo un sistema per bottiglia progettata per coltura cellulare, insieme con l'uso di prefiltri fornite con l'unità per evitare un precoce intasamento della membrana da componenti insolubili della radice estratto. Quando si effettuano grandi volumi di dell'estratto, filtrare circa 100 ml per volta, cambiando la scommessa prefiltroween ogni volume aggiunto.
  7. Se conservato a temperatura ambiente, l'estratto mantiene l'attività biologica per fino ad un anno.

2. Preparazione di C57Bl / 6 K14-Scf Mice per trattamenti topici

  1. Rimuovere la pelliccia dorsale dagli animali da taglio elettrico. Brevemente anestetizzare gli animali con isoflurano inalatoria per facilitare taglio di pelliccia dorsale con cesoie elettriche attrezzati con una testa di preparazione chirurgica 0,25 mm (Fisher Scientific). Preferibilmente utilizzare un solo tipo di anestesia (es ketamina / xilazina) per minimizzare il rischio di overdose di anestetico. La camera di inalazione satura comporta dei rischi sul lavoro quando viene utilizzato al di fuori di una cappa aspirante e fornisce quantità sconosciuta di anestetico per animali. Idealmente dovrebbe essere usato un vaporizzatore precisione.
  2. Per rimuovere stoppie capelli residui, trattare gli animali con un depilatorio chimico. Somministrare anestesia per l'animale con una iniezione ip di ketamina 40 mg / kg e xilazina 4 mg / kg Una volta che gli animali sono adeguatamente anestetizzati (come giudicato da pinch tep), applicare una quantità dito dimensioni di crema depilatoria per la pelle dorsale tranciato con un dito guantato. Strofinare la crema sulla pelle per 30-60 secondi o fino a quando i capelli sono chiaramente visibili nella crema come viene spostato. Lasciare la crema solo per il tempo minimo necessario per la depilazione come l'esposizione prolungata porta a bruciare chimica della pelle, ripartizione epidermica e la morte da perdita di integrità epidermica.
  3. Pulire la pelle dorsale con garza imbevuta di acqua più volte fino a tutto crema è stato rimosso. Animali asciugare con asciugamani di carta morbidi, e consentire loro di recuperare in un luogo appartato caldo (ad esempio le gabbie pulite collocati su un tappetino di riscaldamento). Depilare gli animali uno per uno e monitorare attentamente tutta la procedura.

3. Somministrazione topica di forskolina o Vehicle Control

  1. Gli animali devono essere trattati uno alla volta. Brevemente anestetizzare con inspirazioned isoflurano posizionando il mouse sulla cima di un filtro di nylon permeabile all'aria forma-misura in base al quale è stato posto un tovagliolo di carta isoflurano satura in un barattolo di vetro con coperchio isoflurano satura in una cappa aspirante. Esporre il mouse per isoflurano per un tempo sufficiente per sopprimere i movimenti muscolari volontari ma per preservare la respirazione spontanea (tipicamente 10-20 sec). Lasciando l'animale in isoflurane troppo a lungo si tradurrà in soppressione respiratoria e morte. E 'meglio sbagliare sul lato di "andare luce" e dover ri-esporre il mouse brevemente più isoflurano, piuttosto che a un eccesso di esporre l'animale alla morte di droga e di rischio.
  2. Rimuovere l'animale dalla camera di isoflurano e posizionare su una panchina pad assorbente pulita.
  3. Usando una micropipetta 1.000 ml dotato di una punta in polipropilene monouso, elaborare 400 ml di 40% di estratto di forskolina greggio (animali di controllo del veicolo riceveranno il 70% di etanolo, 30% glicole propilenico solo).
  4. Trasferire l'estratto suldorso dell'animale per gocciolamento esso sulla pelle e poi, usando il lato della punta della pipetta, spalmare l'estratto sulla pelle dorsale finché tutta la pelle è stata coperta. Non c'è bisogno di asciugare la pelle dopo l'applicazione.
  5. Riportare il mouse per sua gabbia, e osservare attentamente fino a che non recupera dall'anestesia.
  6. In modo che gli effetti cAMP non-pigmento non devono confondere gli esperimenti di sensibilità ai raggi UV, interrompere tutti i trattamenti topici 2 giorni prima della esposizione ai raggi UV (effetto pigmento dura diversi giorni al di là ultimo trattamento topico).

4. Pelle misurazione del colore da riflettente Colorimetry

  1. Brevemente anestetizzare il mouse con isoflurano inalato (vedi sopra).
  2. Calibrare un colorimetro Minolta posizionando la testa portatile sulla superficie bianca standard predisposta con il colorimetro.
  3. Posizionare la testa di misura portatile del filo colorimetro con la pelle dorsale dell'animale garantire che il 1 cm2 turno aperture è completamente premuto sulla pelle. Prendere almeno tre misurazioni distinte in diverse aree della pelle dorsale.
  4. Calcola medio di L * punteggio ± SD per animale e per gruppo di trattamento. Colorimetria riflettente può essere fatto in qualsiasi punto nell'esperimento.

5. Determinazione della sensibilità UV da Calcolo di "Minimal eritematosa Dose" (MED)

  1. Utilizzare animali che sono stati pre-trattati con veicolo o forskolina come descritto sopra. Anestetizzare gli animali con l'iniezione intraperitoneale di una miscela standard di ketamina e xilazina (vedi sopra).
  2. Preparare un pezzo di nastro UV-occlusiva per il test MED. Per generare buchi nel nastro, usare un buco pugno pesante con un 1 cm 2 ritaglio circolare (Figure 2A e B). Avere fori di dimensioni definite e disposizione simmetrica nel nastro facilita il riconoscimento di alterazioni cutanee dopo l'irradiazione. Più di ogni foro nel nastro, applicare una piccola ma facilmente staccabile pezzo di nastro che può essere rimosso in tempi definiti durante l'esposizione UV per consentire la somministrazione di dosi UV diversi.
  3. Una volta che gli animali siano adeguatamente sedato, posizionare il nastro sulla superficie dorsale. Lubrificante occhio deve essere sempre utilizzato sotto anestesia.
  4. Accendere la sorgente UV costituito da due Westinghouse F15T8UV-B lampade con una potenza massima di 313 nm e una gamma di 280-370 nm. Lasciare che la lampada raggiunga la un'uscita UV costante come misurato da un fotometro UV con un sensore UVB (richiede in genere un paio di minuti per le lampade per riscaldare).
  5. Sulla base della velocità di trasmissione UV misurata dal fotometro UV, calcolare il tempo di esposizione UV per ogni dose desiderata. Ad esempio, le misure di uscita della nostra lampada UVB 2,4 mW / cm 2. Pertanto, per amministrare 5 kJ / m 2, la pelle dovrebbe essere esposto a 208 sec (che è 3 min e 28 sec) di radiazione UVB, calcolata di seguito:
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  6. Posizionare animali sedati (ciascuna con nastro occlusiva in luogo) ventrale superficie fino a garantire l'esposizione anche ai raggi UV. Per amministrare le dosi scelte di radiazioni UV, in sequenza rimuovere i piccoli nastri occlusive che coprono i fori per esporre uno centimetri 2 zone di pelle alle corrette dosi di radiazioni. Pertanto, usando l'esempio precedente, se il 40 kJ / m 2 è la più grande dose di nell'esperimento, poi l'animale sarebbe sotto la lampada per 27 min e 47 sec totale e la pelle nella condizione 40 kJ / m 2 avrebbe alcun sovrastante il nastro tutto il tempo. Tuttavia, nastro sovrastante la condizione 5 kJ / m 2 verrebbe eliminato quando c'è 208 sec rimanente nella esposizione. Tempo di rimozione del nastro dovrebbe essere fatto in modo tale che ciascuna condizione termina contemporaneamente.
  7. Dopo l'esposizione ai raggi UV, staccare il nastro dalla pelle dorsale con attenzione, facendo attenzione a non strappare la pelle con movimenti bruschi o eccessivamente forti. Mettere gli animali in un luogo caldo e tranquillo per consentirerecupero dall'anestesia.
  8. Controllo topi per 24-48 ore a cercare le zone discrete di eritema (arrossamento) o edema (gonfiore) corrispondenti ai siti anatomici trattati con la dose specifica di irradiazione UV. Documentare i risultati della pelle fotograficamente.
  9. MED valore corrisponde alla dose minima di UV che causa l'infiammazione come definito da eritema e / o edema dell'intero cerchio di pelle esposta. Si noti che la pigmentazione della pelle può impugnare la determinazione del MED, tuttavia, eritema ed edema possono ancora generalmente essere valutati con precisione, grazie anche alla forma definita delle aperture del nastro durante l'esposizione ai raggi UV.

6. Analisi statistica

Analizzare i dati tra coorti di topi da una ANOVA con test post Bonferroni (grafico Pad Prism). Valori di p <0,05 sono considerati statisticamente significativi.

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Representative Results

C57BL / 6 topi sono stati generati su sfondi eumelanotic, pheomelanotic o amelanotici incorporano il transgene K14-SCF come descritto (Figura 1A). Coorti di estensione carnagione chiara (MC1R e / e, Tyr + / +) topi sono stati trattati per via topica con dosi due volte al giorno di entrambi i veicoli (70% etanolo, 30% glicole propilenico) o del 40% di estratto di Coleus forskohlii radice di greggio (80 micron per dose) per 5 giorni (Figura 2B). Effetti di trattamenti topici sulla pigmentazione epidermica sono stati determinati sia mediante ispezione visiva e mediante colorimetria riflettente (Figura 1B). Applicazione della radice estratto è stato associato con robusto oscuramento epidermica in background transgenico K14-SCF ma non in animali non transgenici geneticamente corrispondenti. Noi interpretiamo questi risultati per indicare che melanociti epidermici interfollicolari devono essere presenti affinché melanina farmacologicamente indotta da depositare in situaRMIS. Sebbene l'estratto di radice è profondamente colorato per la presenza di fitochimici vegetali oltre forskolina, inscurimento della pelle non può essere soltanto dovuto ad un effetto tintura dal farmaco, come animali non transgenici non riescono ad esporre pelle scuro con l'estratto di radice (Figura 1B). Quando viene applicato in maniera due volte al giorno, effetti di forskolina uso topico melanizing può notare in appena due giorni, anche se oscuramento massimo viene realizzato dopo diversi giorni (Figura 1C). Grado di melanizzazione è dose-dipendente, come dimostrato da Fontana-Masson melanina colorazione di sezioni di pelle dorsale trattate con differenti concentrazioni di farmaco (Figura 1D).

Successivamente, l'effetto di forskolina uso topico sulla sensibilità UV è stata determinata mediante prove MED in topi di estensione (MC1R e / e, Tyr + / +) come descritto sopra (Figure 2 A e B). Determinazione MED è stata confrontata tra animali trattati con un trattamento farmacologico accelerato (due volte un'amministrazione giorno per 5 giorni, 10 dosi totali) rispetto ad un approccio standard (somministrazione una volta al giorno per 15 giorni, 15 dosi totali). Topi non transgenici sono stati inclusi per controllare gli effetti della droga non melanina. Entrambi i trattamenti hanno prodotto in quantità simili di pelle oscurandone in forskolin trattati K14-SCF animali. In particolare, i valori L * (colorimetria riflettente scala bianco-nero) per gli animali forskolin esposti erano 31.9 ± 1.8 e 31.1 ± 1.6 per l'applicazione accelerata rispetto a un'applicazione standard, rispettivamente. Non ci sono stati evidenti effetti tossici derivanti dall'esposizione forskolina in entrambi i gruppi di trattamento, quindi, abbiamo concluso che la somministrazione forskolina accelerata (due volte al giorno per 10 dosi totali, 80 micron per dose) promosso melanizzazione sicuro della pelle dorsale nel modo più efficace quello utilizzato in precedenza (una volta al giorno per 15 dosi totali, 80 mM per dose).

Forskolin indotta epidermica melanizzazione determinatoprotezione UV profonda, come giudicato da MED (Figure 2C-D). Così, mentre significa MED K14-SCF topi estensione trattati per due volte per 5 giorni con veicolo era 5.0 ± 0.0 kJ / m 2, la media MED per coorti trattate con forskolin topico era> 30.0 ± 0.0 kJ / m 2 (figure 2 A e C). Infatti, una dose di 30,0 kJ / m 2 era insufficiente per generare eritema in questo esperimento. Utilizzando dosaggio forskolina standard (una volta al giorno per 15 dosi totali, 80 micron per dose), abbiamo scoperto che la media MED per K14-SCF topi estensione trattati con forskolin era 50,0 ± 7,1 kJ / m 2 (Figura 2 B, D). È importante sottolineare che il pre-trattamento forscolina non ha influenzato MED di animali incapaci di melanizzazione, sia a causa della mancanza di melanociti epidermici K14-Scf-mediate (Figure 2C, D), o perché della carenza tirosinasi (Figura 2E). Poiché le applicazioni forskolin erano disContinuammo due giorni prima dell'esposizione ai raggi UV e non sono proseguite dopo l'esposizione ai raggi UV, possiamo concludere che gli effetti cAMP non-pigmentazione non hanno giocato un ruolo nei risultati MED. Piuttosto, i dati suggeriscono che epidermica melanizzazione era il meccanismo con cui forskolina indotta protezione UV in questo modello.

Figura 1
Figura 1. Trattamento topico della forskolina promuove oscuramento della pelle in estensione carnagione chiara (MC1R e / e) topi. (A) Fotografie di C57BL / 6 animali utilizzati in questo studio. Gli animali sono geneticamente identiche tranne al melanocortina 1 recettore (MC1R) e tirosinasi (Tyr) loci. Si noti che la pigmentazione è eumelanotic (nero) quando MC1R è funzionale ma pheomelanotic (blondish) quando MC1R è difettoso, come è il caso con l'estensione (MC1R e / e) mutante. Epidermal pigmentazione dipende dalla conservazione dei melanociti epidermici interfollicolari della pelle del transgene K14-Scf, e può essere facilmente visibile nelle orecchie. (B) Fotografie di estensione (MC1R e / e) K14-Scf o animali non transgenici trattati con 400 pl di controllo del veicolo (70% di etanolo 30% glicole propile) o 40% w / v (80 mM) forskolina applicata due volte al giorno per la pelle dorsale rasata per 5 giorni, totale di 10 applicazioni. Misurazioni del colore della pelle di colorimetria riflettente sono stati eseguiti per ciascun gruppo. Risultati della colorimetria riflettenti sono riportati come unità di media (± SD) riflettometria su L * asse di colore (bianco e nero). Si noti che la somministrazione topica di forskolina causato robusta pelle più scuro in K14-SCF animali transgenici, ma non in topi non transgenici. Esperimento di corso (C) tempo che indica oscuramento dell'orecchio forskolin trattato di K14-Scftopi di estensione per i tempi indicati (orecchie forskolin trattati sono indicati con triangoli blu),. Veicolo è stato applicato per l'orecchio destro per il confronto. (D) Fontana-Masson sezioni di pelle colorate prelevati da animali trattati con le dosi indicate di forskolina come descritto. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2. Melanizzazione Forskolin indotta protegge contro l'infiammazione UV-mediata come determinato dalla dose minima eritematosa test (MED). (A, B) Posizione del nastro occlusiva UV e UVB dosi di animali trattati due volte al giorno per 5 giorni (A, C) o una volta al giorno per 15 giorni (B, D, E) sia con veicolo o forskolina. Th e ultimo trattamento topico è stato applicato 48 ore prima dell'irradiazione. Pelle dorsale è stato esposto a varie dosi di UVB utilizzando del nastro adesivo UV-occlusiva con punzonato-out 1 cm 2 aperture circolari, e variando i tempi di esposizione a cedere la dose appropriata. Dopo l'irradiazione, cerchi di pelle esposta sono stati etichettati con una penna in alcuni esperimenti. MED di, definito da eritema e / o edema dell'intero cerchio di pelle esposta ad una dose particolare, sono stati determinati 48 ore dopo l'esposizione. Il MED ± SD risultati sono riportati come kJ / m 2 UVB, * p ≤ 0,001. (E) reflectometry colore della pelle e dei valori MED per tirosin-carenti K14-SCF topi estensione albino trattati per 10 giorni con veicolo o forskolina. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 3. Schema globale dell'esperimento. Coorti di estensione (MC1R e / e) K14-Scf o animali non transgenici sono stati preparati rimuovendo il pelo dorsale tramite taglio elettrico e / o depilazione chimica. Gli animali sono stati quindi trattati con applicazioni topiche di entrambi veicolo (70% etanolo, 30% di glicole propilenico) o con il 40% di estratto grezzo forskolina dai programmi di dosaggio indicati. Effetti sulla pigmentazione della pelle sono stati documentati fotograficamente, colorimetricamente e Fontana-Masson melanina colorazione. Sensibilità ai raggi UV è stato determinato dalla dose minima eritematosa test (MED).

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Discussion

Utilizzando un modello animale dell'essere umano pelle chiara, troviamo che l'applicazione topica di un estratto di radice di greggio ricco di forskolina scurisce con fermezza l'epidermide stimolando la produzione di melanina nella pelle. Epidermal melanizzazione dipende dalla espressione del fattore di cellule staminali nell'epidermide basali, come avviene in pelle umana ma non in pelle geneticamente modificato mouse. La pelle dorsale di topi geneticamente modificato manca un numero sufficiente di melanociti interfollicolari per impartire pigmento alla pelle. Only nell'impostazione di espressione costitutiva di un fattore di crescita dei melanociti come fattore delle cellule staminali (kit ligando) o il fattore di crescita degli epatociti (HGF) possono essere conservati melanociti nello strato basale dell'epidermide tutta la vita dell'animale 50-51. Il nostro modello animale della umana pelle chiara si basa sull'inserimento del transgene K14-SCF nella variante pigmento prolungamento della linea C57BL / 6 murina. Anche se gli animali di qualsiasi età possono essereusato, i nostri esperimenti tipicamente coinvolgono topi giovani adulti (4-12 settimane di età). A causa di un tronco melanocortina 1 recettore (MC1R), che porta alla perdita di segnale cAMP, topi estensione esprimono feomelanina preferenzialmente nel cappotto e la pelle (negli stati transgenici K14-SCF o HGF-Met) piuttosto che eumelanina 52-54. Come risultato di un'espressione melanina alterata, K14-SCF topi di estensione sono molto più sensibili ai raggi UV rispetto ai loro omologhi di tipo MC1R-wild, che hanno la pelle nerissima a causa di abbondante deposizione di epidermica eumelanina pigmento 1. Ragione per cui, poiché la produzione di eumelanina è notevolmente diminuita nel contesto di un MC1R mutante, che gli stimolanti farmacologici che simulano la segnalazione MC1R potrebbero salvare la produzione di eumelanina. MC1R è un recettore transmembrana G s-coupled, dal legame del suo ligando ad alta affinità α-melanocita stimolante (α-MSH), trasmette segnali pro-differenziazione al melanocyte citoplasma via adenylyl attivazione ciclasi e la produzione del secondo messaggero cAMP. Così, abbiamo ipotizzato che l'applicazione topica di forskolina, una diterpenoide cellulare permeabile che è un attivatore potente diretto di ciclasi, potrebbe essere in grado di promuovere la produzione di eumelanina nella, stato pheomelanotic MC1R-difettoso.

Uso forskolina purificato per questi studi, tuttavia, si è rivelata un costo proibitivo. I primi esperimenti determinando la quantità minima di forskolina richiesto per epidermica oscuramento nel modello di estensione K14-SCF suggerito che oscuramento massima verificato con l'uso di un peso, 40% per volume di soluzione utilizzando estratto grezzo che conteneva il 20% (peso rispetto al peso) di forskolina. Si calcola che l'applicazione di 400 pl di un forskolina finale 8% (peso per volume; 40% x 20%) soluzione determinerebbe la somministrazione di circa 80 pM di forskolina alla pelle dorsale ciascuna applicazione. Naturalmente, gran parte della dose erogatanon viene assorbito dalla pelle, invece di essere assorbito dal circostante pelliccia o cadere l'animale al momento dell'applicazione. Così è difficile riferire l'esatto dosaggio compreso che gli animali ricevono con ogni applicazione del farmaco. Tuttavia, quando applicato in questo modo, risultati forskolin a induzione robusto di enzimi pigmento nella pelle e produzione di eumelanina. In realtà, K14-SCF transgenici animali estensione dimostrato chiaramente oscuramento della pelle dopo la seconda applicazione (Figura 1C).

Anche se abbiamo precedentemente pubblicato pelle scuro con applicazione giornaliera del farmaco 1,48-49, qui mostriamo che l'applicazione due volte al giorno è associato robusto oscuramento epidermica e significativa protezione UV, suggerendo che melanizzazione farmacologica indotta può essere ottimizzato mediante somministrazione del farmaco più spesso di una volta al giorno. Oscuramento della pelle, che è dovuto all'induzione eumelanina nell'epidermide, dura comeFinché i trattamenti forskolin topici sono continuati. Anche l'applicazione cronica (attraverso tre mesi), sembrava ben tollerato dal 49 topi. L'incremento in pelle oscuramento è dovuto alla sintesi della melanina anziché proliferazione di melanociti nell'epidermide. 49. Una trattamenti topici sono sospesi, la pelle si affievolisce gradualmente torna alla sua carnagione chiara linea di base (oltre 2-3 settimane) come melanina epidermica è perduto con rinnovo normale dei cheratinociti. Oscuramento della pelle può essere facilmente determinata mediante una semplice ispezione visiva dei topi, però colore della pelle può essere quantificato utilizzando oggettivamente colorimetria riflettente 55-56. Questo metodo è un metodo rapido e indolore non invasivo per la misurazione del colore della pelle. Il colore può essere accuratamente descritto utilizzando L * a * b * (LAB) Colore spazio modello 57-58.

Per questi esperimenti ci siamo basati su un estratto di radice cruda della pianta forskolii Coleus, la fonte naturale di forskolina. Questa preparazioneè stato utilizzato per l'alto costo di esecuzione di questi esperimenti con forskolina purificato. Questo esperimento, ad esempio, richiesto circa 2 g di forskolina totale per l'applicazione due volte al giorno per sei animali per cinque giorni. 2 g di commercio disponibile forskolina HPLC-purificato costerebbe più di 20.000 dollari, rispetto a meno di $ 5 per l'estratto grezzo. Anche se forskolina purificato indotto epidermica melanina nel nostro modello animale 1, non possiamo escludere possibili effetti di altri composti di origine vegetale in estratto di radice di greggio, tra cui alcaloidi, fenoli e tannini. In realtà, il lavoro prima di utilizzare cavie o espianti di pelle umana suggerisce che i composti del greggio estratto di radice possono favorire l'assorbimento cutaneo forskolina 59. Finora, tuttavia, l'identità e il meccanismo di questi composti sono noti. Quindi, non possiamo escludere che modifica gli effetti di altri composti presenti naturalmente nel greggio estratto di radice.

La miscela forskolina composto èun liquido marrone scuro con un attraente aroma spezia simile che può essere facilmente applicato alla pelle per applicazione topica. Perché i materiali insolubili sono stati rimossi, applicazione quotidiana non lascia croste o depositi una volta assorbito dalla pelle. Sebbene la radice estratto grezzo è marrone scuro quando preparato in questo modo, pelle oscuramento indotta dal farmaco non è solo un effetto colorante, come dimostrato dal fatto che l'applicazione topica del composto su animali incapaci di melanizzazione pelle (per esempio MC1R e / e tirosinasi animali albini-carenti o topi non transgenici che mancano melanociti epidermici) non ha avuto effetto sulla pelle scurimento (Figure 1B e 2E). Consideriamo questi esperimenti come proof-of-concept manifestazioni che la manipolazione del cAMP nella pelle può indurre la pigmentazione della pelle scura protezione UV. Tuttavia, è improbabile che la somministrazione topica di forskolina è un'opzione terapeutica fattibile o pratico a causa della natura non specifica del farmaco. Iondiscriminate e l'attivazione non-mirata di ciclasi ciclasi e induzione di cAMP potrebbero essere tenuti a causare tossicità inaccettabili. È importante sottolineare che altri hanno dimostrato che la somministrazione topica di un inibitore della fosfodiesterasi 4 (Rolipram), potentemente up-regolata melanina nell'estensione modello animale K14-SCF, dimostrando che l'induzione cAMP cutanea e melanizzazione possono essere raggiunti da farmacologica alternativa rivolti 35. Evidentemente, prima manipolazione attualità dei livelli di cAMP nella pelle potrebbe essere tradotto per uso umano, la sua sicurezza dovrà essere attentamente valutate. Tuttavia, i nostri dati suggeriscono fortemente che melanizzazione farmacologicamente indotto dai raggi UV-protettivo come determinato dalla dose minima eritematosa test (MED).

In sintesi, la somministrazione topica di forskolina, un attivatore ciclasi, ha determinato un forte melanizzazione dell'epidermide di un modello murino di umana pelle chiara sulla base di cAMP difettoso segnalazione giùflusso di un difettoso melanocortina 1 recettore (MC1R). Epidermal melanizzazione era UV di protezione, come misurato da dose minima eritematosa test (MED). Noi ipotizziamo che la manipolazione farmacologica cAMP può non solo di soccorso di protezione UV eumelanization dell'epidermide, ma altre risposte UV-protezione MC1R-dipendenti pure.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Malinda Spry per l'assistenza tecnica. Riconosciamo inoltre fonti di finanziamento attuali e passati: il National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), Wendy Will causa Cancer Research Fund, il Cancer Foundation Markey, i bambini Miracle Network e Jennifer e David Dickens Melanoma Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20% Buckton Scott USA Inc. n/a Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP Butler Schein NCD 11695-6776-1 Dublin, OH, USA
Xylazine Anased Injection LA04612 Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP Putney NDC 26637-411-01 St. Joseph, MO, USA
Ethanol Decon Labs. 2705
Propylene glycol Adesco 05751L Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair Church Dwight JF-11 4381322 Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B Westinghouse F15T8UV-B
Radiometer photometer International light 1LT400A Peabody, MA,USA
Chromameter Konica Minolta CR-400 Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400 Konica Monilta DR-400 Ramsey, NJ, USA

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