Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Biology
 

Summary

פרוטוקול מתואר המשתמש במבחני Infinium של Illumina לבצע גנוטיפ בקנה מידה גדולה. מבחני אלה יכולים אמין גנוטיפ מיליונים SNPs על פני מאות דגימות DNA בודדות בשלושה ימים. נוצר פעם אחת, יכולים לשמש גנוטיפים הבאים כדי לבדוק לעמותות עם מגוון רחב של מחלות או פנוטיפים שונים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Adler, A. J., Wiley, G. B., Gaffney, P. M. Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications. J. Vis. Exp. (81), e50683, doi:10.3791/50683 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

גרסאות Genotyping בגנום האנושי הוכיחו להיות שיטה יעילה לזיהוי קשרים גנטיים עם פנוטיפים. ההפצה של גרסאות בתוך משפחות או אוכלוסיות יכולה להקל על זיהוי של הגורמים הגנטיים של מחלה. הפנל של Illumina של BeadChips גנוטיפ מאפשר לחוקרי גנוטיפ אלפים או מיליונים פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) או לצורך ניתוח וריאנטים אחרים גנומי, כגון העתקת מספר, על פני מספר גדול של דגימות דנ"א. ניתן להפיץ SNPs אלה לאורך כל הגנום או ממוקד באזורים מסוימים על מנת למקסם את פוטנציאל הגילוי. Assay Infinium עבר אופטימיזציה כדי להניב איכות גבוהה, תוצאות מדויקות במהירות. עם התקנה נכונה, טכנאי אחד יכול לעבד מכמה מאה ליותר מאלף דגימות DNA בשבוע, תלוי בסוג של מערך. assay זה מנחה את המשתמשים בכל שלב, החל מהדנ"א הגנומי וכלה בסריקה של המערך. שימוש בריאד התקינותNTS, דגימות הם מוגברות, מקוטעים, זירז, resuspended, הכלאה לשבב, הוארכה בסיס יחיד, מוכתם, ונסרק שתי מערכת הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה iScan או היי סריקה. צעד לילה אחד נדרש כדי להגביר את ה-DNA. ה-DNA הוא מפוגל ומוגבר isothermally ידי הגברה הגנום כולו, ולכן לא נדרש-PCR. דוגמאות הם הכלאה למערכים במהלך צעד הלילה שני. ביום השלישי, הדגימות מוכנות לסריקה ונותח. ה-DNA המוגבר עשויה להיות מאגרי הנשק בכמויות גדולות, ומאפשר למערכי חרוז להיות מעובד בכל יום בשבוע, ובכך למקסם את התפוקה.

Introduction

הקלדת פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) היא שיטה העיקרית של זיהוי וריאנטים סיכון הקשורים למחלות. מבחינה היסטורית, את היקף ניסויי גנוטיפ היה מוגבל על ידי הטכנולוגיה זמינה. שיטות גנוטיפ מבוססות ג'ל אלקטרופורזה מוגבלות במדגם וSNP תפוקה [1]. פיתוח מבחני אלה לעתים קרובות יכול להיות עתיר עבודה, בהסתמך על האיפור ומבנה באזור המקיף את הגרסה לאופטימיזציה [1]. מבחני גנוטיפ TaqMan, שפותחו על ידי חיים טכנולוגיים, יכולים להריץ מספר גדול של דגימות במהירות ועם מעורבות מינימאלית טכנאי [2], אבל הגבלות SNP-ריבוב ימשיכו להגביל את המספר הכולל של גנוטיפים להיטב תחת מיליון ליום [3,4 ]. פלטפורמת iPlex של Sequenom יכולה לרוץ גם דגימות רבות בבת אחת, אבל, כפי שניתן multiplexed פחות ממאה SNPs יחד, התפוקה היא נמוכה comparably כללי [5]. טכנולוגית זרם SNP של בקמן קולטרבאופן תיאורטי יכול לייצר יותר משלושה מיליון גנוטיפים ליום, אבל טווח פרויקט גבולות טכנולוגיה זו עד למקסימום של רק ארבעים ושמונה SNPs לכל תגובה [4,6]. בעוד assay GoldenGate יכול לעבד כמעט מאתיים דגימות DNA בכל יום במאה או אלפי SNPs לפי מדגם, המחיר לכל גנוטיפ הוא לא תחרותי עם טכניקות מתקדמות, Ultra-תפוקה גבוהה בעת הקלדה למעלה משלושה אלף SNPs בפעם אחת [4,7 ]. כדי לעבד כמה מיליוני גנוטיפים ליום, בקנה מידה הנדרשת ללימודי עמותה הגנום גדולים, מבחני מערך כלאה הפכו את האפשרות חסכונית ביותר בשוק.

הקו של Affymetrix של מערכי הכלאה והשורה של Illumina של מערכים מבוססי Infinium יאפשר פוטנציאל של מאות דגימות להיות מוקלדים במאה אלפים או מיליון של SNPs ב[ 4,8] המקביל. יכול להיות מפוזר SNPs אלה על פני הגנום כולו, מקומי באזורים של אינטרסים, כגון לשעברomes, או מותאם אישית להעדפותיו של המשתמש. יש מערכים אלה את היתרון של להיות לא רק מסוגל גנוטיפ במדויק מיליון SNPs לדגימה בבת אחת, אלא גם כדי למדוד וריאציה עותק מספר, פגמים בכרומוזומים פוטנציאלי הסרת לוט. יש מערכי OMNI BeadChip מיושרים-Infinium כיום היכולת גנוטיפ עד כמעט חמישה מיליון סמנים לדגימה, כוללים חצי מיליון לוקוסים מותאמים אישית, על עד כמעט מאה דגימות בכל יום.

כמו רוב המחלות מרכיב גנטי, ניסויים בקנה מידה גדולה אלה יכולים להיות מכריעים במציאת גנים הקשורים למחלה. גנוטיפ תפוקה גבוהה מאפשר לדור גנוטיפ יעיל במדגם קבוצות גדולים מספיק כדי לזהות קשר גנטי בצורה משכנעת בתדרי אלל קטין נמוכים יותר. פרויקטי גנוטיפ הגנום כולו ניתן להשתמש כדי לאתר אזורים בתדירות משמעותית מבחינה סטטיסטית שליטה במקרה אלל או הבדלי עותק מספר [9,10,11]. לדברי גה האדם הלאומינומו מכון מחקר, מחקרי עמותה הגנום הובילו ל1,490 פרסומים נפרדים בין 25 נובמבר 2008 ו -25 ינואר 2013, הנובע מגילוי 8,283 SNPs עם p-value של פחות מ 1 x 10 -5 (ראה http:// www.genome.gov/gwastudies/). מחקרים אלה, שחקרו תנאים החל גובה לסרטן אשכים, נהנה מהגישה הרחבה המוענקת על ידי ניתוח הגנום כולו. במקרים כגון אלה, אזורים שלמים של עניין שאולי חמקו מתשומת לב שההיקף של הקלדה היה מגביל מדי. לפיכך, לעמותה בקנה מידה גדולה מנתח, טכניקת גנוטיפ הגנום היא הטכניקה של בחירה.

גרסאות שונות של assay Infinium קיימות, שכל אחד מיועדת לשימוש עם סוגים מסוימים של מערכים. Assay InfiniumUltra, דן לעומק בהמשך, הוא מתאים עבור רבים 12 - או שבבי מערך 24 מדגם. אלה לעתים קרובות גנוטיפ למעלה ממאה אלף SNPs לדגימה ה-DNA ולהתמקד בלאאזורי argeted, כגון על לוחות exome או מותאמים אישית. גרסאות assay אחרות ייתכן שתידרשנה לסוגי שבבים אחרים, כגון מערכי גנוטיפ הגנום כולו. עם זאת, כמו כל מבחני Infinium חולקים בסיס משותף ובעיקר שונים רק על ידי השמות מגיב, כרכים מגיב, או הליך מגיב מכתים המדויק, טכניקות שיכללו בגרסת assay אחד יכולה לעתים קרובות להיות מיושמות באופן אוניברסלי. מערכים אחרים, כגון מערכי מתילציה, עלולים להשתמש בפרוטוקול כמעט זהה, גם כן. יש להקפיד להשתמש אך ורק את הגרסה של assay הנדרש לסוג השבב בשימוש. סוגים מסוימים, כגון אלה מדידת רמת ביטוי גנים, עלולים לדרוש שימוש בפרוטוקול nonInfinium.

דגימות חייבות להיות מעובד בקבוצות. לדוגמא, עם assay InfiniumUltra, צינורות מגיב prehybridization מכילים מספיק נפח לרוץ 96 דגימות, ולא ניתן refrozen הצינורות. לכן, דגימות חייבות להיות מנוהלות בקבוצות של 96 דגימות בכל פעם. הדגימות יהיו מוגברות בעצי האשוחיום לא. לאחר כ 1 שעות של benchwork, הדגימות חייבות להיות מחוממות בתנור הסעה ל20-24 שעה. למחרת היום, כמעט 4 שעות יוקדש פיצול, מזרז, וresuspending הדגימות, ובשלב זה יכול גם להיות קפוא הדגימות לשימוש עתידי, או הכלאה לשבב. טוען שבבים לוקח כמעט שעה 2, לאחר שהדגימות יהיו הכלאה בין לילה ל16-24 שעה. ביום השלישי, שלב הצביעה והסיומת לוקח ~ 4 שעות. שעה נוספת יוקדש כביסה, ציפוי, ומייבש את השבבים. לבסוף, המערכים נסרקים, אשר עשוי להימשך 15-60 דקות / שבב, תלוי בסוג שימוש.

אמצעי בטיחות במעבדה וניקיון התקן חלים. למרות שאינה מבוססת-PCR ההגברה, תחנות עבודה נפרדות ולמראש postamplification נהלים נחוצות כדי למזער את הסיכוי לזיהום. מספר זיהוי של כל מגיב-סיפק ערכה בשימוש חייב להיות מחובר גיליון מעקב. ריאדNTS צריך להיות מופשר מייד לפני השימוש והפוך כמה פעמים בעבר מחלק. ה-DNA להיות מוקלדים חייבת להיות DNA באיכות גבוהה גנומית (260/280 יחס ספיגה 1.6-2.0, 260/230 יחס ספיגה מתחת 3.0), שבודד על ידי שיטות סטנדרטיות ולכמת עם fluorometer. השפלה של ה-DNA היא לעתים קרובות גורם תורם בassay תוצאות באיכות נמוכה. בדרך כלל, 200 ng של DNA הנדרש, אם כי סכום זה עשוי להשתנות בהתאם לסוגים מסוימים שבב. רובוט טיפול נוזלי טקאן יכול להפוך שלבים רבים של הפרוטוקול ולמזער טעויות אנושות כגורם.

Protocol

יום אחד

1. הכנה

  1. לוותר 200 ng של DNA לתוך צלחת עמוקה היטב, 96-מדגם. לפחות 96 דגימות (צלחות מלאה) חייבים להיות מצופים כדי להבטיח שאין מגיב יהיה מבוזבז. לתייג את הצלחת עם מדבקה ברקוד המסופקת על ידי הערכה צנטריפוגות זה.
  2. על מנת לנרמל את הכרכים, השאר את הדגימות במגירה או קטר לילה ברדס להתאדות הנוזלי. מכסה את הצלחת באופן רופף במגבת מכסה או בנייר כדי לשמור את אבק.

2. הגברה

אזהרה: דגימות לא צריכים לעבור הגברה, אלא אם כן 4 שעות תהיה זמינות ביום לצעדי פיצול, משקעים, וresuspension הבא.

  1. הסר את התיבה מצורפת החברה, או חבילה של צינורות שכותרתו "מראש" מ-20 ° C במקפיא (צינור אחד MA1, MA2, וה-MSM הוא מספיק עבור כל קבוצה של 96 דגימות). הגדר צינורות של MA2 וMSM על הספסל להפשיר. הפעל כראוי מכוילג תנור והמוגדר 37 °
  2. שימוש באגן מגיב ו10 μl, פיפטה 8 ערוצים, לוותר 4 μl של ה-DNA resuspension הצפת לבאר כל רעננותם הדגימות. אין צורך להשליך טיפים פיפטה בין כל עמודה אם טיפול נלקח לא לגעת נוזלי.
  3. עם פיפטה 8 ערוצים, לוותר 20 μl של MA1 לבאר כל הצלחת. לכל מגיב חדש, השתמש באגן מגיב טרי. מכסה את הצלחת עם חותם לשימוש חוזר, דופק צנטריפוגות, ומערבולת דקות 1 ב 1,600 סל"ד על שייקר microplate.
  4. 2.4) דגירה בטמפרטורת חדר למשך דקות לפחות 30.
  5. לוותר על 4 μl של 0.1 N NaOH לתוך באר כל הצלחת. מכסה את הצלחת עם החותם לשימוש חוזר, דופק צנטריפוגות, ומערבולת דקות 1 ב 1,600 סל"ד.
  6. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
  7. לוותר 34 μl של MA2 לבאר כל הצלחת.
  8. לוותר 38 μl של MSM לבאר כל הצלחת. מכסה את הצלחת עםחותם לשימוש חוזר, דופק צנטריפוגות, ומערבולת דקות 1 ב 1,600 סל"ד.
  9. מניחים בתנור במשך 20-24 שעה.

יום שני

3. התנפצות

  1. הסר צינורות FMS מ" Post-1 "-20 ° C תיבה (שפופרת אחת מספיקה לכל קבוצה של 96 דגימות). להפשיר על ספסל או באמבט מים בטמפרטורת חדר. לאחר הכנסה להכניס MIDI-הצלחת לתוך מערכת דגירה microsample שולחן, הדלק את הגוש החום ומוגדר 37 ° C.
  2. ברגע שצינורות מופשרים, להסיר צלחת מדגם מ- צנטריפוגות דופק תנור ו. לוותר 25 μl של FMS לבאר כל צלחת ה-DNA. החלף את המכסה, דופק-צנטריפוגות, ומערבולת ב1,600 סל"ד דקות 1.
  3. דגירה צלחת בגוש חום במשך שעה 1.

4. משקע

  1. הסר את צינור PM1 מ" Post-3 "תיבת 4 ° C או לארוז וחם לטמפרטורת חדר (שפופרת אחת מספיקה לכל קבוצה של 96 דגימות). הסר את הצלחת מגוש חוםk ודופק צנטריפוגות.
  2. לוותר 50 μl של PM1 לבאר כל הצלחת. החלף את המכסה, דופק-צנטריפוגות, ומערבולת ב1,600 סל"ד דקות 1.
  3. דגירה צלחת בגוש חום למשך 5 דקות.
  4. הסר את הצלחת מגוש חום, לכבות אותו, וזורקים את המכסה הצלחת. לוותר 155 μl של isopropanol 100% לבאר כל הצלחת. מכסה היטב במכסה חדשה ולהפוך באופן ידני את הצלחת מספר רב של פעמים כדי לערבב.
  5. מניחים צלחת ב4 ° C למשך התקופה מינימאלית של 30 דקות. הפעל צנטריפוגה בקירור ולהגדיר עד 4 ° C כדי לקרר.
  6. לאזן את הצלחת ו צנטריפוגות ב 4 ° C למשך 20 דקות ב 3,000 x גרם.
  7. בדוק את תחתית הצלחת בלי ההיפוך ולאשר את הדגימות הם זירז בגלולה כחולה. אם ניתן לראות שום כדורים, צנטריפוגות שוב. קבל מגבות נייר.
  8. מחק את המכסה ובמהירות להסיר את הנוזל על ידי היפוך לצלחת וקשה עליו בכוח על benchtop המכוסה במגבות נייר. ברגע שהצלחת היא אניnverted, לדאוג שלא יחזור אותו בזמן שכל נוזל נשאר. שוב ושוב לנצל את הצלחת נגד המעבדתיים עד שכל נוזל מוסר.
  9. הגדר את הצלחת על מדף מבחנה, הפוך, לייבוש. דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.

5. Resuspension

  1. הסר RA1 מ" Post-2 "-20 ° C תיבה והפשרה באמבט מים בטמפרטורת חדר. הפעל את התנור ולהגדיר אותו 48 ° C.
  2. מופשר ברגע, לוותר 23 μl של RA1 היטב בכל צלחת המדגם. אין לשפוך את כל הבקבוק של RA1 לאגן; לחסוך 30 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר. אם הדגימות תהיה הכלאה על המערכים מאוחר יותר באותו היום, הנח את RA1 לקריר 4 ° C. אם הדגימות תהיה לרוץ במועד מאוחר יותר, תווית הבקבוק ותקפיא RA1.
  3. חום לאטום את המכסה חדשה לצלחת. Pulse-צנטריפוגה את הצלחת ומניח אותו בתנור במשך שעה 1.
  4. הסר את הצלחת מהתנור והמערבולת ב1,800 סל"ד דקות 1.
    הדגימות יכולות להיות שעות בבטחהישנות בשלב זה למשך שבוע עד אחת. צלחות עשויות להיות מאגרי נשק, ודגימות עשויות להיות מחדש כדי להיערך ליישום שבב חרוז, במידת צורך. אם ימשיך עם ההליך, להשאיר את הצלחת בטמפרטורת חדר ולהדליק את הגוש החום. אחרת, לאחסן את הצלחת ב -20 ° C.

6. הכלאה

אזהרה: דוגמאות לא צריכה לעבור הכלאה אלא אם 5.5 שעות זמינות ביום לצביעה הבא ולשטוף מדרגות.

  1. הפעל את הגוש החום ולהגדיר אותו 95 ° C. הפעל את התנור ולהגדיר אותו 48 ° C.
  2. ברגע שהטמפרטורה התייצבה, דגירה את הצלחת על הגוש החום עבור 20 דקות.
  3. בעוד הצלחת denaturing, להסיר את התיבה של שבבי חרוז מ4 ° C ולהגדיר אותו על הספסל. קח בקבוק XC4 (מערכה בטמפרטורת חדר) ולהוסיף 330 מיליליטר של 100% אתנול. נער אותה היטב דגירה בטמפרטורת חדר למשך הלילה. הכן תערובת פוראמיד / EDTA (פוראמיד 95%, 0.2%EDTA (0.5 M), 4.8% H 2 O לפי נפח) ולהקפיא במרווחים של 15 מיליליטר נפרדים. פוראמיד העודף עשוי להיות מאגרי נשק.
  4. הסר את צלחת המדגם מהגוש החום. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
  5. בעוד צלחת קירור, להכין את חדר היב. תא אחד יהיה צורך לכל ארבעה שבבי חרוז מעובד.
    הנח שטיח גומי בחלק העליון של בסיס תא היב, ליישר את החור העבה עם החלק הקדמי של הבסיס. סמל הברקוד חרוט לתוך הבסיס עדיין צריך להיות גלוי לעין (ראה איור 2).
  6. בעזרת פיפטה 1,000 μl, לוותר 400 μl של PB2 לכל אחד ממאגרי humidifying שמונה המגולפים לתוך הבסיס. ניתן למצוא PB2 בתיבה "Post-3" או חבילה. מניחים את המכסה תא היב על הבסיס ולאחוז בשני הקצוות על ידי סגירת שני אבזמים בצדדים באלכסון הפוכים הראשונה.
  7. הסר את חבילות כסף בודדות של שבבי חרוז מקופסאות שלהם, אבל, על מנת למזער אקספו 'יפסהקפד אוויר והאור, עדיין לא לפתוח אותם. לסרוק בזהירות ברקודים של השבבים ולהקליט את הסדר שבו הם יהיו טעונים בגיליון מעקב, יחד עם תעודות הזהות של התיבה שממנו הם באו. הבנה מעמיקה של איפה כל דגימת דנ"א בודדה תהיה לוותר על שבבי חרוז היא הכרחית.
  8. הסר את חבילות כסף בודדות של שבבי חרוז מקופסאות שלהם, אבל, על מנת לצמצם את חשיפתם של השבבים לאוויר והאור, עדיין לא לפתוח אותם. לסרוק בזהירות ברקודים של השבבים ולהקליט את הסדר שבו הם יהיו טעונים בגיליון מעקב, יחד עם תעודות הזהות של התיבה שממנו הם באו. הבנה מעמיקה של איפה כל דגימת דנ"א בודדה תהיה לוותר על שבבי חרוז היא הכרחית.
  9. רגע לפני 30 דקות להתקרר השלים, לפתוח את ערכות שבבי חרוז הכסף. הסר את השבבים משרוולי הפלסטיק השקופים שלהם. בלי לגעת בחרוזים, למקם את כל שבב חרוז על הוספת חדר היב, מכוון את השבבברקוד עם סמל הברקוד חרוט לתוך המשטח העליון של הכנס.
  10. לקלף ולהשליך את המכסה של צלחת המדגם. קח 15 μl של מדגם מצלחת המדגם ולוותר לאט על הכניסה למערך (ראה איור 3). יש לנקוט כדי למקם את המדגם הנכון על שבב חרוז הנכון במקום הנכון, כדי שבב חרוז שנרשם קודם לכן התאמת טיפול יוצא דופן. פיפטה רבה ניתן להשתמש כדי לוותר נוזלי על השבבים, אך יש לקחת מחשבה תחילה כדי לשאוב רק את מספר הדגימות שניתן להציב בבטחה על שבב חרוז, כמו מספר השורות על צלחת לא תמיד תואם את מספר שורות על שבב.
  11. ברגע שכל מדגם הושם על המערך המקביל שלה, מבחינה ויזואלית לבדוק את השבב לבועות או אזורים לא מצופות בנוזל. אם הבעיות האלה קיימות, בעדינות לטלטל את הכנס. אם יש צורך, יותר נוזלי ניתן להוסיף למערך. תשמור על עצמך כדי להוסיף את דגימת DNA הנכונה.
  12. פתח את תא היבd למקם מוסיף מעל מאגרי humidifying. ברקוד של השבב צריך להיות ממוקם מעל רקוד חרוט לתוך הבסיס קאמרי היב. החזר את מכסה תא היב ולסגור את כל ארבעת האבזמים ידי סגירת האבזמים בצדדים באלכסון ההפוך הראשונה.
  13. דגירה הקאמרית היב בתנור למשך 16-24 שעה. יש להיזהר שלא להטות את התאים בעת מעבר להם.
  14. אם צלחת יותר מפעם אחת היא להיות מעובד, חזור לשלב 6.2. עיבוד יותר מ -24 שבבי חרוז ביום אינו מומלץ במטרה הן לצמצם את הסיכוי לטעויות אנוש בעת טיפול בכמות גדולה של מוצרים צריכים או שבבים וכדי למזער את כמות הזמן הנדרש לעיבוד שבבי בצעדים עתידיים, כטיפול חייב יש לנקוט כדי להגביל את החשיפה שלהם לאוויר ככל האפשר. בקבוק אחד של XC4 מספיק לעד 24 שבבי חרוז.

יום שלישי

7. צביעה הכנה

  1. הסר את תאי היב מהתנור ולדגור על te החדרmperature ל25 דקות. אם עיבוד יותר משני תאי היב, להתנודד הסרתם הכפולה כל 10 דקות. על מנת לשמור על השבבים מפני התייבשות, עדיין לא לפתוח את תאי היב.
  2. בעוד תאי היב הם קירור, הסר את הצינורות של XC1, XC2, TEM, STM, וכספומט מ" Post-1 "-20 ° C התיבה ולהגדיר על הספסל להפשיר. קח בקבוק RA1 מהתיבה "פוסט 2" ב-20 ° C (או 4 מעלות צלזיוס, אם שימוש חוזר מגיב מהיום הקודם) והפשרה באמבט מים בטמפרטורת חדר. הפשירו שפופרת של פוראמיד 95% גם כן. במשך 8 שבבי חרוז מעובד, שני צינורות של כל מגיב, 10 RA1 מיליליטר, 15 מיליליטר פוראמיד, וXC3 150 מיליליטר (שנמצא בטמפרטורת חדר, תיבה מצורפת חברה) יידרש.
  3. לכל שבב מעובד, שקופיות זכוכית אחד, סד זרימה דרך פלסטיק אחד, שני אבזמי מתכת, וspacer אחד הפלסטיק יידרשו. לspacer הפלסטיק, להשתמש רק באחד ברור; להפריד ולבטל את spacer האטום. בנוסף, שתי מנות לשטוף שבב וחרוזמגש שבב חרוז אחד יהיה צורך, יחד עם תחנה אחת נוזלי הרכבה ובר הרכבה פלסטיק אחד.
  4. נקה את שקופיות זכוכית על ידי ריסוס אותם עם אתנול ומנגב אותם יבשים.
  5. הפעל את אמבט המים החמים שמחובר למתלת תא הזרימה דרך ולהגדיר אותו 44 ° C. נער בעדינות את מדף התא כדי לסלק כל בועות.
  6. כאשר תא היב מתקרר ל25 דקות, למלא צלחת לשטוף עם PB1 (כ 200 מיליליטר). ניתן למצוא PB1 ב" Post-4 "תיבת טמפרטורת החדר.
  7. פתח חדר היב אחד. הסר את חותם הכיסוי משבב חרוז ידי אחיזה בחותם בפינה אחת ובעדינות לקלף באלכסון (ראה איור 4). ברגע שחותם מוסר, הנח מייד את השבב במגש שבב חרוז ולצלול בPB1 בלי לגעת בחרוזים. חזור על פעולה עד שהמגש מלא בשבבי חרוז, נזהרים שלא לתת לאף יבש שבב.
  8. בעדינות להתסיס את המגש כדי להסיר כל בועות ולהשאיר את השבבים מתחת למים במשך דקות 1.למלא צלחת לשטוף את השני עם PB1. להתסיס את המגש שוב.
  9. הזז את המגש של שבבי חרוז לתוך הצלחת לשטוף את השני. בעדינות להתסיס ולתת לספוג במשך 1 דקות, ולאחר מכן להתסיס שוב.
  10. בתחנת ההרכבה הזרימה דרך הנוזל, למקם ארבע פלטות זרימה דרך פלסטיק שחורות בחריצים. מלא את התחנה עם PB1 עד שהנוזלים כמעט מגיעים לגובה של שמונה סוגריים הרכבה (כ 150 מיליליטר).
  11. הסר שבב חרוז מהמגש ומניח אותו לתחנת ההרכבה על סד זרימה דרך פלסטיק. ברקוד השבב צריך להיות מיושר מעל סמל הברקוד חרוט לתוך תחנת ההרכבה. חזור על פעולה במשך שלושה שבבים האחרים שיכול להתאים בתוך תחנת ההרכבה.
  12. הנח spacer פלסטיק שקוף על גבי שבב חרוז. השוליים החיצוניים של spacer צריכים להקיף את סוגריים בתוך תחנת ההרכבה. חזור על פעולה עבור השבבים האחרים שקועים בPB1.
  13. הנח את הבר הרכבה מפלסטיק בתחנת ההרכבה על ידי התאמתו מעל החריצים. מניח בעדינות שקופיות זכוכית על גבי spacer הפלסטיק על ידי לחיצה על חלקו האחורי של השקופית נגד בר ההרכבה ולאט לאט הוריד את החזית לתוך הנוזל. החריץ בחלק העליון של השקופית צריך להתמודד כלפי מטה, ישירות מעל הברקוד של השבב, והשאיר את פער בין שבב חרוז והשקופיות בסוף ברקוד. חזור על פעולה עבור השבבים האחרים שקועים בPB1. לתרשים זרימה דרך הרכבה מלאה, ראה איור 5.
  14. הגעה לבועות בין השבב והשקופיות. אם בועות מופיעות, בעדינות להעלות השקופית בסוף ברקוד ונסה שוב. יכולות להימחק בועות עיקשות מהזכוכית עם מגבת מעבדה נייר (Kimwipe).
  15. הצמד שני אבזמי מתכת סביב שקופיות הזכוכית, אחד לקראת הסוף ברקוד ואחד לכיוון האחורי. הקצוות של האבזמים צריכים אחיזת סד זרימה דרך הפלסטיק מתחת לשבב. חזור על פעולה עבור כל שבב השקוע בPB1.
  16. הסר את מכלולי זרימה דרך הושלמו ומקום אופקי על bench. יש להיזהר שלא להטות את ההרכבה בצורה אנכית, מה שמאפשר את הנוזל מתחת לשקופית הזכוכית לברוח. אם יותר שבבים מחכים במגש לשטוף, הם יכולים להיות התאספו תחת קורת PB1. אם שבבים אחרים מחכים בתאי היב המקוריים שלהם, להשליך את כל הנוזל בתחנת ההרכבה ולשטוף כלים, ולחזור לשלב 7.6.
  17. ברגע שכל שבבי חרוז נמצאים במכלולי זרימה דרכם, לקחת מספריים כירורגית וחותך את שני הקצוות של spacer כבוי, כמו ליד לשקופית הזכוכית ככל האפשר.

8. מכתים והארכה

  1. ודא שמדף תא הזרימה דרך הגיע 44 מעלות צלזיוס בתפקידים מרובים עם בדיקה טמפרטורה. אם הטמפרטורה היא על ידי יותר ממחצית תואר, להתאים את הטמפרטורה של המים באמבטיה.
  2. הנח הרכבה זרימה דרך שבב חרוז על המדף קאמרי ידי הזזה ההרכבה למטה ומשדל את הסד בחלק העליון. הצד האחורי של שבב חרוז צריך להיות נגיעה במדף הקאמרית. Gשקופית ילדה צריכה להיות עם פנים החוצה, עם החריץ בחלק העליון כדי ליצור מאגר מגיב. חזור על פעולה עבור כל הרכבה שבב חרוז.
  3. בעזרת פיפטה 200 μl, להוסיף 150 μl RA1to מכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה במשך 30 שניות. חזור 5x.
  4. בעזרת פיפטה 1,000 μl, להוסיף 450 μl XC1to מכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה של 10 דקות.
  5. הוספת 450 XC2 μl למכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה של 10 דקות.
  6. הוסף 200 TEM μl למכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה במשך 15 דקות.
  7. הוספת 450 μl 95% תמהיל פוראמיד / EDTA למכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה דקות 1. חזור על 1x.
  8. דגירה מכלולי זרימת הדרך למשך 5 דקות.
  9. הגדר את האמבטיה במים החמים לטמפרטורת listed בצינורות של STM (או 37 מעלות צלזיוס אם אף מוצג). ודא שלכל צינור STM אותה הטמפרטורה מופיעה ברשימה.
  10. הוספת 450 XC3 μl למכלולי זרימת הדרך. דגירה דקות 1. חזור על 1x.
  11. כאשר טמפרטורת אמבט המים החמים הגיעה לטמפרטורה הרצויה, להוסיף 250 μLSTM למכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה של 10 דקות.
  12. הוספת 450 XC3 μl למכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה דקות 1. חזור על 1x.
  13. דגירה מכלולי זרימת הדרך למשך 5 דקות.
  14. הוסף 250 כספומט μl למכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה של 10 דקות.
  15. הוספת 450 XC3 μl למכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה דקות 1. חזור על 1x.
  16. דגירה מכלולי זרימת הדרך למשך 5 דקות.
  17. הוסף 250 STM μl לזרימה דרךמכלולים על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה של 10 דקות.
  18. Add4 50 XC3 μl למכלולי זרימה דרך על ידי מחלק הנוזלי לתוך מאגר הזכוכית. דגירה דקות 1. חזור על 1x.
  19. דגירה מכלולי זרימת הדרך למשך 5 דקות.
  20. חזור על שלבים 8.14-8.19 1x.
  21. הסר את מכלולי זרימה דרך ממדף החדר ולכבות את אמבט המים.

9. כביסה ואיטום

  1. למלא צלחת לשטוף שבב חרוז מכתים עם PB1 (כ 315 מיליליטר). שתי מנות לשטוף אנכיות ומגש שבב חרוז האנכי יהיו צורך, יחד עם סעפת ואקום אחד לפחות.
  2. לפרק הרכבה זרימה דרך על ידי החדרת מוט מתכת דקה שבין האבזמים והסד ולאחר מכן ציר. מניח בצד שקופיות הזכוכית ולהסיר את שבב חרוז. מייד למקם את שבב חרוז במגש שבב חרוז האנכי ולצלול בPB1. חזור על פעולה עבור כל הרכבה זרימה דרך, מטפל להתמודד EACשבב שעות חרוז באותו הכיוון ומזעור חשיפתם לאוויר.
  3. בעדינות להתסיס את מגש שבב חרוז כדי להסיר בועות. דגירה שבבי חרוז השקוע בPB1 למשך 5 דקות. מלא את הצלחת לשטוף אנכית השנייה עם XC4 הכין היום קודם לכן. להתסיס את מגש שבב חרוז שוב.
  4. הזז את מגש שבב חרוז לצלחת לשטוף מלא XC4. בעדינות להתסיס את המגש כדי להסיר בועות. דגירה של 5 דקות ולהתסיס שוב.
  5. בתנועה אחת חלקה, מושך את מגש שבב חרוז מהצלחת לשטוף ולהגדיר על מדף מבחנה, כך שהחרוזים על כל פנים שבב חרוז כלפי מעלה. עם פינצטה נעילה עצמית, החלק את שבב חרוז מהמגש ומניח על מדף מבחנה. חזור על פעולה עבור כל שבב חרוז.
  6. בזהירות להעביר את מדף המבחנה של שבבים לייבוש ואקום. לסגור ולהפעיל את הוואקום, על מנת להבטיח איטום הולם. דגירה של 50-55 דקות. במידת צורך, לחמם את הסורק בזמן הדגירה.

10. סריקה

  1. ט"וrn את הוואקום ולחזור לאט לאט ללחץ האטמוספרי. בדוק ששבבי חרוז הם יבשים. במידת צורך, לנגב את הקצוות ותחתונים של השבב עם מגבת נייר כדי להסיר כל נוזל או פסולת.
  2. הפעל את תוכנת הסריקה ולעבור שבבי חרוז למגש סריקה. הורד קבצים של השבב לפענח (dmaps) על ידי הפעלת תוכנת לקוח קובץ פענוח ומזיני רקודים שבב חרוז הרצוי, יחד עם תעודות הזהות של התיבה המתאימה שלהם. שבבי חרוז Unscanned יכולים בבטחה להיות מאוחסנים באזור יבש וחשוך עד 72 שעה.
  3. ברגע שהשבבים יושבים כראוי במגש והקבצים לפענח מוכרים על ידי התוכנה, להתחיל בסריקה.

Representative Results

שבב חרוז כראוי מעובד צריך להציג עוצמות לייזר האור אדומות וירוקות בהירות וברורות בעת הסריקה. באיור 6, תוכנת סריקת iScan מציגה דגימת DNA הגנומי סטנדרטית הכלאה בהצלחה למערך genotyping SNP מותאם אישית בלוח. נוקלאוטידים שהכותרת שצורפו במהלך שלבי הרחבה ומכתים לזרוח תחת האורות של שני לייזרים. כנוקלאוטידים אלה באופן סלקטיבי להאריך שרשרת oligonucleotide של חרוז הכלאת גדיל DNA המקוטע, וכמו שרשרות oligonucleotide נועדו לסיים באתר של הגרסה, את הצבע ואת עוצמת האות וכתוצאה מכך יכולים לשמש כדי לקבוע את אללים נוכחים ב אתר SNP.

גיליון נוצר על ידי משתמש מדגם, אשר תואמה את תעודות זהות של מדגם ומידע קליני לchipID ועמדה, ומניפסט SNP מערך ספציפי, המתקבל ישירות מהחברה, שניהם הכרחיים על מנת לייבא את SCAקבצי פלט nner לתוך תוכנת ניתוח GenomeStudio. ניתן למצוא גיליונות מדגם דוגמא באתר האינטרנט של החברה. ברגע שפרויקט GenomeStudio בנוי, ניתן להשיג גנוטיפים מהאשכולות בעוצמה וכתוצאה מכך נוצרים באופן אוטומטי על ידי התוכנה. למרות שאפשרויות תצוגה מרובות קיימות, תצוגת ברירת המחדל, הנור-R (ערך עוצמת מנורמל) לעומת הנור-תטא (יחס עוצמת allelic), היא לעתים קרובות את העלילה הכי הקלה להבדיל שלושה אשכולות נפרדים. רוב SNPs צריך להראות אחד, שניים, או שלושה אשכולות, בהתאם לתדירות אלל הקטין.

שלושה האשכולות מייצגים דגימות הוכחת AA, AB, או אללים BB (ראה איור 7). אשכולות אלה ניתן להקצות גנוטיפים או על ידי יבוא תבנית עמדת קיבוץ באשכולות סטנדרטית ישירות מהחברה, על ידי בחירה "מקבץ את כל SNPs" מסרגל כלי ניתוח של התוכנה, או על ידי לחיצה וגרירה של העיגולים הצבעוניים על מגרשי עוצמתו של אדי ידני לא קורא. הצבע של המדגם על המגרש העצמה (אדום, סגול או כחול) מציין את השיחה (AA, AB, או BB, בהתאמה); שחור מציין שאין שיחה. על ידי דפדוף בSNPs מופיע בחלונית נתונים המלא של התוכנה, באשכולות לכל SNP ניתן לראות או נזכרו. ברגע האשכולות מוקצים שיחות משביעות רצון, חלונית הנתונים המלאה של התוכנה מפרטת את גנוטיפים עבור כל דגימה בודדת בכל SNP מסוים. האפשרות לבחירת העמודות שמעל לטבלה יכולה לעבור פורמטי נתונים.

הנתונים ניתן לייצא או דרך סרגל הכלים של ניתוח או ישירות מטבלת נתונים המלאה לניתוח מעמיק.

איור 1
איור 1. סקירה - Infinium Assay פרוטוקול.683/50683fig1highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. בסיס ומזרן, בתוספת מכסה היב הקאמרי שלמים. [12] לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3 טוען Beadchip -.. לוותר על המדגם ביציאות המפרצון [12] לחצו כאן לצפייה גדולה יותר תמונה.

איור 4
איור 4 הסרת Coverseal Beadchip -.. אחוז בחותם בפינה ולקלף בעדינות באלכסון [12] לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5
איור 5. עצרת Beadchip זרימה דרך שלמה - BeadChip מופרד משקופיות זכוכית עם spacer וקשר עם אבזמים. > לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 6
איור 6. BeadChip סריקה מוצלחת -) BeadChip נסרק עם שני לייזר אדום וירוק; מציג תוכנת סריקה הן בו זמנית. סעיפים שעוברים QC עוצמת ידגישו ירוקים בתצוגת BeadChip לשמאל. סעיפים שלא הצליחו QC עוצמת ידגישו אדומים בתצוגת BeadChip. ב ') לאחר שהסריקה הושלמה, התוכנה כיסוי מציגה האדום וירוק. תמונה מוגדלת ב מוצגת. הצבע והעוצמה של כל חרוז בודד מציין את הווה אלל. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

דק page = "תמיד"> איור 7
איור 7. SNP NORM-R לעומת NORM תטא פרופילי Cluster -) SNP חוקי עם שלושה אשכולות נפרדים המייצגים את AA, AB, וגנוטיפים BB, בצבע אדום, סגולה, כחולה וארוחת בוקר) עריכה דורשת SNP.. האשכול באמצע, שאמורה להיות AB הומוזיגוטים, נותר בלתי נקרא. אשכול BB נקרא בטעות AB. C) SNP ביצועים ירוד. ניתן להשיג לא גנוטיפים מעלילה בעוצמה זו, שכן אין אשכולות שונים קיימים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

יישומי גנוטיפ בקנה מידה גדול שנוצלו כדי להבין את המנגנון הגנטי שבבסיס מחלות רבות אדם טוב יותר. הגילוי של כל גרסה משמעותית באמצעות ניתוח עמותה הגנום יכול דגל אזור מועמד למחקר נוסף. בנוסף, נתוני גנוטיפ הוא כלי טוב לבקרת איכות בפרויקטים לקביעת רצף.

כדי למקסם את תפוקת מדגם, יכולות להיות מוגברות צלחות מדגם מרובות ומאוחסנות במדינות מקוטעות, המושעות שלהם. שמונה צלחות עשויות להיות מוגברות ביום אחד, המשלבות את 24 שעות הראשונות של הפרוטוקול לקבוצות מרובות ומספקים מספיק חומר ל~ 2-8 ימים לעיבוד שבבים. אם צלחות מוגברות במאגרי נשק לפני כן, ואם הדגימות חדשות הם הכלאה לשבבים מייד לאחר הסריקה מתחילה בריצה הקודמת, עיבוד יכול לרוץ ברציפות ללא הצורך להשהות להכנת מדגם נוספת. לכן, למרות שהדגימות ייקחו שלושה ימים לעבור מלאassay, יכול להיות שנוצרו נתונים יומיים. שבבי Assuming24 מעובדים בכל יום, שבוע עבודה של 5 ימים מאפשר ללמעלה מ 1,000 דגימות ה-DNA שיופעל על 12 מדגם שבב חרוז. אם כל צעד או מגיב נכשל, לעומת זאת, קבוצות מרובות עלולות להיות בסיכון לביצועים גרועים לפני שניתן יהיה ליישם בכל תיקון. שגיאות עלולות להימלט הודעה עד למערכים נסרקים או נותחו, ולכן, אם התפוקה מוגדלת, מאות דגימות בשלבים שונים של הפרוטוקול אולי כבר קיבלו את אותו טיפול פגום עם גילוי. כפי שלא ניתן לשחזר חומרים כימיים והנתונים שאבדו, המשתמש חייב לשקול את הסיכונים הללו כנגד הצורך בעבודה מואצת.

תוכנת ניתוח GenomeStudio היא ההזדמנות הראשונה באמת כדי לאמוד את ההצלחה של תהליך גנוטיפ. אם הנור-R לעומת חלקות עוצמת הנור תטא מקובצים כראוי, שיעור השיחה הממוצע (אחוזים מסך SNPs הוקלדו בהצלחה) של הדגימות צריך גישת 99%, למרות שערך זה משתנה SLIghtly בהתאם לסוג מערך. נתונים מכל דגימה עם שיעור שיחה נמוך יותר מאשר 85-90% הוא לא אמינים וצריכים להיות מושלך. למטרות בקרת איכות, יש להשוות את תוצאות לכל גנוטיפים בכל הזדמנות אפשריים ידועים קודם לכן. אין נתונים כאלה, אם קיימים, שכפול מדגם מכוון הוא כלי שימושי באימות מיקומי צלחת או מערך. זוגות כפולים אלה צריכים להיות ממוקמים על שבבים נפרדים, צלחות, קבוצות, או פרויקטים; גנוטיפים שלהם בדקו על דור. אמנם אילוצי QC ספציפיים משתנים בהתאם להעדפתו של החוקר, אילוצי SNP משותפים מבוססים על הצלחה שיחת מדגם, שיווי משקל הארדי-ויינברג, או missingness בין המקרים ובקרות, ואילו אילוצי מדגם נפוצים מתבססים על שיעורי שיחה, חוסר עקביות מנדל, או הפניות מקושרות הטרוזיגוטיות כרומוזום ה-X לנתוני מגדר קליניים [13].

אם מתעוררת בעיה כלשהי, לוח המחוונים הפקדים, שנמצאו בחבילת הניתוח, ניתן להגיש לחברה על מנת לקבוע גורם. בקרות אלה יכולים לעתים קרובות לצמצם את הנושא לצעד הסביר ביותר או הכישלון מגיב. אם כל SNPs של עניין נמצא בניסוי גנוטיפ Infinium, חלקות העצמה שלהם צריכה להיות בGenomeStudio לשגיאות באשכולות לפני מחקר נוסף שנערך בדק כפולות.

ניסוי גנוטיפ Infinium נכשל הוא כנראה עקב שגיאת עיבוד אנושית או DNA קלט באיכות ירודה. כימות מדגם חייבת להיות מדויקות ומדויקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, כל חומרים כימיים הוסיפו לכל מדגם או שבב חייב להימכר בהיקף שנקבע על ידי הפרוטוקול. טפטפות חייבת להיות מכוילת כראוי. ריאגנטים לא צריכים לרוץ אחרי פקיעה ולא צריך להיות refrozen פעם מופשרת, לחסוך למגיב RA1. על מנת למזער טעויות מכתים והארכה אפשריות, תערובת פוראמיד / EDTA צריכה להיות מוכנה טרי בכל חודש. כל -20 ריאגנטים C ° צריכים להיות מאוחסנים במקפיאים ידני להפשיר בלבד. כל מעבדתי בשימוש בstaining, סיומת, ולשטוף את החלקים בפרוטוקול יש לשטוף היטב במים וסבון עדין מייד עם חוסר שימוש. מאגרי humidifying בתא היב צריכים להשתפשף עם מברשת מבחנה וחומר ניקוי עדין. שקופיות הזכוכית יש לשטוף עם אקונומיקה 10%, כפי שהורו על ידי המדריכים למשתמש שלהם, פעם בשבוע.

Disclosures

יש המחברים של מאמר זה אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

Acknowledgements

מימון עבור עבודה זו סופק על ידי NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, ו-NIH R56 AI063274

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumable or Equipment Manufacturer Part Number Minimum Required for 96 Samples
0.8 ml Deep Well Plate Thermo Scientific AB-0765 1
Plate Mats Thermo Scientific AB-0674 2
Reagent Basin Fisher Scientific 13-681-502 9
Heat-seal Sheets Thermo Scientific AB-0559 1
Flow-through Spacer Fisher Scientific NC9563984 6
Pipette tips - 200 μl Rainin GP-L200F 192
Pipette tips - 10 μl Rainin GP-L10F 16
Pipette tips - 1,000 μl Rainin GP-L1000F 16
DNA Suspension Buffer Teknova T0220 0.5 ml
0.1 N NaOH Fisher Scientific AC12419-0010 0.5 ml
Isopropanol (HPLC grade) Fisher Scientific A451 15 ml
Ethanol (200-proof) Sigma-Aldrich 459836 330 ml
Formamide (100%) Thomas Scientific C001K38 15 ml
EDTA (0.5 M) Amresco E177 0.2 ml
10 μl 8-channel Pipette Rainin L8-10XLS 1
200 μl 8-channel Pipette Rainin L8-200XLS 2
1,000 μl Single-channel Pipette Rainin L-1000XLS 1
Microplate Shaker VWR 13500-890 1
Refrigerated Microplate Centrifuge VWR BK369434 1
Hybridization Oven Illumina SE-901-1001 1
Hybex Microsample Incubator SciGene 1057-30-0 1
Hybex MIDI Heat Block Insert Illumina BD-60-601 1
Heat Sealer Thermo Scientific AB-0384 1
Hyb Chamber w/ Insert and Mat Illumina BD-60-402 2
Surgical Scissors Fisher Scientific 13-804-20 1
Flow Through Assembly Parts Illumina WG-10-202 8
Wash Rack and Dish Illumina BD-60-450 1
Genepaint Chamber Rack Tecan 760-800 1
Temperature Probe Illumina A1-99-109 1
Staining Rack and Dish Illumina WG-10-207 1
Self-Closing Tweezers Ted Pella, Inc 5374-NM 1
Vacuum Manifold Ted Pella, Inc 2240 1
iScan or HiScan Illumina - 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47, (2), 164-172 (2001).
  2. Livak, K. J. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction. Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).
  3. Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms. Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).
  4. Bayés, M., Gut, I. G. Overview of Genotyping. Molecular Analysis and Genome Discovery. ed, 2nd, John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-23 (2011).
  5. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa. J. Med. Entomol. 49, (2), 307-315 (2012).
  6. Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. Wiley-Blackwell. 123-132 (2011).
  7. Shen, R., Fan, J. B., et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays. Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573, (1), 70-82 (2005).
  8. Ragoussis, J. Genotyping technologies for all. Drug Discov. Today: Technol. 3, (2), 115-122 (2006).
  9. Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis. Hum. Mol. Genet. (2012).
  10. Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample. Mol. Psychiatry. (2012).
  11. Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma. Nat. Genet. 41, (8), 899-904 (2009).
  12. Inc Illumina. Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. 15-101 (2009).
  13. Turner, S., Armstrong, L. orenL., Yuki Bradford,, et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. 1-19 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics