Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

Elektroporasyon dönüşüm olarak bilinen bir süreç içinde bakteri DNA'nın verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektro-hücrelerinin hazırlanması için geleneksel protokoller zaman alıcı ve emek yoğundur. Bu makalede, bir alternatif, hızlı ve şu anda bazı laboratuarlarda tarafından kullanılan elektro-hücrelerinin hazırlanması için etkili bir yöntem tarif eder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J. Vis. Exp. (80), e50684, doi:10.3791/50684 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektroporasyon hızlı ve verimli bir şekilde geniş bir hücre aralığı içine yabancı DNA'nın verilmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Electrotransformation doğal olarak yeterli değildir prokaryot DNA 'nın verilmesi için tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. Elektroporasyon arıtıldı DNA ve yetkili bakteri ek olarak, ticari olarak temin edilebilen gen puls kontrol ve küvetler gerektiren, hızlı, verimli ve akıcı dönüşüm yöntemidir. Darbe aşamasından aksine, elektro-hücre hazırlama orta-logaritmik fazı büyümüştür tekrar steril, soğuk su hacimleri azaltmada santrifüjleme ve yıkama mermi ya da kültürlerin büyük hacimlerde iyonik olmayan tamponlar içeren yoğun zaman alıcı ve emek büyüme. Zaman ve çaba ticari kaynaklardan elektrokompenant hücreleri satın alarak kaydedilebilir, ancak seçim sık E. istihdam sınırlıdır coli laboratuar suşları. Biz burada hızlı bir yaygınlaştırılması ve vardırelektrobileşen E. hazırlanması için etkili bir yöntem bir süre için bakteriyoloji laboratuarlar tarafından kullanımda, V uyarlanabilir edilmiştir coli, cholerae ve prokaryotlar. Biz orijinal tekniğini geliştirmek için krediye kime tespit edemesek, biz burada bilimsel topluluk için kullanılabilir yapıyoruz.

Introduction

1980'lerin başında 1 yılında 'kuruluşundan bu yana, elektroporasyon ayrılmaz bir moleküler biyoloji tekniği, dairesel veya doğrusal nükleik asitler ile / transfect canlı hücreleri dönüştürmek için kullanılan muhtemelen tek ve en yaygın yöntem haline gelmiştir. Başlangıçta 1 ökaryotik hücrelerin transfeksiyonu için geliştirilmiş, elektroporasyon, daha sonra E. transformasyonu için uyarlanmıştır coli 2, 3. Bakteriyoloji olarak, elektroporasyon laboratuar standart haline gelmiştir ve Gram-negatif Pseudomonas 4, Salmonella 5, 6 Vibrios, Serratiae ve Shigellae 7 dahil olmak üzere, bakterilerin geniş bir yelpazede dönüştürmek için tadil edilmiş olan, Gram-pozitif Clostridia 8, Bacilli 9, 10 Lactobacilli Enterokok 11. Hatta bazı Archaebacteria Methanococci de dahil olmak üzere, elektroporasyon suretiyle transformasyona müsait olduğu kanıtlanmıştır 12 ve Sulfolobus türler 13. Kapsamlı bir inceleme için Aune ve Aachmann 14 bakınız. Elektroporasyon ile dönüşümün verimliliği kimyasal yeterlilik veya ısı şoku 2 söylendiğine göre 10-20 kat daha yüksektir. Ancak, çok 1980'lerde 15 Douglas Hanahan tarafından optimize gibi kimyasal yetkinlik için bakterilerin hazırlık gibi, hücreler de elektrouyumlu için hazır olmalıdır.

Elektroporasyon, elektrik bakteri, saflaştırılmış DNA, elektrik uyarısı veren bir puls kontrol modülü ve bir elektrot olarak işlev küçük tek küvetler barındıran bir bölmeyi gerektiren, bakteriyel bir dönüşüm, hızlı ve etkili bir araçtır. Kısaca, soğuk, yetkili bakteriler 30-45 dakika boyunca 30-37 ° C'de inkübe büyüme ortamı içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş, bir küvet içinde, bir yüksek voltaj darbesine maruz plazmid DNA, ile karıştırılır ve daha sonra yan katı ortam (besleyici agar üzerine plakalanır appr ile plakalar)seçici antibiyotik opriate.

Darbe aşamada, elektrokompetent E. hazırlanmasında aksine coli geleneksel olarak büyük miktarlarda gerçekleştirilir çok parçalı bir işlemdir kalır. Kısaca, bakteri, bir gece boyunca kültür büyüme orta-logaritmik fazı (<1.0 OD 600) için yetiştirilir ve bir steril olmayan ile seri yıkama işlemine tabi 1 L Luria Broth (LB) için, 100 ml bir Erlenmeyer şişesi içine aşılanır İyonik 4 ° C'de hacimleri azaltılmasında tampon ya da çift damıtılmış su (GKD 2 O) Büyük bir özenle tüm prosedür boyunca soğuk hücreleri tutmak ve kirlenmeyi önlemek için gerekli önlemler alınmalıdır. Bu otoklava santrifüj kova ve non-iyonik ya da tampon GKD 2 O kullanımını, bir orbital kuluçka çalkalayıcı, büyük hacimli, yüksek hızlı soğutmalı santrifüj ve rotor bir dizi gerektirir. Bakteriler son olarak% 10 gliserol ile takviye edilmiş tampon küçük bir hacmi içinde yeniden süspansiyona alınmış ve 40 ul hacimler ~, WH içerisine bölünürich kullanılana kadar -80 ° C'de saklanır. Düşük sıcaklıkta saklama nedeniyle genellikle zaman içinde canlılığı kaybı düşmüştür dönüşüm verimi ile sonuçlanır.

Elektro-bakteri hücreleri ticari kaynaklardan çeşitli ancak (genellikle rekombinasyon eksikliği) E: sınırlı sayıda mevcuttur ana plazmidler, geniş bir yelpazede yaymak için yaygın olarak kullanılan E. coli suşu. Sonuç olarak araştırmacılar, dönüşüm için kendi soylar / mutantlar hazırlamak için in-house yöntemlere bağlıdır.

Elektrokompetan E. hazırlanması için bir alternatif, hızlı ve etkin bir protokol coli süredir birkaç moleküler bakteriyoloji laboratuarları tarafından kullanılmakta olan ve bizim durumumuzda V., ek Gram-negatif bakterilere uzatıldı cholerae. Zamanla diğer araştırmacılar tarafından optimize edilmiş gibi protokolünün yaratıcısı tespit edilemez. Burada sunulan yöntem eden LABORATOR kullanılmıştıryaklaşık iki yıldır ler, ve bizim akranları ile bu yararlı bir protokol paylaşmak hedefimizdir.

Protocol

1.. Bakteriyel Kültürler, Araçlar ve Reaktifler hazırlanması (GÜN 1, Afternoon)

  1. Öğleden sonra, 1-5 ml steril LB et suyu otoklava bakteri (E. coli ya da V. cholerae) küçük bir kısım ile (örneğin, 100 x 13 mm) borosilikat cam test tüpleri inoküle.
  2. , 37 ° C sıcaklıkta (sıcak oda ya da inkübatör) bürosunun bir silindir tambur içinde aşılanmış deney tüpleri Set yüksek hızda silindir tambur açmak, ve O / N kuluçkaya
  3. Cam yumuşatır kadar bir Bunsen brülörün alev çubuğun orta ısıtılması ile bir cam çubuk bir "hokey sopası" şeklinde bir hücre yayıcı hazırlamak ve daha sonra bir 135 ° 'lik açı içine cımbız veya pense ile hafifçe viraj doğrudan . Bir kez daha ucu ile birinci kavisin arasında orta noktasında ısıtılır ve çubuk (birinci dirseğinin ters yönde) bir içeriye doğru 45 ° 'lik açıyla eğmek.
  4. Antibiyotikler olmadan LB-agar hazırlayın ve hazırlanmasında Petri kutularına dökün4 ° C 'de, uygun (elektropore edilecek olan vektör üzerindeki direnç belirteci göre) antibiyotik ve mağaza içeren electrocompetence protokolü ve LB-agar plakaları
  5. 2 mM CaCl V boyunca 2 çözeltisi steril bir filtre hazırlanması E için cholerae, veya otoklav GKD 2 O 4 ° C'de coli ve depolamak

2. Elektrokompetan Bakterilerin Büyüme (2. GÜN, Sabah)

  1. Her bir LB agar plakası üzerine O / N bakteri kültürü 100 ul sunun, donmuş gliserol stokları da kullanılan ve doğrudan plaka üzerine teslim edilebilir.
  2. % 100 EtOH hokey sopası biçimindeki hücre serpme batırın, kısaca drenaj ve kullanmadan önce ve yaymak sterilize etmek kalan EtOH'nin yakmak. Steril cam hücre yayıcı (mola) agar yüzeyi bozmaya emin yapma ile eşit 100 ul O / N bakteri kültürü yayıldı.
  3. Bakteri büyüme ince çim olmak kadar 4-6 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin veyaayırt geliyor. Aktif büyüyen zaman Hücreler en yetkin.

3. Elektrokompetan Bakteriyel Hücrelerinin Hazırlanması (2. GÜN, Öğleden Sonra)

  1. Agar yüzeyini delmek ya da kırmak için emin değil yapım steril bir aşılama döngü ile bakterileri hasat. Bir 2 mm çaplı bakteri kitle, tek bir dönüşüm için yeterli olacaktır. Genellikle, bu aşılama döngü iki veya üç kez olan ince çim yüzeyi kazıma gerektirir. (Tipik olarak 4-6 arasında) çeşitli örnekleri, aynı plakadan toplanabilir.
  2. 1 ml buz soğukluğunda 2 mM CaCl2 (V. cholerae için) ya da steril GKD 2 O (E. coli) 'de bakteriyel kütle tekrar ve herhangi bir kümeleri görebilir kadar karıştırın, buz üzerinde tutun.
  3. Santrifüj 4 ° C ya da 4 ° C'ye ayarlanmış bir soğuk bir odada depolanır bir mikrosantrifüj içinde ayarlanmış bir soğuk mikrosantrfuj 5,000 xg'de 5 dakika boyunca her bir bakteri süspansiyonu
  4. Süpernatan, resusp atınbuz soğukluğunda 2 mM CaCl2 ya da steril GKD 2 O, aynı hacimdeki bakteri pelet sonunda ve üç kez olmak üzere toplam iki kez daha önce yapılan gibi santrifüj adımı tekrarlayın.
  5. Süpernatant, tekrar süspansiyon kaldırmak ve daha sonra 40 ul buz soğuk iyice 2 mM CaCl 2 veya steril GKD 2 O bakteriyel pelet gevşetin ve buz üzerinde tutmak.

4. Elektrokompetan Bakterilerin Dönüşüm (2. GÜN, Öğleden Sonra)

  1. 40 ul bakteri süspansiyonuna plasmid DNA (1 kadar ul su veya Tris-EDTA tampon maddesi içinde) ve 1 ug kadar ekleyin ve önceden soğutulmuş, steril 0.2 cm boşluk küvet, bu karışımı aktarın. DNA örneğinde tuz konsantrasyonu, bir sonraki aşamada darbenin kavisine katkı gibi, bir düşük olması gerekir.
  2. Darbe kontrol modülünün elektroporasyon odası ve küvet yerleştirin ve 1.8 kV, 25 | iF de elektroporasyona. Zaman sabiti ~ 5.0 msn olmalı ve hiçbir ark gerçekleşmelidir.
  3. Hızla 1 ml LB suyu içine yeniden süspanse edilmesi suretiyle hücre süspansiyonu geri kazanmak ve daha önce otoklavlanmıştır borosilikat cam test tüpü içine aktarın.
  4. Hücreler antibiyotik seçim olmadan, 30 dakika boyunca 37 ° C 'de (bir silindir tambur içinde) havalandırılmış bir büyüme koşulları altında inkübe edilmesi ile geri izin verin.
  5. Uygun seçici madde (antibiyotik) varlığında daha önce hazırlanmış LB agar plakaları üzerine bakteri Plate ve 37 ° CO / N. inkübe Bakteriler arıtıldı vektörü (0.1-1 ug süper sarılmış plazma) yüksek bir konsantrasyon ile değiştirilmesi halinde, LB agar levhasının kenarına ve kadran çizgi yöntemi kullanılarak izole edilmiş koloniler için steril bir aşılama döngü çizgi ile bakteri kültürü 10 ul sağlar. Ligasyon karışımı, bir dönüştürülmüş ise, her bir agar plakası üzerine bakteri kültürü 100 ul teslim ve eşit olarak steril cam hücre yayıcı ile yayıldı.

bir zaman sabiti (olmak kısaysadüşük 3.5 msn) ya da darbe sonra, DNA örneği yeniden çökeltilmesi kurutmadan önce tuzları çıkarmak için iki kez% 70 EtOH ile yıkanır ve TE tamponu içinde yeniden süspanse, ark oluşumuna sebebiyet verir.

Representative Results

Biz E. ile dönüşümler bir dizi yürütülen coli ve V. cholerae ilk elektro bakteri hazırlanması için, Dower ve ark. 2 tarafından tarif edilen (geleneksel) yönteminin bir uyarlanması ile hızlı bir yöntemin dönüşüm verimliliğini karşılaştırmak için. Yetkin hücrelerin hazırlanmasını geleneksel gerçekleştirmek için, bir 2 L Erlenmeyer şişesi içinde-500 ml LB E: 500 ul gecelik kültürü ile aşılanmıştır E. coli DH5a ya da V. orbital bir karıştırıcı (37 ° C'de 215 rpm) inkübe edilir ve 0.5-1.0 arasındaki OD 600 hasat cholerae O395. Şişe, buz üzerinde soğutuldu ve kültürler, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 4000 x g'de, önceden soğutulmuş bir rotor içinde santrifüjlendi Hücre topakları tamamen V için 500 ml buz soğukluğunda 2 mM CaCI2 içinde yeniden süspanse edildi E için cholerae ve GKD 2 O coli ve tekrar santrifüje tabi aynı şartlar altında. Resüspansiyon An sonraki rauntd santrifüj emin kültür 4 ° C'de soğutulmuş kalmıştır yapma 200 hacimleri ve 100 ml hacim azalması içinde gerçekleştirilmiştir Son olarak, bir 10 ml hacminde bir yeniden süspansiyon ve santrifüjleme,% 10 gliserol ile gerçekleştirilmiştir. Nihai pelet, 2 ml% 10 gliserol içinde yeniden süspanse edildi ve 40 | il tam bölünen miktarları, -80 ° C'de donduruldu ve daha önceki elektroporasyon için bir haftadan daha uzun depolanmıştır.

Darbe ayarları ve küvet boyutu da dahil olmak üzere Elektroporasyon koşulları ne olursa olsun, yetkin hücre hazırlama yöntemi tüm electroporations hem de bakteri türleri için aynıdır. Tek fark, biz soğuk GKD yılında E. 2 O yıkar yürütülen oldu coli ve V için soğuk 2 mM CaCl2 cholerae. Tablo 1 aynı şekilde, ancak hızlı protokolü ile ya da geleneksel yöntemle ya da kompetan hale elektroporasyon ile transforme edilmiş bakterilerin neden olur. Biz ortak olarak zorlanma O395 ve DH5a istihdamV. ly kullanılan temsili suşları cholerae ve E. sırasıyla coli, benzer sonuçlar (her bir soy test edilmiştir olmasa da) aynı türün başka türlerden elde edilen ve büyük olasılıkla muhtemelen dışındaki diğer Gram-negatif bakteri ve uyarlanabilir.

Eşit hücre sayıları darbeli her parti mevcut olduğunu sağlamak için, hızlı bir yöntem kullanılarak oluşturulan elektro-bakteriler, toplanarak bir araya getirilmiş karıştırıldı, homojen olarak süspansiyon haline tutulur, ve kısa bir süre önce, elektroporasyon için 40 ul hacim içinde alikotlandı. Geleneksel yöntem kullanılarak üretilen elektro bakteri benzer önce 40 ul hacimde donma tedavi edildi. Nabız teslimattan sonra, 40 ul elektroporasyona bakteri her parti 400 | il LB içine süspanse edildi ve seri olarak 1:10 seyreltilmiştir. Her bir seyreltme yüz mikrolitre 100 ug / ml ampisilin mevcudiyetinde LB agar üzerine kaplanmıştır ve steril bir cam hücre dağıtıcısı kullanılarak yayıldıve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. Her bir dönüşüm kullanılan bakteri sayısını ölçmek için, her hazırlanan toplu elektro bakterilerin 40 ul hacimler seri olarak seyreltilmiş, ve aynı şekilde paralel olarak, antibiyotikler olmadan LB agar üzerine kaplanmıştır. Her partiden eşit muamele bakterilerin bir alikosu DNA'sız 1 ul Tris-EDTA (TE) tampon ancak (mock dönüşüm), seri olarak teslim tarafından kayıp hücre sayısını tahmin etmek için, antibiyotikler olmaksızın seyreltildi ve LB agar üzerine kaplanmıştır ile elektroporasyona tabi tutulmuştur elektrik nabız. Son olarak, deney için ek bir varyasyon elektroporasyon ancak LB-agar üzerine plakalanmadan önce dönüştürülmüş hücrelerin kurtarma etkileyecek sonra 1 ml LB içinde 37 ° C'de 30 dakika inkubasyon olmadığını belirlemek için yürütülmüştür. Koloni oluşturan birim (CFU) bir sonraki gün numaralanmıştır.

Bu deneme için biz pUC18, bilinen bir laboratuvar plazmid kullanılabilir, ve yetkili bir bakteri toplu oluşanpproximately hücreleri için 10 8 CFU geleneksel yöntem ve hızlı bir protokol kullanılarak hazırlanır hücreleri için 10 7 CFU kullanılarak hazırlanır. (DNA'sız) tek başına Elektroporasyon ne olursa olsun, elektrik hücrelerini hazırlamak için kullanılan yöntem kat 10-100 ile uygun CFU azalır. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, transformant verim E için üç suret deney (parantez içinde standart sapma) olarak DNA aralığın 10 6 -10 7 CFU / ug içinde oldu E. coli (DH5a) ve V. cholerae (O395) sırasıyla, elektro-hücre hazırlanması için olan geleneksel yöntem kullanılarak lengthier. Transformant verim E. üç suret deneylerin (parantez içinde standart sapma) DNA'nın 10 5 -10 6 CFU / ug düşmüştür 10 kat çıktı coli ve V. hızlı bir yöntem ile, sırasıyla cholerae. Bu nedenle biz dönüştürülmüş CFU bölünerek dönüştürülmüş bakteri yüzdesi belirlendiCFU sayısı, hücre içerisine özdeş toplu işletmeye (plazmid) olmadan "sahte dönüşümler" ile geri kazanılır. Dönüştürülmüş bakterilerin yüzdesi ne olursa olsun, hazırlanması ve (Tablo 1 parantez sayılar) transforme edilmiş türler yönteminin bir log (2,5-9,4%) içinde oldu. Bu sonuçlar, bu hızlı yöntemin verimliliği yetkili hücrelerin hazırlanması ve Vibrio cholerae ve Escherichia coli suşları temsil hızlı prosedüre eşit müsait olduğu geleneksel lengthier prosedürü ile karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir.

Biz, β-laktamaz kasetleri barındıran pUC18 gibi plasmidler için, LB et suyu içinde 30 dakika geri kazanım süresi etkilenmez, yani transformasyon etkinliğini bulundu. Transformantların aynı sayıda doğrudan elektroporasyon sonra veya bir 30-45 dakika iyileşme süresi bırakıldı olup hücreler ampisilin mevcudiyetinde LB agar kaplama olup olmadığını geri kazanıldıkaplama öncesi 37 ° C'de LB ortamı içinde mevcuttur. Ampisiline dirençli seçici olmayan koşullar altında büyümesinin gerektirmez Bulgularımız, β-laktamaz sentezleme dönüşümü üzerine yeterince hızlı cereyan ettiğini ortaya çıkarmaktadır. Ancak biz, elektrik şoku kurtarma katkıda ve gen ekspresyonunu başlatmak olabilir LB et suyu, pulsed bakteri seri dilüsyonları gerçekleştirilir unutulmamalıdır.

Şekil 1
Şekil 1. Elektro bakterilerin hızlı hazırlanması için metodoloji grafik tasviridir. 4-6 saat sonra (inokulum yoğunluğuna bağlı olarak) bakteri yeterli sayıda tek bir LB agar plakasından 4-6 dönüşümleri gerçekleştirmek için toplanabilir. Elektroporasyona tabi olan her nihai hacim için yetkin hücrelerin eşit sayısı sağlamak için, LB agar plakasından toplanan bakteriler, başlangıçta al daha sonra bir araya toplanmış ve yıkanmıştırpelet boyutuna bağlı olarak, 40 ul hacminde iquoted (büyük topaklar 40 ul ile bölünebilir büyük hacimli içinde seyreltilmiştir).

Ampisiline karşı dirençli başkalaşımlar / ug DNA sayısı (Ampisiline karşı dirençli başkalaşımlar, geri kazanılmış [%])
Gerginlik Geleneksel yöntem Hızlı bir yöntem
E. coli (DH5a) 2.3 x 10 6 (5 10 x 7.3 ±) [% 9.4] 3 x 10 6 (5 10 x 7.1 ±) [% 2.5]
V. cholerae (O395) 4 x 10 7 (7 ila 10 x 1.7 ±) [% 5] 6.7 x 10 5 (5 ila 10 x 2.1 ±) [% 3.3]

Tablo 1. Elektro-b DNA (pUC18) arasında mikrogram başına dönüşümü verimliliğiAncak bakteriler hızlı bir yönteme göre, geleneksel bir metotla hazırlandı.

Tüm dönüşümler (% 1 agaroz jel elektroforezi ile görselleştirildiği gibi ~% 80 süper sarılmış DNA) 500 ng DNA pUC18 ile gerçekleştirildi ve Elektroporasyona tabi tutulan hücreler seri antibiyotik ile LB-agar üzerinde CFU için plakalanmadan önce LB et suyu içinde 10-kat seyreltilmiştir. Non-Electroporated bakteri ve plazmid olmadan elektroporasyona bakterilerin kontrol eder, seri olarak seyreltildi ve antibiyotikler olmadan LB agar üzerine kaplanmıştır önce ve doldurulmasından sonra, canlı bakteri sayısını belirlemek için dönüşümlerin her set için gerçekleştirilmiştir. Elektroporasyona kontroller başarılı bir şekilde transforme edilmiş canlı bakteri yüzdesi için taban hattı temsil etmektedir.

Discussion

Dönüştürme verimliliği bağımsız olarak yetkili hücrelerin hazırlanması için kullanılan yöntemin çeşitli faktörlere bağlıdır. Benzer değişkenler bu yöntem uygulanır; itina gerektiğini hücreler sabit soğuk sıcaklıkta (yüksek olmayan ° 4 den C) muhafaza edildiği şekilde agar plaka hasat kez. Bakteriyel çim aktif toplama zamanında büyüyen olmalıdır, hücre büyüme orta-logaritmik fazı içinde olması gerekir. DNA (örneğin tuzların kontaminasyon) Kalitesi transformasyon etkinliğini etkiler. Bu yöntem kullanıldığında özellikle, agar agar küvet içinde fragmanları, darbenin kıvılcım atlamasına neden olacak gibi kırık olmamalıdır.

Bu teknik ile karşılaşılan sorunların çoğu iki konu ile ilişkili, onlar aktif büyüyen zaman agar plaka zaman uygun penceresi sırasında bakteri toplama. Çok yakında onları toplayarak yetersiz hücre sayıları verecektir ve verecekoluşturdukları "Pellicule" plaka yüzeyini kaldırarak zor olduğu için sinir bozucu bir LB agar plaka kazıma. Toplama bakteriler çok geç ölçüde kendi yetkinlik azalacaktır. Zaman penceresi doğal olarak LB agar plakaları üzerine kaplanmıştır inokulum yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir. İkinci kritik adım bunlar transformasyonu takip eden LB agar üzerine plakalanır dek agar plaka kaldırdı ve CaCI2 ya da GKD 2 O içinde tekrar süspanse edilir andan itibaren (4 ° C) soğuk bakterileri tutmaktır. Bakterileri, küvetler ve tampon içeren mikrofüj tüpleri önceden soğutulmuş olması ve bakteriler kaplama kadar her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Steril GKD 2 O veya CaCl2 çökelti içeren veya kontamine Ancak, ek sorunlar ortaya çıkabilir. Bu nedenle biz bu reaktif taze hazırlamak öneririz.

Sorun dönüşüm ba dönüştürürken kontrolleri de dahil olmak üzere tarafından kolaylaştırılırcteria herhangi bir yöntem ile kompetan hale. Seçici işaretleyici içeren bir LB agar plakası üzerine kaplanmıştır dönüştürülmemiş yetkili bir bakteri toplu oluşan bir negatif kontrol hızlı bir şekilde plaka üzerine antibiyotik etkili olup olmadığının belirlenmesine yardımcı olur. Deneysel örnek olarak aynı seçici markerini barındıran iyi kalite ve miktar bilinen bir plasmid preparasyonu ile bir pozitif kontrol, bir dönüşüm bakteriler yetkili değil, aynı zamanda dönüştürülmüş deneysel DNA miktar ya da kalitede yeterli olup olmadığını belirlemede yararlı olacaktır.

Bu tekniğin avantajları çok yönlüdür, bu yöntem, bir dönüşüm için planlanan aynı gün içinde gerçekleştirilebilir. Biz (gece kültürden önce güne başlamak için unutmak sonra) "acil" durumlarda bu yapmış; Biz dondurulmuş bakteri gliserol stok electrocompetence herhangi bir kayıp olmadan LB agar doğrudan kaplama olabilir bulduk. Biz e sınamak olamazdı daçok fazla türe herhangi bir E., bilinen E. coli ya da V. elektroporasyon ile transforme edilebilir kolera suşu elinde bu protokole mükellef olmuştur. Bu teknik, hızlı etkili olan ve geleneksel yöntemler kullanılarak, elektrik bakteri hazırlanması elde edilen değerler ile karşılaştırılabilir verimler dönüşüm verimliliği. Yöntem, yüksek hızlı santrifüj ve ilgili rotor, bir orbital kuluçka çalkalayıcı ve steril bir santrifüj kova (konteyner) ve otoklavlanmış tampon büyük miktarlar için gereksinimi ortadan kaldırır. Belirli Reaktifler ve Ekipmanları Tablo oldukça kapsamlı olmasına rağmen, elektroporasyon yürütmek en laboratuvarları zaten mevcut bu malzemelerin, çoğu var, hepsi değilse de olacaktır. Belki de en önemlisi, bu teknik hali hazırda, hızla mutant geçmişleri olan, elektrik laboratuar özgü soyları üretmek için uygulanabilir. Bu elektrot hazırlanması geleneksel yöntem yerini aldı gibi bu tekniğin herhangi bir sınırlama habersizlaboratuarımızda bakteri trocompetent.

Burada gösterilen deneylerin sonuçları, 1 haftadan daha uzun bir süre -80 ° C'de saklanmış olan geleneksel yöntemle üretilen yeni elektro-güçlü hücreler ile yapıldı. Ancak, donmuş elektrokompetent hücre stokları depolama uzun süreler boyunca yetkinlik ve veya canlılığını kaybeder. Bizim kısaltılmış protokolü aynı gün azaldı transformant dönüşüm verimi ile sonuçlanabilir stokunun yaş ile ilgili endişeleri olmaksızın planlanan taze elektro-güçlü hücreler hazırlanmasına olanak sağlamaktadır. Biz bu gerekli olmamıştır gibi başka bir gün kullanmak için hızlı bir yöntem kullanılarak üretilen elektrokompenant hücreleri saklamak teşebbüs değil.

Burada gösterilmemiş olsa da, elektro-hücre etkinliği eden hızlı bir yöntem ligasyon karışımları için yeterlidir kullanılarak hazırlandı. Non-O1 V için rapor dönüşümler Unterweger ve arkadaşları tarafından bir son makalesinde cholerae.17 (konjugasyon tarafından gerçekleştirilen olanlar hariç) burada tarif edilen yöntem yolu ile hazırlandı, elektrik bakteri kullanılarak gerçekleştirildi. Bu teknik, büyük hücre toplu hazırlamak zorunda kalmadan hızlı ve etkili bir şekilde arka plan ile mutant suşları dönüştürmek için araştırmacılar elde edilir. Elektro-bakteri yöntemin bu hızlı hazırlanması hazırlama prensip olarak elektroporasyon için uygun olduğu gösterilmiştir ve elektroporasyon ayar geleneksel protokoller ile aynı olacak şekilde uyarlanmıştır, diğer prokaryotlar olabilir.

Disclosures

Hiçbir açıklamalar geçerlidir.

Acknowledgments

Yazarlar kendi meslektaşlarına ve bu tekniğin gelişmesini destekleyen şimdiki ve geçmiş laboratuvarların personeline müteşekkiriz. SP'den laboratuvar için Kanada Enstitüsü tarafından desteklenen Sağlık Araştırma İşletim Hibe MOP-84473 ve (Medical Research Endowment Fund için Alberta Heritage Vakfı tarafından finanse edilen) Alberta yeniliklerin-Sağlık Çözümleri. DP en MD001091-01 ve GM068855-02 hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gene Pulser Module Bio-Rad 165-2668
Gene Pulser Cuvette Chamber Bio-Rad 165-2669
Electrocuvettes (0.2 cm gap) Bio-Rad 165-2082
13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes Corning 70820-13
13 mm Culture Tube Closures Cole Parmer EW-04500-00
6 x 250 mm Glass Rod Lab Source 11381D
Disposable Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-12
Roller Drum Motor Assembly New Brunswick Scientific M1053-4004
Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes New Brunswick Scientific M1053-0306
Calcium chloride Sigma Chemicals C5670
Ethanol, anhydrous/denatured Sigma Chemicals 227649
Inoculating Loop Decon Labs MP182-5
Refrigerated Microcentrifuge 5451 R Eppendorf 22621425
Bunsen Burner Fisher Scientific 03-917Q
LB Broth MILLER EMD 1.10285.0500
Bacteriological Agar Fisher Scientific S25127

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, (7), 841-845 (1982).
  2. Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16, (13), 6127-6145 (1988).
  3. Taketo, A. DNA transfection of Escherichia coli by electroporation. Biochim. Biophys. Acta. 949, (3), 318-324 (1988).
  4. Fiedler, S., Wirth, R. Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation. Anal. Biochem. 170, (1), 38-44 (1988).
  5. O'Callaghan, D., Charbit, A. High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation. Mol. Gen. Genet. 223, (1), 156-158 (1990).
  6. Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation. Microbiol. Immunol. 34, (8), 703-708 (1990).
  7. Grones, J., Turna, J. Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, (3), 942-947 (1995).
  8. Allen, S. P., Blaschek, H. P. Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).
  9. Belliveau, B. H., Trevors, J. T. Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).
  10. Chassy, B. M., Flickinger, J. L. Transformation of Lactobacillus casei by electroporation. FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).
  11. Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57, (4), 1194-1201 (1991).
  12. Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae. J. Bacteriol. 173, (11), 3414-3418 (1991).
  13. Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, (16), 7645-7649 (1992).
  14. Aune, T. E., Aachmann, F. L. Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, (5), 1301-1313 (2010).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).
  16. Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages. PLoS One. 7, (10), e48320 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics