A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

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Summary

As tirosina quinases receptoras são ectopicamente expressa em muitos cancros e foram identificadas como alvos terapêuticos em leucemia aguda. Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina cinase para o tratamento de leucemia aguda.

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Christoph, S., Lee-Sherick, A. B., Sather, S., DeRyckere, D., Graham, D. K. Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia. J. Vis. Exp. (79), e50720, doi:10.3791/50720 (2013).

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Abstract

As tirosina quinases receptoras tem sido implicado no desenvolvimento e progressão de muitos cancros, incluindo tanto a leucemia e tumores sólidos, e são alvos terapêuticos druggable atraentes. Aqui, descrevemos uma estratégia de quatro etapas eficiente para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina quinase (nilotinibe e dasatinibe) no tratamento de leucemia aguda. Inicialmente, a análise de transferência de Western é usado para confirmar a inibição alvo em células de leucemia em cultura. A actividade funcional é então avaliada utilizando ensaios clonogénicos em metilcelulose ou culturas de agar mole. Os compostos experimentais que demonstram a actividade em ensaios de cultura de células são avaliados in vivo utilizando NOD-SCID-gama (NSG) ratinhos transplantados ortotopicamente com linhas de células de leucemia humana. Estudos in vivo farmacodinâmicos iniciais avaliar a inibição alvo em blastos de leucemia isoladas a partir da medula óssea. Esta abordagem é utilizada para determinar a dose e esquema de administração requerida para inibição alvo eficazião. Estudos subsequentes avaliar a eficácia do TKI in vivo utilizando células de leucemia que expressam a luciferase, permitindo assim a monitorização bioluminescente não-invasivo de carga da leucemia e de avaliação da resposta terapêutica usando um sistema in vivo de imagem de bioluminescência. Esta estratégia tem sido útil para a avaliação de inibidores da tirosina quinase, in vitro e in vivo, e pode ser aplicado para a identificação de agentes molecularmente-alvo com potencial terapêutico, ou para comparação directa e prioridades de vários compostos.

Introduction

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia maligna mais comum em crianças 1,2. A taxa de sobrevida global para pediátrico ALL linhagem B (B-ALL) é de aproximadamente 85%, mas subtipos biológicos específicos, incluindo T-linhagem ALL (T-ALL), têm prognóstico ainda mais pobre, mesmo com protocolos terapêuticos atuais. A continuação do tratamento de recaída ALL continua sendo um desafio 3. Embora a maioria dos pacientes adultos com leucemia aguda alcançar uma remissão com antecipado quimioterapia, muitos doentes ainda sofrem de recaídas 4. Regimes de quimioterapia correntes no tratamento de leucemia aguda são conhecidos por causar efeitos colaterais de curto e de longo prazo associada a toxicidade. Portanto, terapias menos tóxicas que visam especificamente as células cancerosas com efeito mínimo sobre os tecidos normais são bastante necessárias. Nos últimos anos, a ênfase foi colocada no desenvolvimento do romance, os agentes molecularmente-alvo com especificidade para as células cancerosas, muitas vezes utilizando química iterativopara gerar vários compostos ativos que devem então ser comparados e priorizados 5. Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina quinase para o tratamento da leucemia aguda, o que pode ser utilizado para a avaliação de um único composto ou por comparação directa dos vários compostos, a fim de facilitar o desenvolvimento de drogas.

O método aqui apresentado consiste em quatro etapas. Primeiro o bioquímico (1) e anti-leucemia (2) actividade do composto (s) são avaliados numa cultura de células, em seguida a inibição do alvo é confirmado em modelos animais (3), e, finalmente, a eficácia terapêutica dos inibidores da tirosina quinase (s) é determinada em modelos de xenotransplante de leucemia ortotópicos (4). Para estes estudos, é importante a escolha de linhas celulares relevantes, que são representantes dos subtipos biológicos mais comuns. As linhas celulares devem ser selecionados, o que ambos, expressar o alvo de interesse e falta o alvo de interesse, para investigar se os efeitos biológicos são mediated por inibição do alvo. Isto é particularmente relevante para o desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas, as quais têm efeitos fora do alvo, que podem ser importantes para a actividade anti-tumoral. Também é necessário escolher uma linha de células que é dependente do alvo para efeitos funcionais, tais como a proliferação ou sobrevivência. Estudos de validação alvo preliminares (fora do âmbito deste artigo) com RNA de interferência ou de outros meios específicos para inibir o alvo pode ser usado para identificar linhas celulares dependentes de alvo. Também é desejável escolher linhagens de células que podem formar xenoenxertos de murino, de tal modo que os resultados da cultura de células pode ser mais directamente traduzidos para experiências in vivo.

Para a avaliação da actividade bioquímica mediada por inibidores da tirosina quinase em células de leucemia, uma diminuição na fosforilação do receptor pode ser usado como um indicador de inibição alvo. Análise de ELISA ou Western blot ensaios podem ser empregues, dependendo da disponibilidade e da especificidade dos anticorpos.Se os anticorpos com uma especificidade suficiente para o alvo estão disponíveis, testes de ELISA são preferíveis uma vez que são mais quantitativa e eficiente. Nos casos em que os anticorpos com uma especificidade suficiente para o ELISA não estejam disponíveis, a análise de mancha de Western podem ser necessárias. Neste caso, a imunoprecipitação de uma grande quantidade de lisado pode ser útil para a detecção de alvos que se encontram em baixa abundância. Esta abordagem é particularmente relevante para a medição de proteínas de fosfo, que podem ter uma meia-vida curta para permitir mudanças rápidas na sinalização em resposta a estímulos ambientais. Algumas proteínas fosforiladas são extremamente lábil, provavelmente como resultado da formação de complexos com fosfatases. Para a detecção robusta e consistente destes proteínas fosforiladas, pode também ser possível tratar células com pervanadato, uma proteína-tirosina-fosfatase inibidor irreversível 6, para estabilizar a proteína fosfo antes para a preparação de lisados ​​de células inteiras.

Paradeterminar se a actividade bioquímica resulta em efeitos anti-tumorais, os processos biológicos dependentes de alvo pode ser monitorizada em ensaios baseados em células. Para as linhas celulares de leucemia, a actividade anti-leucemia mediada por inibidores da tirosina quinase pode ser avaliada através de ensaios de formação de colónias em metilcelulose realizados em agar mole ou 7. Ágar mole podem ser preferidos como este é um meio sólido, que é mais fácil de manipulação, se o tratamento repetido com um TKI é necessário. Enquanto muitos leucemia myloid (AML) linhas de células agudas irá formar colónias em ágar mole, a maioria das linhas de células ALL apenas irá formar colónias em metilcelulose, que é um meio semi-sólido. Embora seja possível para refrescar médio e / ou inibidores da tirosina quinase, em culturas de metilcelulose, apenas pequenos volumes pode ser utilizado e com frequência limitado. Do mesmo modo, é mais difícil para corar colónias sem interromper los em metilcelulose. Estudos preliminares que define a capacidade de linhas de células adequadas para formar colónias em metilcelulose e / ou de agar mole e tele densidade ideal de células em cultura de tal forma que as colônias não são sobrepostos e em número suficiente para obter estatisticamente (geralmente 50-200 colônias por 35 milímetros placa) dados relevantes.

Enquanto ensaios in vitro são robustos e de baixo custo, e têm menos implicações éticas do que as experiências com animais inteiros, avanço de compostos terapêuticos requer prova de eficácia e segurança em modelos animais. Para estudos in vivo, as linhas celulares de leucemia aguda humana pode ser transplantado para ortotopicamente NOD.Cg-Prkdc SCID I l2rg tm1Wjl / SZJ (NSG) ratos e TKIs pode ser facilmente administrado por injeção ou por sonda oral. Algumas linhas de células podem exigir a exposição de ratos a uma dose NSG dependente da linha celular de baixo de radiação, a fim de estabelecer xenoenxertos, e, neste caso, os ratos não podem tolerar a administração por sonda oral, sem um período de recuperação de 5-10 dias pós-irradiação. Este manuscrito descreve geração de B-ALL e T-ALL xenografts usandolinhas celulares específicas (697 e Jurkat), como exemplos, mas pode ser estabelecido xenoenxertos em ratinhos NSG utilizando uma ampla variedade de linhas celulares. No caso em que outras linhas de células são mais aplicáveis, o requisito para a irradiação, o número óptimo de células para transplante, e tempo de aparecimento e progressão da doença deve ser determinada experimentalmente. Idealmente, estes modelos terão penetrância completa (todos os animais transplantados desenvolve leucemia), cinética consistentes (leucemia progride de forma semelhante em todos os animais), e uma janela de tratamento razoável (idealmente 20-30 dias entre o início do tratamento e remoção de estudo devido a doença) . O número de células transplantadas podem ser aumentados para melhorar a penetração e consistência cinética ou diminuída para melhorar a janela de tratamento, se necessário.

Para determinar se TKIs mediar a inibição alvo in vivo, as amostras são coletadas de ratos com leucemia xenografts após o tratamento com TKI ou só veículo. Idealmente, a uma dosed esquema de administração para estas experiências são guiados por estudos farmacocinéticos, que muitas vezes podem ser realizados por laboratórios comerciais e estão fora do escopo deste artigo. Se estão disponíveis dados farmacocinéticos, a concentração de composto requerida para a inibição eficaz alvo em cultura de células e a concentração máxima no soro, após uma única dose de TKI pode ser utilizado para definir uma dose de partida para estudos com animais. Os estudos farmacocinéticos também pode informar o período de recolha de amostra de pós-tratamento para os estudos farmacodinâmicos e da via de administração. A inibição do alvo pode ser avaliada em qualquer órgão afectado, mas os tecidos que são mais facilmente recolhidas e processadas são preferíveis. Linhas de células de leucemia mais agudos estabelecer no fígado, medula óssea, o baço, o sangue periférico, e o sistema nervoso central, embora os órgãos específicos afectados e a extensão do enxerto de órgãos varia entre estes modelos. O protocolo aqui apresentado avalia fosfinibição o-proteína na medula óssea através da análise de western blot, mas órgãos sólidos pode ser mais fácil para a colheita de forma consistente e exigem o mínimo ou nenhum tratamento até à congelação, permitindo que menos oportunidade para a degradação de proteínas fosfo durante a coleta e processamento das amostras. A imuno-histoquímica pode ser usada para avaliar tumores sólidos ou de órgãos atingidos por leucemia.

Finalmente, a eficácia terapêutica do TKI (s) é determinada em modelos de xenotransplante de leucemia ortotópicos. Para estes estudos, a temporização de início do tratamento pode ser variada, de modo a que a doença é mais ou menos estabelecido. O tratamento pode começar imediatamente após o transplante para os estudos iniciais e, em seguida, ser adiada em estudos subseqüentes, até que a carga da doença significativa é detectada a aproximarem mais um modelo de tratamento de diagnóstico. Idealmente, estes modelos animais também têm a capacidade de medição não invasiva da carga de doença. Nós otimizamos os métodos de introdução do lucifer vaga-lumegene ase em linhagens celulares de leucemia usando partículas semelhantes a vírus, permitindo a análise não-invasivo, longitudinal do início da doença e progressão e avaliação da carga de doença na medula óssea e órgãos sólidos. Crítico para esta abordagem é a utilização de linhas de células monoclonais etiquetados-luciferase para evitar a variabilidade no desenvolvimento de leucemia que expressam a luciferase associada com a utilização de linhas celulares policlonais e não está relacionada com o tratamento com um TKI de 8.

Tomados em conjunto, estes passos podem ser utilizados para a avaliação de um único TKI ou por comparação direta e classificação de várias TKIs. Embora os protocolos aqui apresentados se concentrar no desenvolvimento de inibidores da tirosina quinase, estes métodos podem ser adaptados para outros objectivos e considerações para o desenvolvimento do ensaio são descritos. Assim, esta estratégia pode ser mais amplamente aplicável para a avaliação pré-clínica de agentes molecularmente-alvo para o tratamento de leucemia aguda.

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Protocol

Todos os experimentos envolvendo animais seguiu as normas regulamentares aprovadas pela Universidade do Comitê Animal Care e Use Institucional Colorado. O protocolo foi aprovado demonstrado pela Universidade do Comité Animal Care and Use Institucional Colorado.

1. Fosfo-proteína Western Blot

  1. Preparação de lisados
    1. Linhas de células de cultura que expressam o receptor tirosina-quinase de interesse. Células colheita e placa de 3-5 x 10 6 células / amostra em 400 mL meio de crescimento em um tecido de 48 poços cultura prato. Incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 2-3 horas.
    2. Adicionar 100 ul de solução de 5x TKI em meio de crescimento e incubar durante 60 min.
    3. Preparar tampão de lise com 50 mM de HEPES (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, 10% (v / v) de glicerol, 1% (v / v) de Triton X-100 e inibidores da protease. Se as culturas não serão tratadas com pervanadato antes da colheita, adicionar inibidores de fosfatase (orthova de sódio 1 mMnadate e 0,1 mM de molibdato de sódio) para tampão de lise.
    4. Prepare pervanadato (PV) solução do inibidor de fosfatase imediatamente antes da utilização. Prepara-se uma solução de 0,3% de peróxido de hidrogénio (CUIDADO) em solução salina fria tamponada com fosfato (PBS), num tubo escuro em gelo (diluição 1:100 de uma solução de estoque de 30%). Ferve-se uma alíquota de 0,2 M de ortovanadato de sódio (OV, CUIDADO) solução estoque de 5 min. Diluir 1:10 em PBS para fazer uma solução 20 mM de OV, à temperatura ambiente (RT). Misture 0,3% de peróxido de hidrogénio e 20 mM de OV 1:1 e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 20 min.
    5. Diluir PV em meio completo (60 + 940 mL PV médio mL). Adicionar 100 ul de PV diluído / poço. Incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 3 min e, em seguida, colocar a placa em gelo.
    6. Colher as células em tubos de microcentrífuga de frio a 2.500 rpm durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 120 ul de tampão de lise. Incubar em gelo durante 15 min. Clarificar o lisado numa microcentrífuga frio a 6000 rpm durante 3 min. Supe Transferirrnatant a um tubo de frio fresco. Armazenar a -80 ° C.
  2. Imunoprecipitação
    1. Girar proteína G sepharose contas em microcentrífuga a 1.000 rpm por 1 min. Remover o sobrenadante e lava-se os grânulos 2x com 1 ml de PBS gelado. Adicionar um volume igual de PBS para fazer uma pasta a 50%. Adicionar anticorpo primário e 20 mL de 50% proteína G contas para cada amostra. Incubar durante 2 horas - O / N a 4 ° C num rotor.
    2. Pulso para baixo contas em uma microcentrífuga frio a 9.000 rpm. Remover o sobrenadante e lava-se os grânulos 2x com 150 ul de tampão de lise frio. Gire em microcentrífuga frio a 1.000 rpm por 1 min. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento em 20 mL 2X SDS Sample Buffer com 2-mercaptoetanol (CUIDADO). Use imediatamente ou armazenar a -80 ° C.
    3. Amostras ferva por 5 min e correr em um gel de tris-glicina SDS-PAGE. Transferir as proteínas para uma membrana de nitrocelulose e detecção de fosfo-proteína por western blot.
    4. Lavar blot com água e, em seguida, incuba-se 2% de SDS, Tris 62,5 mM (pH 6,8), 0.1 H β-mercaptoetanol (CUIDADO) durante 30 min a 50 ° C. Lavar 2x com água e, em seguida, lavado por 60-90 min em 5-6 mudanças de TBS-T para remover a solução de decapagem.
    5. Detectar-proteína total por Western Blot.

2. Methylcellulose Assay

  1. Alíquota de 4 ml de meio base humana metilcelulose em 50 ml tubos cônicos usando um estéril grande furo de agulha sem corte final. (Nota:. Metilcelulose podem ser divididos em alíquotas e armazenado a -20 ° C. Descongelar à TA S / N antes de usar)
  2. Adicionar 500 mL de 10x TKI ou veículo em meio de crescimento de 4 ml de metilcelulose e mistura em vórtice durante 10 seg.
  3. Colheita e contagem de células. Prepara-se uma suspensão de células em meio de crescimento numa concentração, a qual é de 10x maior que a concentração celular final. Adicionar 500 ul de suspensão celular a mistura de metilcelulose. Vortex por 10 segundos e deixe descansar por 10 min para remover as bolhas.
  4. Elaborar 4 ml de mistura de metilcelulose utilizando uma seringa de 5 ml e larg estérile suportou agulha fim brusco. Evite elaboração de bolhas. Repartir 1 ml da mistura de metilcelulose para o centro de três placas de cultura de tecidos de 35 mm. Agitar os pratos até que a parte inferior é completamente coberto com metilcelulose.
  5. Para cada placa de metilcelulose, preparar um tecido estéril placa de cultura de 10 centímetros com duas placas de cultura de adicionais 35 milímetros de tecido cheios de água esterilizada para garantir um ambiente úmido. Colocar em culturas com camisa de água numa estufa a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 10-14 dias.
  6. Contagem das colónias após 1-2 semanas. Colónias deve ser mais do que 20 células e não se sobrepõem. As colónias podem ser contadas utilizando um microscópio invertido equipado com um estágio de microscópio com uma grade ou utilizando um contador de colónias automatizado. Mudanças no tamanho ou morfologia da colónia em resposta ao tratamento com TKI também devem ser avaliadas. Para melhorar a detecção de pelo contador de colónias, as colónias de manchas pela adição de 60-100 ul de (3 - (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazólio, brometo de solbuição (MTT 5 mg / ml em H2O, guardar a -20 ° C, protegido da luz, CUIDADO) gota a gota sobre a superfície de cada placa e incubou-se durante 8 horas a 37 ° C em 5% de CO 2.

3. Agar Mole Ensaio

  1. Prepare 1% agar nobre para a camada inferior, 0,7% de ágar nobre para a camada superior e 2x meio de crescimento. Equilibrar meio de crescimento 2x em um banho de água a 42 C °. O calor a 1% e 0,7% de agar noble, em um forno de microondas (cerca de 1 min/100 mL) e equilibrar num banho de água a 42 ° C. Mistura de partes iguais de 1% de agar e meio 2x e, separadamente, 0,7% de agar e em meio 2x 50 ml conicals. Plano de 10 ml de agar suave mistura / seis bem-placa para cada camada.
  2. Etiqueta de 6 placas de cultura de tecidos. Encher cada poço com 1,5 ml de 1% de mistura de agar mole. Evite bolhas durante plaqueamento. Secar as placas com tampas fora em capa de estéril para 30 min.
  3. Contagem de células. Prepara-se uma suspensão de células em meio de crescimento numa concentração, que é 500 vezes mais elevada do que a de células final concentratina. Adicionar a suspensão de células de 0,7% de mistura de ágar, misturar bem e dispensar 1,5 ml da mistura de células de ágar sobre o topo da camada de agar a 1%. Deixe que a camada superior solidificar, durante 30 min.
  4. Prepare meio de crescimento contendo 1x TKI ou o controle do veículo. Adicionar 2 ml de meio com a concentração desejada de TKI no topo da camada de agar de topo.
  5. Incubar as culturas durante 10 dias a 37 ° C em 5% de CO 2. Remover e substituir o meio sobrepondo a cada 3 dias.
  6. Quando as colônias são visíveis a olho nu, aspirado sobrepondo médio e adicione 200 mL solução de azul de nitro-tetrazólio (1 mg / ml NBT em H 2 O, armazenar a 4 ° C, protegido da luz, CUIDADO). Retornar para incubadora de 24-48 horas. Mover a 4 ° C durante pelo menos 2 horas antes da contagem. Placas coradas podem ser guardadas a 4 ° C durante um mês. Contagem das colónias utilizando um microscópio ou um contador de colônia automático.

4. Avaliação da Inibição Fosfo-proteína in vivo

  1. Colete cells crescimento em fase log por centrifugação numa centrífuga de mesa a 1500 rpm durante 5 min. Lave as células uma vez com PBS estéril, e ressuspender em PBS a uma concentração adequada (tipicamente de 1-5 x 10 7 células / ml). Transplante de células num volume de 100 ul em 6-12 semanas de idade, ratinhos NSG por injecção intravenosa na veia da cauda usando uma seringa de insulina de 28 L. Colocar o animal em um limitador, aqueça o rabo em um copo de água morna para dilatar as veias, e limpar o rabo com um cotonete de clorexidina antes da injeção. Após a injeção, aplicar pressão no local da injeção usando gaze estéril até parar o sangramento. Transplante pelo menos 3 animais / grupo. Manter a ratinhos em água contendo 1 mg / ml de sulfato de gentamicina.
  2. Quatorze dias após o transplante, o tratamento de animais com TKI ou o veículo só e amostras de colheita para análise de inibição alvo. Pesar animais e trata-se com uma dose apropriada (mg / kg de peso corporal) de TKI ou veículo. Administrar tratamento em um volume de 5 ml / kg de massa corporal por via intraperitoneal (ip) de injecção ou 10 ml / kg de peso corporal, por sonda oral. Para injecção ip, conter o mouse manualmente e injetar no quadrante inferior direito do abdômen através de um G agulha 29. Para sonda oral, conter o mouse manualmente e manter o animal em pé. Colocar o tubo de gavagem na boca ao longo da língua e na parte posterior da boca. Aplique uma leve pressão para passar o tubo através do esôfago e no estômago. Pressione o êmbolo da seringa para administrar o tratamento. Se o êmbolo não deprime facilmente a agulha gavage devem ser removidos e reposicionados. Prepare formulações TKI imediatamente antes da utilização.
  3. Se o tratamento com pervanadato for desejado, preparar a solução PV 20 min antes da colheita, tal como descrito acima (passo 1.1.4) e dilua em meio com 1 uM de MgCl 2 e 100 U / ml de DNase (120 ul PV + 880 ul de meio). Nota: PV permanece estável durante pelo menos 1 hora após a diluição.
  4. Sacrifício de animais por CO 2 narcose no apvez (es) quado pós-tratamento. Dissecar fémur, removendo pele, pele e músculo de toda a perna, de modo que os ossos são completamente exposta. Retire os fêmures grampeando com dissecando tesoura, logo abaixo da articulação do quadril e novamente acima da articulação do joelho. Transfira para uma placa de Petri e medula óssea nivelada com 1 ml de PBS frio ou solução PV diluídos utilizando uma seringa e uma agulha G 27. Se o tratamento com PV, incubar à temperatura ambiente no escuro durante 10 min.
  5. Prepare lisados ​​e analisar os níveis de fosfo-proteína e proteína total, como indicado acima (passos 1.1.6-1.2.5).
  6. Quantificar fosfo-relativa de proteína e níveis das proteínas totais para cada amostra usando densitometria. Calcular em relação phospho-protein/total-protein para o valor médio phospho-protein/total-protein para animais tratados com veículo.

5. Avaliação da atividade anti-leucemia de TKI em todos os modelos Xenoenxerto

  1. Se necessário, expor ratos a 200 cGy de radiação em um irradiador RS-2000 um dia prior para transplante. Transplant ratinhos com linhas celulares de leucemia, tal como descrito acima (passo 4.1). Transplante de pelo menos seis ratos por grupo. Identificar os ratos por punção da orelha. Em alternativa, um marcador de preto podem ser utilizados para identificar os ratinhos com marcas de hash nas suas caudas. Adicionar enriquecimento de gaiolas para reduzir o potencial de agressão gaiola companheiro durante o estudo.
  2. Tratar os ratos com um TKI ou apenas veículo como descrito acima (passo 4.2). Monitorizar o estado de saúde de ratos diariamente através do exame físico e determinação de peso. Sintomas esperados de leucemia (reduzido nível de atividade, perda de peso, paralisia dos membros posteriores, e infecções nos olhos). A perda de peso superior a 10% -15% é geralmente associada com a morte do rato dentro de dois dias e é tipicamente um terminal substituto para a morte, de acordo com requisitos da norma IACUC.
  3. Monitore o enxerto e desenvolvimento de leucemia por meio de um sistema de imagem in vivo bioluminescência até 2x por semana. Prepara-se uma solução estoque de 200x D-luciferina (30 mg / ml) em Steriágua le. Misturar suavemente por inversão até D-luciferina está completamente dissolvido. Use imediatamente ou alíquota e congelamento a -20 ° C. Antes da imagiologia utilizando um sistema de imagem in vivo, a bioluminescência, descongelar alíquotas de D-luciferina à RT e dilui-se 1:02 em PBS para uma concentração final de 15 mg / ml e esterilizar filtro através de um filtro de 0,2 um.
  4. Anestesiar os ratos antes de imagem com 1,5% de isoflurano inalado em oxigênio. Monitorar anestesia suficiente, caracterizada por relaxamento muscular, perda de movimento e perda de resposta à estimulação toe-pinch.
  5. Imediatamente antes de imagem, administra 150 mg / kg de peso corporal de D-luciferina, por injecção ip (10 ul de 15 mg / ml de luciferina / g de peso corporal).
  6. Use um sistema de imagem de bioluminescência in vivo para capturar duas séries de imagens com seqüenciais 30, 60 e 90 exposições SEC e uma imagem final com uma exposição sec 120. Depois de imagem, voltar camundongos em gaiolas e monitor para a recuperação da anestesia. Dependendo dointensidade de bioluminescência, tempo de exposição pode ser variada. Vezes a exposição ideal deve ser determinada para um determinado modelo e mantidos consistentes de tal forma que a intensidade de sinal para momentos individuais são comparáveis ​​ao longo de todo o estudo.
  7. Determinar a intensidade de bioluminescência para cada rato usando Viver 3,2 aquisição e análise de software de imagem. Determine os valores totais de fluxo medidos em fótons / segundo por regiões de interesse (ROI) de tamanho idêntico em cada rato de desenho.
  8. Sacrifício ratinhos por CO 2 a exposição e deslocamento cervical se moribundos, apresentando paralisia, no caso de mais do que 15% de perda de peso, ou no final do estudo. Dissecar camundongos e observações de discos (por exemplo, da ampliação do baço, fígado, ou linfáticos; pálido da medula óssea). Dissecar fêmures e medula óssea nivelada com PBS frio usando uma agulha G 27.
  9. Recolher as células numa microcentrífuga a 2500 rpm durante 5 min. Ressuspender as células em PBS contendo 2% de FBS e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.Recolher as células e mancha com 20 mg / ml de DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol, dicloridrato, 1:1000) e conjugados com FITC α-hCD45 (1:100) ou anticorpos IgG de ratinho de controlo de isotipo 1 (1:100) . Avaliar leucemia enxerto utilizando citometria de fluxo. Portão na população viável (DAPI negativo) e determinar porcentagem de células CD45 + (blastos da medula óssea%).

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Representative Results

Os ensaios aqui apresentados avaliar os efeitos bioquímicos e funcionais mediados por TKI e pode ser utilizado para classificar novos compostos com base no grau de inibição alvo in vitro e in vivo, redução da formação de colónias, e atraso na leucemogênese em ratinhos NSG transplantado com luciferase etiquetado células de leucemia.

A análise por imunotransferência foi utilizado para determinar a inibição da forma fosforilada activa da proteína alvo em células de leucemia após o tratamento com inibidores da tirosina quinase. O tratamento com inibidores da tirosina quinase resultou numa diminuição dependente da dose na quantidade de proteína fosforilada. Figura 1 mostra a inibição da fosforilação do alvo por três TKI diferentes em uma linha de células de leucemia aguda com TKI de C, sendo o mais potente, TKI B ser menos potente, e TKI A ter nenhum efeito. Assim, este ensaio permite a classificação dos compostos com base na potência da actividade bioquímica em um sistema modelo baseado em células. Nos exemplos mostrados nasFigura 1, o enriquecimento do antigénio através de imunoprecipitação e o uso do inibidor de fosfatase pervanadato foram necessárias para alcançar resultados interpretáveis. Motivo para que possa ser, que a fosforilação de proteínas deste tirosina-quinase é extrema lábil.

Para estudar o efeito dos inibidores da tirosina quinase sobre as propriedades oncogénicas de células de leucemia aguda, foram utilizados ensaios de formação de colónias. Investigou-se a capacidade de células de leucemia dependente de alvo para formar colónias em (ALL) meio à base de metilcelulose e em agar mole (LMA). No exemplo mostrado na Figura 2A, uma redução estatisticamente significativa no número de colónias foi observado numa linha celular ALL, após tratamento com um TKI. Resultados semelhantes foram observados em linhas de células AML após o tratamento com inibidores da tirosina quinase, em agar mole. Na Figura 2B, há uma tendência para o número de colónias diminuída em resposta ao tratamento com inibidores da tirosina quinase e da diminuição parece dependente da dose, mas a diferença não é ratistically significativo como resultado da variabilidade entre repetições. Nota os grandes desvios-padrão da figura 2B em relação à figura 2A. Amplo mistura das células para o meio semi-sólido e igual distribuição do meio semi-sólido para os poços ou placas é fundamental para a coerência entre as repetições em ensaios clonogénicos. Contagem exacta de células viáveis ​​antes da metalização, também é importante para garantir a consistência entre as experiências. Figura 2C mostra uma placa com uma distribuição desigual de colónias, bolhas no agar mole, e incompleto difusão do agar mole na placa (painel da direita) e uma placa com revestimento adequado para comparação (painel da esquerda). Para assegurar que a metilcelulose não secar durante o período de incubação, é também importante para incluir placas de água esterilizada em cada prato. A desidratação do meio de metilcelulose muda a sua densidade e desse modo reduz a capacidade das células para formarem colónias, potencialmenteimpedindo a geração de resultados úteis.

Para determinar se os inibidores da tirosina quinase pode inibir a proteína-alvo in vivo, análise de Western blot foi usado para analisar os níveis de fosfo-proteína e proteína total, em blastos de medula óssea isoladas a partir de ratinhos transplantados NSG com uma linha de células de leucemia aguda. No exemplo mostrado na Figura 3, a análise farmacodinâmica revelou uma diminuição nos níveis de fosfo-proteína em blastos de leucemia isoladas a partir de ratinhos tratados com TKI relativamente a ratinhos tratados com apenas veículo. Estes estudos demonstram a inibição da auto-fosforilação em células de leucemia a seguir ao tratamento com inibidores da tirosina quinase, in vivo, confirmando que estes compostos atingem a medula óssea e inibir eficazmente o alvo. TKI D foi menos activo do que o TKI E neste ensaio. O exemplo mostrado, é necessária a utilização do pervanadato para estabilizar a fosfo-proteína alvo e permitem a detecção.

Um modelo de xenotransplante rato ortotópico de leucemia aguda em NSG mice injectados com uma foi utilizada toda a linha de células que expressam a luciferase de avaliar o efeito do tratamento com um TKI de potencial oncogénico in vivo. Como mostrado na Figura 4, os ratinhos tratados com TKI teve um nível inferior significativo de bioluminescência, indicando uma carga reduzida em relação à leucemia de ratos tratados apenas com veículo. Após 10 dias de tratamento, todos os ratinhos tinham um nível baixo de bioluminescência que não foi significativamente diferente entre os animais tratados com veículo e animais tratados com TKI. Em contraste, por 19 dias após o tratamento, os ratinhos tratados com veículo apresentaram significativa intensidade bioluminescência superior (86,12 ± 19,17 fotões / seg), enquanto que os ratinhos tratados com uma dose elevada de TKI tinham muito menor intensidade do sinal (29,64 ± 9,04 fotões / sec) .

Figura 1
Figura 1. TKI inibir a fosforilação da proteína-alvo in vitro. Culturas de células foram tratadas com as concentrações indicadas de inibidores da tirosina quinase A, inibidores da tirosina quinase B, ou TKI C durante 1 hora. Pervanadato foi adicionado a culturas de células durante 3 minutos para estabilizar a forma fosforilada da proteína alvo. A proteína alvo foi imunoprecipitou de lisados ​​celulares e fosfo-proteína e proteína total foram detectados por western blot. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2
Figura 2. TKI reduz a formação de colónias em linhas celulares de leucemia aguda em metilcelulose e agar mole. Todas as células foram semeadas em metilcelulose (A) e as células foram semeadas em AML soft ágar (B) na presença de um TKI ou DMSO (controlo do veículo). As colónias foram contadas após 2 semanas em cultura. Os valores médios e os desvios padrão foram obtidos a partir de placas em triplicado. (C) placas de ágar macios representativos com ótima distribuição de colônias (painel esquerdo) ou a distribuição desigual das colônias e agar macio parcialmente descolado (painel direito) são mostrados. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3
Figura 3. O tratamento com TKI reduz os níveis de fosfo-proteína in vivo. Ratinhos A NSG foram transplantados com uma linha celular ALL e tratados com uma dose única de TKI D, E TKI, ou veículo apenas, após o desenvolvimento de leucemia. Óssea marrow células foram recolhidas a partir de fémures e tratou-se com pervanadato antes para a preparação de lisados ​​de células inteiras. Imunoprecipitação da proteína alvo, e detecção de proteínas totais-fosfo-e por Western blot foram realizadas. Intensidade de sinal B foi quantificada por densitometria ea fração de fosforilada proteína alvo em relação a animais tratados com veículo foi calculado. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 4
Figura 4. O tratamento com TKI atrasa a progressão da doença em ratinhos transplantados com um humano que expressam a luciferase ALL linha celular. NSG ratinhos foram transplantados com uma população de anticorpos monoclonais transduzidas por luciferase todas as células por injecção na caudaveia. D-luciferina foi injetada por via intraperitoneal e imagens bioluminescência foram tomadas duas vezes por semana (Bining: 8, FOV 19.6, f / stop 1, tempo de exposição de 120 segundos). A PseudoColor imagens são mostradas demonstrando o aumento da intensidade ao longo do tempo a bioluminescência em ratos transplantados com células de leucemia e uma redução dose-dependente da intensidade da bioluminescência em animais tratados com um TKI. B quantificação da intensidade da bioluminescência média e erro padrão para cada grupo de estudo. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

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Discussion

Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação de inibidores de tirosina-quinase novos no tratamento de leucemia aguda. Usando esta abordagem, as actividades bioquímicas e anti-leucémicas são avaliados pela primeira vez em ensaios baseados em células in vitro e, em seguida, em modelos de xenoenxerto in vivo. A análise por imunotransferência foi utilizado com êxito para demonstrar a inibição da tirosina quinase alvo em células de leucemia após o tratamento com inibidores da tirosina quinase e comparar directamente a potência dos vários compostos nas células. No protocolo aqui apresentado, pervanadato foi usado para estabilizar a proteína fosfo e a proteína pretendida foi concentrada por imunoprecipitação. Se estas medidas não foram suficientes para permitir a detecção por transferência de western, os níveis de fosfo-proteína pode também ser aumentada pela adição de ligando, com ou sem pervanadato. Do mesmo modo, o ligante pode ser adicionado à solução usada para lavar a medula óssea, para estudos farmacocinéticos. LiGand pode ser purificado, ou, em alguns casos, pode ser fornecido como um componente de soro fetal bovino. No caso em que estes métodos não permitem a detecção de auto-fosforilada da tirosina quinase, os alvos a jusante podem também ser utilizados para a avaliação da inibição do alvo, embora seja preferível para avaliar a actividade da proteína alvo directamente, quando possível. De nota, o cuidado deve ser usado na interpretação dos resultados de experimentos usando pervanadato, que é um inibidor da fosfatase não seletivo que afeta muitas proteínas celulares. Por esta razão, pervanadato não deve ser utilizada para a detecção de alterações nos componentes de sinalização a jusante.

Antes do estudo, em modelos animais, é desejável para confirmar a actividade anti-leucemia mediada por inibidores da tirosina quinase em células de leucemia. Para estes estudos contamos com ensaios clonogénicos em metilcelulose ou ágar macio. Enquanto outros ensaios também podem ser utilizados para avaliar os efeitos anti-tumorais em cultura, ensaios de formação de colónias são frequentemente mais predictive de eficácia in vivo em relação aos ensaios mais tradicionais que avaliam a proliferação e / ou a sobrevivência em cultura líquida. No entanto, estes ensaios podem ser utilizados juntamente com ensaios de formação de colónias para avaliar os mecanismos de actividade anti-leucemia mediada por inibidores da tirosina quinase e também pode ser útil no caso de uma linha de células de interesse não formam colónias. Especificamente, ele pode ser útil para avaliar a indução de apoptose em resposta a tratamento com inibidores da tirosina quinase, utilizando ensaios de citometria de fluxo para determinar o nível de caspases clivados / activadas, aumento da ligação de anexina V da superfície da célula, ou absorção diferencial de YOPRO-1-iodeto . De igual modo, a diminuição da proliferação ou indução da diferenciação também podem contribuir para a actividade anti-leucemia. Como tal, as curvas de crescimento pode ser gerada na presença e na ausência de inibidores da tirosina quinase para avaliar a proliferação e morfologia celular e as alterações na expressão de marcadores de superfície celular podem ser analisados ​​para determinar a fase de diferenciação. O uso de clonogénicoensaios está bem estabelecida no campo do desenvolvimento de drogas e serve como uma ferramenta de baixo custo para a avaliação de inibidores da tirosina quinase. No entanto, sabe-se que as alterações sistemáticas nas condições de cultura (incluindo a adição de factores de crescimento e outros suplementos, variações na composição de soro, e as diferenças em que o pH da solução de TKI) pode influenciar o crescimento das colónias e quimiossensibilidade 9,10. Portanto, a consistência nas condições de cultura é crítica para a reprodutibilidade neste ensaio. A distribuição irregular das células ou TKI também pode levar à descaracterização da eficácia de terapias experimentais (Figura 2C). Na avaliação da adição de mais do que um ponto de tempo para contagem de colónias ou de chapeamento, após a exposição ao medicamento podem ajudar a distinguir entre as drogas que medeiam os efeitos anti-proliferativos, mas não têm o potencial curativo 7.

Os estudos in vivo aqui descritas representam um passo fundamental no caminho para clinical aplicação de um TKI. Os estudos farmacodinâmicos para demonstrar a inibição alvo são importantes para definir a dose ea frequência de administração relevante para estudos posteriores para avaliar a eficácia. Na maioria dos casos, é preferível para alcançar a inibição completa e contínua da proteína alvo e pode exigir um tratamento mais do que uma vez por dia. Além disso, a inibição da leucemogênese e aumentou a sobrevivência em modelos de xenoenxerto pode necessitar de uma dose mais elevada de TKI de que é necessária para a inibição completa bioquímica e contínua na medula óssea. Isso pode ocorrer por causa leucemia estabelece em vários locais e exposição a inibidores da tirosina quinase pode ser heterogéneo em diferentes localizações anatómicas, incluindo o cérebro, ou pode reflectir limitações de sensibilidade do ensaio, resultando em falha para detectar quantidades restantes limitadas da proteína alvo activo ( ou seja, incompleta inibição alvo). No entanto, ao contrário de terapias citotóxicas tradicionais, que são administrados no seu máximodose tolerada, os agentes molecularmente-alvo tumorais mais selectivos podem ser igualmente eficazes em doses mais baixas que são suficientes para a inibição da bioquímica da proteína alvo, mas não estão associados com a toxicidade significativa. Assim, para esta classe de agentes, os estudos iniciais para avaliar os efeitos de um TKI de progressão da leucemia em modelos de xenotransplante, muitas vezes utilizam a dose mínima necessária para se obter a inibição completa e contínua do alvo. Se não se observam efeitos sobre a progressão da leucemia ou de sobrevivência, a dose pode ser aumentada até que a toxicidade é observado. Estes modelos podem também ser utilizados para investigar os efeitos de uma TKI administrado em combinação com terapias de leucemia standard, informando assim os protocolos clínicos posteriores de desenvolvimento.

O estabelecimento de modelos de xenotransplante de leucemia aguda, utilizando células que expressam luciferase representa um grande avanço em relação aos modelos de xenotransplante mais tradicionais e tem o potencial de acelerar consideravelmenteo processo de descoberta e desenvolvimento de drogas 11. Imagem de bioluminescência permite a determinação longitudinal não-invasivo de carga leucemia, diminuindo assim o número de animais necessários para estudos, e também pode fornecer informação sobre a localização anatómica da doença. Além disso, em um esforço para expandir potenciais utilidades clínicas de TKI, imagem de bioluminescência pode ser reproduzível que conseguiram após transplante de amostras primárias humanas marcadas-luciferase paciente 12. Contudo, a interpretação de imagens de bioluminescência pode ser difícil, devido à incerteza de posição das células emissores de luz e, assim, na imagem de bioluminescência vivo só deve ser usado como uma ferramenta de semi-quantitativo para seguir o mesmo animal em condições idênticas 13.

No caso de proporções que vários compostos apresentam uma actividade significativa e comparável nos ensaios descritos aqui, os critérios adicionais que podem ser utilizados para posterior Ranking de compostos incluem relativa facilidade de síntese dos compostos, a solubilidade, o grau de biodisponibilidade oral, as propriedades farmacocinéticas, e os estudos de toxicologia. Tomados em conjunto, estes dados devem permitir a identificação de um composto ideal para a progressão para a investigação clínica e são necessários para apoiar a apresentação de um pedido Investigational New Drug (IND) com a Food and Drug Administration (FDA) para permitir estudos clínicos. Depois de gerar esses dados pré-clínicos críticas necessárias para o avanço desses novos agentes para a clínica, a utilização do Instituto Nacional do Programa de Avaliação de Tratamento de Câncer do Ministério da Saúde (CTEP) deve ser considerada. Neste programa de ensaios clínicos são patrocinados para avaliar novos agentes anti-câncer, com ênfase especial na investigação translacional. Cuidados devem ser tomados para coordenar a apresentação pública de dados pré-clínicos, incluindo a descrição das estruturas e síntese de novos compostos, com a apresentação de pedidos de patente para proteçãot direitos de propriedade intelectual. Em geral, os dados não devem ser apresentados publicamente até pedidos de patentes que protegem a composição da matéria e métodos de utilização foram arquivados.

Em conclusão, nós demonstramos uma estratégia eficaz para investigar e avaliar o potencial de novos inibidores da tirosina quinase, como agentes terapêuticos para o tratamento de leucemia aguda. Inibição alvo em células de leucemia, tanto em cultura e isoladas a partir da medula óssea de ratinhos com xenoenxertos de leucemia humana, pode ser avaliado por imunotransferência. O significado funcional de inibição alvo pode ser avaliada usando ensaios clonogénicos e modelos de xenoenxerto de murinos ortotópicos com imagiologia bioluminescente. Juntos, esses ensaios fornecem dados pré-clínicos críticas necessárias para o avanço desses agentes translacionais novas para a clínica.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Na imagem in vivo foi realizado com o recurso compartilhado IVIS na Universidade do Colorado Cancer Center (apoiada pela concessão P30-CA046934). A citometria de fluxo foi realizada no Resource Citometria de Fluxo Compartilhada, da Universidade do Colorado Cancer Center (apoiado pela concessão P30CA046934). Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (RO1CA137078 a DKG). ABLS é membro do Programa de Desenvolvimento Pediátrica Scientist, apoiada por doações da Academia Americana de Pediatria, a Sociedade Americana de Pediatria, eo Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Desenvolvimento Humano (K12-HD000850) Eunice.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Hydrogen Peroxide MP Biomedicals #02194057 GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate Sigma #S6508 GHS07, H302+ H312+H332 
2-Mercaptoethanol  Sigma #M7522 GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410  
ColonyGel Human Base Medium  ReachBio #1101  
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) Sigma #M5655 GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341  
Difco Noble Agar  BD Biosciences #214883  
Nitrotetrazolium Blue Chloride Sigma #N6639 GHS07, H302 
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt PerkinElmer #122796  
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride Sigma #D9542  
FITC CD45  BD Bioscience #347463  
FITC Mouse IgG1 Isotype control BD Bioscience #51-35404X-2  
Gentamycin Sulfate Sparhawk #NDC58005-633-04  
Protease Inhibitors  Roche #11836153001  
DNase Sigma #D4263  
Protein G Beads Invitrogen #10-1242  
Isofluran VETONE #NDC13985-030-60  
  Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm Nunclon #D7804-500EA  
Cell culture dishes, diam. 100 mm x  H 20 mm   Nunclon #D8429-1CS  
6-well plates BD Bioscience #353046  
14 gauge x 4 inch blunt-end needles Cadence science #7956  
5 ml syringe with luer-lok BD Bioscience #309646  
GelCount automated colony counter Oxford Optronix  
In vivo bioluminescence imaging system PerkinElmer #IVIS200  
Scout pro portable balances, scale Ohaus #SP202  
Broome style rodent restrainer Plas-labs #551-BSRR  
Ear punch, punch diameter: 2 mm FST #24210-02  
Chlorhexidine swabs, Prevantics PDI #B10800  
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 Monoject #8881500042  
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile Instech #FTP-20-38  
1 mL Luer-Lok disposable syringe BD Bioscience #309628  
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle BD Bioscience #329465  
Extra fine bonn scissors FST #14084-08  
Student fine scissors FST #91460-11  
Moria ultra fine forceps FST #11370-40  
Extra fine graefe forceps FST #11150-10  
Scalpel handle FST #10003-12  
Scalpel blades FST #10011-00  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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