Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour

Immunology and Infection

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Summary

Les membres du genre Burkholderia sont des agents pathogènes d'importance clinique. Nous décrivons un procédé pour l'extraction totale de la protéine bactérienne, en utilisant une rupture mécanique, et un gel d'électrophorèse 2D pour l'analyse protéomique ultérieure.

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Velapatiño, B., Zlosnik, J. E., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

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Abstract

L'enquête sur les niveaux de protéines intracellulaires d'espèces bactériennes est importante pour la compréhension des mécanismes pathogènes de maladies causées par ces organismes. Nous décrivons ici un procédé pour l'extraction des protéines à partir de Burkholderia espèces sur la base de la lyse mécanique à l'aide de billes de verre en présence d'acide éthylène-diamine tétra-acétique et de fluorure de phénylméthylsulfonyle dans du tampon phosphate salin. Cette méthode peut être utilisée pour différentes espèces Burkholderia, pour différentes conditions de croissance, et il est probable adapté pour l'utilisation dans des études de protéomique d'autres bactéries. Après l'extraction de la protéine, un (2-D) électrophorèse sur gel technique protéomique deux dimensions est décrit pour étudier les changements mondiaux dans les protéomes de ces organismes. Cette méthode consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, suivie d'une séparation sur la base du poids moléculairepar électrophorèse sur gel d'acrylamide dans la seconde dimension. Visualisation de protéines séparées est effectuée par coloration à l'argent.

Introduction

Le genre Burkholderia comprend plus de 62 espèces, organismes Gram négatifs isolés à partir d'une large gamme de niches, et elle est divisée en deux groupes principaux 1,2. Le premier groupe comprend des organismes phytotrophique humaine, animale et, et la plupart des études ont porté sur les espèces pathogènes de ce groupe en raison de leur importance clinique. Les membres les plus pathogènes sont B. pseudomallei et B. mallei (qui provoque melioidosis et morve respectivement) 3,4 et pathogènes opportunistes (les 17 espèces déterminées du complexe Burkholderia cepacia, BCC) 5, qui causent la maladie de la fibrose kystique (FK) et granulomatose chronique (CGD) 1. Le deuxième groupe, avec plus de 30 espèces non pathogènes, comprend bactéries associées aux plantes ou à l'environnement, et sont considérés comme potentiellement bénéfique à l'hôte 2.

De nombreuses complications surgissent frinfection bactérienne om avec les éléments pathogènes du genre Burkholderia, tels que la transmission de l'agent pathogène entre les patients, la propagation de la maladie et l'échec du traitement en raison de la résistance intrinsèque ou acquise aux antibiotiques rend difficile à éliminer dans la plupart des cas, de 6 à 9. Par conséquent, acquérir une meilleure compréhension de la base pour l'établissement d'une infection bactérienne est essentiel pour le traitement des maladies causées par ces organismes. Afin de mieux comprendre la mise en place de l'infection, des enquêtes approfondies sur les composants bactériens associés à la pathogenèse sont nécessaires. Les études portant sur ​​l'analyse protéomique des organismes Burkholderia utilisant une approche protéomique décrits protéines qui ont été impliqués dans la pathogenèse bactérienne ainsi que des changements dans leur protéome Profils avec 10-16.

méthodes d'extraction des protéines à l'aide de sonication et les cycles de gel-décongelés dans un tampon de lyse contenant une grande concentration de l'urée, de la thio-urée en combinaison avec un détergent et ampholytes a été appliquée dans des études protéomiques Burkholderia 10-13. Bien que l'urée est tout à fait efficace pour la dénaturation des protéines, on peut établir un équilibre en solution aqueuse avec de l'isocyanate d'ammonium, qui peut réagir avec les groupes d'acides aminés, en formant ainsi des artefacts (réaction de carbamylation) 17. Par conséquent, il est recommandé d'inclure des ampholytes porteurs, qui agissent comme piégeurs de cyanate et d'éviter des températures supérieures à 37 ° C 17. En outre, pour éviter toute interférence chimique de tampon de lyse avec de la protéine quantification, le même tampon de lyse peut être utilisé pour générer la courbe d'étalonnage de telle sorte que les échantillons et les standards ont le même fond 10. D'autres méthodes impliquent l'utilisation de tampons et détergents alcalins avec des périodes d'incubation de chaleur 17,18, mais ces conditions pourraient induire des changements dans le protéome et certains détergents sont pas compatibles avec proteomics demande si des mesures ultérieures d'élimination de détergent sont inclus 17,18.

Après l'extraction et la quantification adéquate, expression de la protéine globale de chaque protéine individuelle peut être étudiée en utilisant des approches protéomiques telles que deux dimensions (2-D) électrophorèse sur gel. Cette technique a été décrite par O'Farell 19 et consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, et ensuite en fonction de leur poids moléculaire par électrophorèse sur gel d'acrylamide dans la seconde dimension. En raison de sa sensibilité et de résolution, cette technique est un outil puissant pour l'analyse et la détection des protéines provenant de sources biologiques complexes 19,20. Cette technique de séparation est actuellement disponible dans les approches de protéines centrée avec le grand avantage de résoudre isoformes de protéines causées par des modifications post-transcriptionnelles ou traitement protéolytique. Les changements quantitatifspeut être détectée en comparant l'intensité de la tache correspondant après coloration du gel 20. Cependant, cette technique n'est pas adaptée pour l'identification de très grosses protéines, des protéines membranaires, des protéines extrêmement acides ou basiques et hydrophobes, et est une technique assez laborieux et prend du temps 20. De nouvelles approches de peptides centrée (à base de gel non) qui sont plus robustes et objective deviennent disponibles et peuvent être utilisés pour la comparaison quantitative par des méthodes stable de marquage isotopique différentielles telles que l'étiquetage de la cystéine par affinité isotope codé marquage (ICAT) 21, et un groupe amino étiquetage par isotopes marquage pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) 22. L'utilisation d'une technique de protéomique unique pourrait donner des informations insuffisantes, par conséquent l'utilisation de deux approches protéomiques complémentaires est nécessaire pour la plupart des changements évaluer pleinement dans protéome. Néanmoins, l'électrophorèse sur gel 2-D est largement utilisé et peut être appliquée de façon routinière pour la quanquantitatif expression de plusieurs protéines dans des organismes différents.

Nous décrivons ici une extraction de protéines à cellules entières et les procédures d'électrophorèse sur gel 2-D pour les espèces de Burkholderia qui ont été adaptés et optimisés à partir des 2-D Principes électrophorèse GE Healthcare et méthodes Manuel 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). L'extraction de la protéine a été effectuée en utilisant un batteur de billes avec des billes de verre en présence de PBS contenant 5 mM d'EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique) et 1 mM de PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle). Cette procédure permet la quantification des protéines avec une dégradation minimale et est modifiable pour les approches protéomiques Comme indiqué précédemment 15,23,24. Électrophorèse sur gel 2-D a été effectuée en utilisant 24 cm de long immobilisées pH 4-7 gradient et les protéines ont été séparées en fonction de leur point isoélectrique. Ensuite, les protéines ont été séparées en fonction de leur Molecpoids culier par gel SDS-polyacrylamide. De plus, nous avons décrit un procédé de coloration à l'argent pour la visualisation des protéines d'accompagnement, et un procédé de coloration à l'argent qui est compatible pour l'analyse par spectrométrie de masse. Ensemble, ces procédures peuvent permettre l'identification de protéines importantes d'espèces Burkholderia qui pourraient être impliqués dans la pathogenèse.

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Protocol

Une. La croissance de la culture (Jours 1 +2)

  1. Cultiver une culture de départ: 3 ml de Luria Bertani (LB) dans un tube pression supérieure de 15 ml, à 37 ° C pendant la nuit de la coiffe. Diluer la croissance durant la nuit jusqu'à une DO 600 de 0,6. Ajouter 1 ml de cette dilution à 100 ml de bouillon LB dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml. Incuber à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute pendant 16 heures en phase stationnaire (SP), pour mieux approximatif, en culture par lot, les conditions d'infection et pour garantir que les facteurs de virulence bactérienne sous le contrôle d'stationnaires facteurs de signal de phase tels que rpoS et quorum détection, elles sont exprimées. Sinon, les bactéries cultivées à SP début ou milieu de la phase ou la fin-logarithmique peuvent être utilisés pour obtenir des informations sur la phase d'adaptation bactérienne.
  2. Après 16 heures de mesurer la DO à 600 et d'assurer la culture a atteint SP par rapport à une courbe de croissance construite précédemment dans des conditions identiques.

2. Extraction des protéines (Jour 3)

  1. Préparer une solution fraîche 0,1 M phénylméthanesulfonyle fluorure (PMSF, 174,19 g / mol) dans de l'acétone en dissolvant 0,0174 g de PMSF (PMSF 'ATTENTION' est toxique et corrosif, l'utilisation des écrans faciaux et des gants) dans 1 ml d'acétone (acétone 'ATTENTION' est toxique et inflammable, utiliser des écrans faciaux et des gants).
  2. Préparer une solution de PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml de PMSF 0,1 M, 0,1 ml d'EDTA 0,5 M, et 9,8 ml de PBS. Vérifiez la DO de la culture h 16 est à peu près où il devrait être dans SP.
  3. Prendre 35 ml de la culture bactérienne et le transfert à un tube de centrifugeuse Oakridge et centrifuger la culture à 4500 g pendant 20 min à 4 ° C.
  4. Retirer le surnageant à un conteneur de déchets etajouter 35 ml de PBS refroidi et remettre le culot. Centrifuger à 4500 g pendant 20 min à 4 ° C.
  5. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de PBS froid. Transfert à stériles Eppendorf de 2 ml et centrifuger 1 min en haut dans le centrifuger à 14 000 g à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant.
  6. Ajouter 1 ml de solution de PBS / EDTA / PMSF, remettre le culot et le transfert à un 2 ml à vis tube à bouchon (avec joint torique) contenant ~ 0,5 ml de perles de verre (pré-stérilisés). Ajouter le culot remis en suspension dans le tube contenant les perles de verre et les perles bash à 4 ° C pendant 1 minute dans la chambre froide. Pour ce faire, 3x, mettre l'échantillon sur la glace après chaque coup.
  7. Centrifuger à 14 000 g pendant 1 min dans la microcentrifugeuse. Enlever le surnageant et le mettre dans un 5 ml tube en polystyrène stérile.
  8. Pour augmenter le rendement, ajouter 1 ml de PBS / EDTA / solution de PMSF à même tube contient encore des perles de verre. Bash bourrelet du tube à 4 ° C pendant 1 min. Ne ce 2x mettre l'échantillon sur af glaceter bash. Centrifugeuse à 14 000 g pendant une minute à la centrifugeuse et enlever le surnageant et ajouter au surnageant de l'étape 2.8. Utiliser une seringue de 1 ml et un filtre de 0,20 um le surnageant à partir du tube en polystyrène stérile à un nouveau tube de Eppendorf de 2 ml.
  9. A ce stade, les échantillons doivent être analysés pour déterminer la quantité de protéines, en utilisant la protéine kit et des aliquotes de 200 ug extraction Pierce MicroBCA doit être congelé à -80 ° C jusqu'à utilisation.

3. Préparation de l'échantillon (Jour 4)

  1. Préparer 25 ml réhydratation solution stock (8 M d'urée, 2% de CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% de bleu de bromophénol) et entreposer dans 2,5 ml aliquotes à -20 ° C. Ajouter 7 mg dithiothréitol (DTT, 154,2 g / mol) juste avant de les utiliser à une aliquote de solution de réhydratation des stocks de 2,5 ml.
  2. Processus décongelé des échantillons de l'étape 2.10 en utilisant un 2-D Clean up kit avec remise en suspension finale dans 450 pi de solution de réhydratation des stocks préparés à l'étape 3.1.

4. PremièreDimension Isoélectrofocalisation (IEF) (Jour 4)

Toutes les étapes de cette section utilisent le système IEF Ettan IGPhor.

  1. Mettre en place les IPG premières bandes de dimension: distributeurs de bande propres avec une solution de nettoyage de la bande, puis laver avec de l'eau Milli-Q, laisser à l'envers pour sécher. Assigner chaque échantillon à un numéro de support de bande de gel.
  2. Charger l'échantillon provenant de l'étape de réhydratation dans la seconde zone plus grande de l'extrémité (-). Utilisez une pince pour tirer propres bandes de gel sur l'emballage. Sortez couche protectrice de bandes de gel. Ligne bandes côté rugueux vers le bas dans un mouvement lent glissement d'obtenir les bandes humides le long du chemin de (-) à la fin (+) fin.
  3. Mettez du papier buvard humide avec de l'eau stérilisée au-dessus de l'électrode et dans les bandes de gel pour prévenir l'épuisement professionnel. Rincer pinces entre-deux tours avec de l'eau purifiée et de l'éthanol. Retirez toutes les bulles, superposer finement avec de l'huile minérale pour éviter des déplacements secs. Aligner les supports de bande de gel sur la machine.
  4. Exécutez 12 h à 20 ° C pour rehydration, 1 heure à 200 V, 1 heure à 500 V, 1 h à 1 000 V, 0,5 heure à 4000 V, 12 h à 8 000 V, 24 heures cale à 300 V et peut être retirée à ce moment.
  5. Après IEF est terminé, il est recommandé d'effectuer la deuxième dimension électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, à moins que la bande IPG sont en cours de congélation à -80 ° C en Saran Wrap enduit avec de l'huile minérale pour une analyse ultérieure. En variante, afin d'éviter le point de stries en raison de l'accès de DTT, il est possible d'inclure une seconde étape d'équilibrage de l'IPG strips avant la seconde dimension avec un tampon qui contient de l'iodoacétamide.

5. Deuxième dimension SDS-polyacrylamide gel d'électrophorèse (Jour 5)

Toutes les étapes de cette section utilisent l'appareil d'électrophorèse Ettan DALTsix.

  1. Pour assembler l'appareil gel en poudre, nettoyer soigneusement tous les composants et veiller à ce que le gel poudre est de niveau et la fixation caoutchouc gris est lubrifié avec du gel de silicone. Mettez le bât blesse noirber arrêt triangulaire sur le fond. Ensuite, placer alternativement le séparateur et les plaques de verre avec la plaque de verre inférieure de face. Assurez-vous que les séparateurs sont à l'arrière et l'avant. Remplir l'espace restant avec les charges (environ 5 feuilles) de sorte que le sommet est plat. Mettez le panneau avant sur la pointe rouge à l'extérieur. Utilisez des pinces pour serrer chaque côté et serrer les vis du bas.
  2. Préparation du gel: Ajouter 297,3 ml de Duracryl, («ATTENTION» Duracryl est l'utilisation toxique écrans faciaux et des gants), 147 ml de tampon Tris 1,5 M pH 8,8, et 143,3 ml d'eau Milli-Q dans un ballon avec pointe à vide contenant un barre d'agitation. Mettre le couvercle sur le dessus et une solution mélanger à vitesse modérée avec le vide pendant 20 min. Le vide est utilisé pour dégazer la solution. Prendre un nouveau 10% de la solution de persulfate d'ammonium (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g d'APS à 2 ml d'eau Milli-Q.
  3. Ajouter le mélange de gel à la poudre de gel: Lorsque le vide est fait d'ajouter 6 ml de 10% de dodécylsulfate de sodium (SDS, 228,38 g / mol)sur le côté de la fiole pour éviter de mettre plus de bulles dans la solution. Ajouter APS, remuer, ajouter 0,25 ml de N, N, N ', N'-tétraméthyléthylènediamine (TEMED, 116,20 g / mol) («ATTENTION» TEMED est inflammable utilisation des écrans faciaux et des gants) et remuer.
  4. Verser le mélange de gel dans le gel à travers un entonnoir de coulée inséré à l'arrière de l'appareil. Verser jusqu'à un pouce en dessous de la plaque de court. Ajouter 1,5 ml de butanol saturé d'eau à la surface du gel et envelopper le dessus avec une pellicule pour éviter la déshydratation. Attendez pendant 1 heure pour assurer la pleine polymérisation.
  5. Vérification du gel: Lorsque le gel est fait (consultez le ballon), démonter le lanceur de gel par un évier. Vérifier l'intégrité du gel pendant le rinçage des plaques de verre avec de l'eau chaude, ne pas laisser l'eau entrer dans la plaque. Verser le butanol et rincer le haut de gel deux fois avec de l'eau pour se débarrasser de butanol. Remplissez le haut avec de l'eau à nouveau et laisser reposer si les gels ne sont pas utilisés immédiatement.
  6. Préparation des bandes: Préparer une solution de tampon d'équilibrage à partir de lacongélateur (6 M d'urée, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% de SDS, 0,002% de bleu de bromophénol). Cela peut être préalablement préparé et stocké dans des aliquotes de 10 ml à -20 ° C. Dissoudre 0,1 g de DTT à 10 ml d'une solution de tampon d'équilibrage. Un tube peut être utilisé pour deux bandes IPG. Placez les gels de la face de la bande vers le bas sur le tampon et laisser reposer pendant 30 min. Rappelez-vous ce qui est fin, qui.
  7. Préparation de l'unité d'électrophorèse (d'un appareil de séparation 2-D): Ajouter 4,5 L de 1x électrophorèse tampon (25 mM Tris Base [121,1 g / mol], 192 mM de glycine [288,38 g / mol], et 0,1% p / v de SDS [288,38 g / mol]) à la cuve en cours d'exécution. Ce tampon peut être utilisé pour un maximum de 3x. Mettez l'appareil d'électrophorèse sur. Vérifier le niveau d'eau dans la machine de refroidissement par eau et remplissez-le avec de l'eau si elle est faible. Allumez la machine, appuyez sur mode pour vérifier la température désignée, qui doit être de 10 ° C.
  8. Assurez 1 L de tampon 2x course et 1 L de 1x de tampon de migration et de les stocker à 4 ° C. Préparer une solution d'agarose-étanchéité: poids 0,25 g de agarose et le dissoudre dans 50 ml de tampon de 1x en cours d'exécution. Pulse pendant 15 secondes chacun.
  9. Mise en place de l'unité d'électrophorèse: Utilisez une pince à épiler à prendre sur chaque bande et retirer le tampon en excès des deux côtés de serviette en papier propre. NE PAS toucher les bandes. Verser l'eau sur le dessus du gel et la ligne du haut de gel avec un tampon de 1x courante. Utilisez des pinces propres et placer les bandes sur le dessus de la plaque longue, avec le côté gel face à vous. Ajouter tampon 1x pour les bandes à lubrifier. bandes de diapositives plus loin en utilisant des bandes en plastique. Retirez toutes les bulles entre la bande et le gel.
  10. Ajouter la solution d'agarose-étanche à la partie supérieure de la bande pour le sceller. Répéter pour le reste des bandes. Placez les plaques de verre contenant les gels en gel berceau et inférieure dans le réservoir de gel. S'assurer que le niveau de tampon 1x dans la chambre extérieure est sur la ligne de fond désigné avant de mettre la chambre supérieure sur.
  11. Placez le cadre pour chambre tampon supérieur sur les plaques de verre et de s'assurer qu'il est d'autant way descendre en appuyant sur le bas vers le bas. Utilisez un entonnoir et ajouter le tampon de migration 2x dans la chambre supérieure à la ligne médiane. Utilisez un entonnoir et ajouter tampon de course 1x à la chambre extérieure jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne du haut. Placer le couvercle sur le dessus et allumer l'appareil d'électrophorèse et le bloc d'alimentation.
  12. Exécutez la nuit à 52 V, 96 mA, 5 W. Vérifiez si le courant va en recherchant des bulles sur le fil d'argent vers le haut. Exécutez le gel jusqu'à ce que la ligne éditoriale est de 1 cm du fond.
  13. Les protéines peuvent également être analysées à l'aide du matériel et des réactifs d'autres sociétés telles BIORAD ou Hoefer, selon les instructions du fabricant.

6. Argent coloration des gels pour Gel visualisation (Jour 5-6)

  1. Préparer une solution d'une solution (800 ml d'éthanol, 200 ml d'acide acétique et 1,000 ml d'eau Milli-Q dans une hotte dans un seau en plastique). Solution est bonne pour 6 gels. Mettez toutes les machines hors tension et retirer la totalité de la section médiane de l'unité d'électrophorèse et d'unité centralell il dans l'évier. Mettre également à la barre blanche dans l'évier. Tirez sur le plateau supérieur contenant le tampon 2x en cours.
  2. Démonter l'appareil et retirer les gels à partir des plaques de verre dans la solution de correctifs 1. Les gels peuvent être identifiés en coupant les coins quand ils sont retirés des plaques de verre, le nombre de coins coupés correspondant à l'ordre de gel dans le lanceur.
  3. Placer le récipient avec la solution de correction et les gels sur un balancier pendant au moins 1 h à une nuit à 4 ° C.
  4. Transférer les gels de fixer Solution 2 (20 ml de glutaraldéhyde à 50%, 600 ml d'éthanol, 5 g de tétrathionate de potassium (302,46 g / mol), 136 g d'acétate de sodium (82,03 g / mol), et de l'eau Milli-Q à 2000 ml) et les déposer sur une bascule pendant 1 heure.
  5. Laver les gels 4x pendant 15 min chacun dans de l'eau Milli-Q.
  6. Colorer les gels dans la solution de nitrate d'argent (4 g de nitrate d'argent (169,87 g / mol), 500 ul de formaldehyde, et de l'eau Milli-Q à 2000 ml) pendant 30 min ou jusqu'à 48 h.
  7. Laver gel pour 1min dans de l'eau Milli-Q.
  8. Transférer à la solution de révélateur (60 g de carbonate de sodium (105,99 g / mol), 300 ul de formaldehyde, 15 mg de thiosulfate de sodium (158,11 g / mol), et de l'eau Milli-Q à 2000 ml) pendant 5 à 30 min jusqu'à ce que l' gel est coloré.
  9. Mettre les gels dans la solution d'arrêt (100 g de Tris-Base (121,14 g / mol), 40 ml d'acide acétique et de l'eau Milli-Q à 2000 ml) pendant 10 min.
  10. Pour le stockage, le transfert des gels à la solution de glycérol (40 ml du glycérol ou 400 ml si le stockage à long terme est nécessaire, et 1600 ml d'eau Milli-Q) pendant 10 min, puis les sécher à l'aide d'un sèche-gel.
  11. Gels peuvent être visualisées après coloration à l'aide de systèmes d'imagerie comme un scanner / densitomètre, photographié en utilisant transilluminateur lumière ou Gel imageur. Logiciel d'analyse de l'image, comme PDQuest analyse 2-D de BIORAD peut ensuite être utilisé pour obtenir des informations quantitatives et qualitatives de protéines dans un échantillon.

7. Gel coloration à l'argent pour l'analyse de spectrométrie de masse

  • Fixer les gels dans 50% de méthanol, et de l'acide acétique à 5% pendant 1 heure.
  • Laver à 50% de méthanol pendant au moins 10 min à une nuit.
  • Laver à l'eau distillée 3x pendant 10 min.
  • Sensibiliser avec du thiosulfate de 0,02% de sodium (158,11 g / mol) 2x pendant 15 min.
  • Laver pendant 3x dans REFRIGERE 3x de l'eau distillée pendant 10 min.
  • Immerger gel dans REFRIGERE solution de nitrate d'argent à 1% (169,87 g / mol) pendant au moins 20 min à 1 h à 4 ° C
  • Laver 2x pendant 1 min à l'eau distillée. Changer plateau / seau.
  • Développer dans 0,04% de formaldéhyde dans 2% de carbonate de sodium anhydre (105.99 g / mol) et jeter quand il devient jaune très rapide; avoir trois lots et être prêt à changer toutes les 5 min.
  • Laver dans de l'acide acétique à 5% puis stocker dans de l'acide acétique à 1%.
  • Rincer tubes de 1,5 ml Eppendorf (pour tenir obtenir place découpes) avec de l'éthanol de qualité USP et sécher à l'air avant de l'utiliser.
  • Pinces propres, lames de rasoir et des surfaces avec 100% de méthanol.
  • Des gants et des surfaces de pulvérisation avec de l'éthanol.
  • taches d'accise dans une hotte à flux ou de la zone de l'air pur. Les spots peuvent également être excisées en utilisant un couteau de place automatisé.
  • Mettez-les dans des tubes Eppendorf et bateau sur la glace ou de conserver dans le réfrigérateur.
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    Representative Results

    L'analyse comparative des profils protéiques extraites de la même culture bactérienne à deux reprises a montré des tendances similaires bandes indiquant les extractions de protéines succès. Protéines de poids moléculaire extraits variaient de 10 à 150 kDa. Montre la figure 1 représentant de Coomassie gel de coloration bleue des extractions de protéines à cellules entières de multivorans Burkholderia (un membre de la BCC) isolats cliniques cultivées en LB ou levure / Manitol (YEM) de bouillon et récoltées à partir de la phase stationnaire.

    Pour 2-D analyse par électrophorèse sur gel, 200 ug de protéines totales de Burkholderia pseudomallei a été utilisé (figure 2). Depuis cet agent pathogène est reconnu comme un type B agent de guerre biologique par les US Centers for Disease Control and Prevention 25, les procédures de préparation de protéines ont été réalisées en laboratoire Bio Niveau de sécurité 3 de confinement et en conséquence des procédures de fonctionnement standard.Les protéines ont été remises en suspension dans une solution de réhydratation et appliqué à une longueur de 24 cm immobilisées pH 7.4 gradient et les protéines ont été séparés en fonction de leur point isoélectrique (pI). Ensuite, les bandes ont été placés sur un gel et les protéines par SDS-polyacrylamide ont été séparés en fonction de leur poids moléculaire (MW). Par la suite, le gel a été coloré à l'argent pour la protéine endroit visualisation. Les résultats ont montré l'abondance de plus de 500 spots protéiques qui peuvent être identifiés individuellement par spectrométrie de masse.

    Figure 1
    Figure 1. Total des profils protéiques de multivorans Burkholderia isolats. Analyse SDS-PAGE de protéines extraites à partir de la phase stationnaire D-2214 et D-2094 isolats cultivés dans du milieu LB ou de levure / Mannitol (YEM) de bouillon en deux occasions différentes (1 et 2). 4 pg de protéine ont été chargés dans chaque voie d'un gel de 12,5% et colorées with bleu de Coomassie. Lane M, marqueur de la protéine.

    Figure 2
    Figure 2. 2-D analyse par électrophorèse sur gel de Burkholderia pseudomallei 1234B isoler. 2-D gel montrant la séparation des protéines représentant de coloration à l'argent dans le pi 4 à 7 bande-gamme. Le total des extraits protéiques de cellules (200 ug) à la phase stationnaire ont été utilisés et séparés sur un gel SDS-PAGE à 15%.

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    Discussion

    Procédé de préparation de protéines a été décrite qui peut extraire la majorité des protéines Burkholderia avec une bonne reproductibilité. Ceci est démontré par l'obtention du même profil de protéine à partir de deux préparations indépendantes réalisées en différents jours en utilisant la même culture bactérienne cultivée dans un bouillon LB ou de YEM comme représenté sur la figure 1. Extraction était efficace pour les bactéries cultivées dans un milieu liquide, mais nous n'avons pas testé cette méthode pour les bactéries cultivées sur des plaques. Cette méthode a également été utilisée pour une caractérisation de protéines en utilisant des outils protéomiques, notre groupe a étudié avec succès les modifications du protéome en utilisant un gel d'électrophorèse 2D et isotope marquage pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) techniques protéomiques 15,23,24. Dans ce dernier cas, les protéines ont été extraites dans un tampon contenant 0,5 M d'EDTA dans du PBS afin d'éviter toute interférence de PMSF avec les expériences iTRAQ 15.

    Il est important de remarche que pendant le processus d'extraction de protéines et électrophorèse sur gel 2-D, toutes les mesures doivent être effectuées à 4 ° C ou dans des conditions de froid à l'aide de seaux à glace pour minimiser la dégradation des protéines, ainsi que d'utiliser des conseils branchés et porter des gants en nitrile et couvrir tous les la peau pour empêcher la contamination de la kératine des spots découpée pour identification ultérieure par spectrométrie de masse. Lors de l'extraction de protéines, il est également important de considérer que le PMSF a un temps de demi-vie courte dans des solutions aqueuses, selon le fabricant, donc la solution à 0,1 mM dans de l'acétone doit être faite immédiatement avant l'utilisation. En variante, d'autres inhibiteurs de sérine-protéase ou des inhibiteurs de qui sont plus solubles et stables, et moins toxiques peuvent être utilisés, bien que nous ne les avons pas testés dans nos expériences.

    Le tampon de lyse utilisé dans ce procédé ne contient pas d'urée, ce qui est important pour la solubilisation pour extraire les deux protéines (cytosol) aqueux et prot moins solubleeins, y compris des protéines de la membrane 17. Mais, lors de la préparation de l'échantillon pour la première dimension isoélectrofocalisation (étape 3 du présent protocole), les échantillons sont remises en suspension dans un tampon de réhydratation qui contient de l'urée. D'autres techniques de protéomique impliquent également un traitement similaire 26. Avant de suivre à l'étape de réhydratation, il semble que l'élimination de matières étrangères ou les impuretés de faible poids moléculaire est essentielle pour une grande résolution, nous recommandons d'utiliser le kit 2-D Clean-up dans chaque échantillons de protéines que les résultats améliorés. Chargement Auparavant, les échantillons pour la première dimension isoélectrique séparation mise au point, assurez-vous d'avoir des bandes préparées de papier buvard de la taille droit des porteurs de bande, comme ce qui est problématique pour couper à la bonne taille à la mode aseptique sur place (pour l'étape 3.4 de la présente protocole).

    Avant l'exécution d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS 2-D, il est nécessaire de veiller à ce que le pourcentage de gel correspond aux tailles attendues d'intérêt (une 120,5% gel de pourcentage de protéine peut résoudre dans l'intervalle de 14-100 kDa). Après la deuxième électrophorèse en gel de dimension est terminée, la visualisation de protéines peut être réalisée par coloration au bleu de Coomassie ou à l'argent, la seconde coloration est plus sensible à la limite de détection est aussi faible que 0,1 ng / protéines / endroit 20. les taches de protéines visualisées par coloration à l'argent sont adaptés pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse. Cependant, il est important de mentionner que la solution de colorant à l'argent ne doit pas contenir le glutaraldéhyde car cet agent réticulant avec des protéines, par conséquent, il n'est pas compatible avec une analyse ultérieure par spectrométrie de masse 20. Sinon, pour détecter et quantifier les protéines exprimées de façon différentielle, une autre approche à base de gel comme deux dimensions de différence de gel d'électrophorèse (2D-DIGE) avec un logiciel automatisé peut être utilisé. Cette approche s'appuie sur les balises fluorescentes distinctes (par exemple, Cy 3, 5 et 2) qui sont utilisés pour des échantillons d'étiquettes et un pr étalon interne universelior au second dépassement d'électrophorèse dimension, dans une certaine mesure, les inconvénients de variation et la reproductibilité de l'électrophorèse 2-D 27. En outre, les gels peuvent être colorés après la seconde dimension avec SyproRuby, qui est un colorant chélate de ruthénium organométallique conçu pour des applications protéomiques. Il peut détecter les taches de protéines avec une sensibilité similaire à celle coloration à l'argent, mais avec une plus grande sensibilité que le bleu de Coomassie. Après gels de coloration peuvent être photographiés avec scanner laser ou diaphanoscope 28.

    En conclusion, cette vidéo décrit une protéine bactérienne procédure d'extraction à cellules entières et 2-D méthode d'électrophorèse sur gel qui peut permettre l'étude des changements globaux dans le protéome en espèce Burkholderia.

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    Disclosures

    Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

    Acknowledgements

    Ce travail a été soutenu par une bourse de l'Université de la Colombie-Britannique (à BV) et des subventions de Fibrose kystique Canada et du Canada Instituts de recherche en santé (DPS) à. Nous remercions Jacqueline Chung pour la préparation initiale de protocoles.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
    Acetone Fisher A18-1 Flammable
    PBS Buffer Bioscience R028
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
    Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
    Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
    MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
    Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
    2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
    Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
    CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
    Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
    Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
    Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
    Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
    N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
    Agarose Invitrogen 15510-027
    Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
    Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
    Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
    Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
    Sodium acetate EM Science 7510
    Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
    Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
    Sodium thiosulfate Sigma S7026
    Tris Base EMD 9230
    Glycine MPBiomedical, LCC 808831
    Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
    Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
    Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
    Mineral oil ACROS 415080010
    Equipment
    JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
    Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
    Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
    Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

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    References

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