Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

De leden van het Burkholderia geslacht zijn ziekteverwekkers van klinisch belang. We beschrijven een werkwijze voor het totaal bacterieel eiwit extractie met mechanische verbreking en 2-D gelelektroforese voor daaropvolgende proteoomanalyse.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Velapatiño, B., Zlosnik, J. E., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het onderzoek naar de intracellulaire eiwit niveaus van bacteriële species van belang voor het begrip van de pathogene mechanismen van ziekten veroorzaakt door deze organismen. Hier beschrijven we een werkwijze voor eiwitextractie uit Burkholderia species gebaseerd op mechanische lysis gebruik van glazen kralen in aanwezigheid van ethyleendiaminetetra-azijnzuur en fenylmethylsulfonylfluoride in met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende soorten Burkholderia, voor verschillende groeiomstandigheden en het is waarschijnlijk geschikt voor gebruik in proteomische studies van andere bacteriën. Na eiwitextractie, is een twee-dimensionale (2-D) gelelektroforese proteomics techniek beschreven mondiale veranderingen studeren in de proteomen van deze organismen. Deze werkwijze bestaat uit de scheiding van eiwitten naar hun iso-elektrisch punt van iso-elektrische focussering in de eerste dimensie, gevolgd door scheiding op basis van molecuulgewichtdoor acrylamide gelelektroforese in de tweede dimensie. Visualisatie van gescheiden eiwitten wordt uitgevoerd door zilverkleuring uitgevoerd.

Introduction

Het geslacht Burkholderia bestaat uit meer dan 62 soorten, Gram-negatieve organismen geïsoleerd uit een breed scala van niches, en is verdeeld in twee clusters 1,2. De eerste cluster omvat mens, dier en phytotrophic organismen, en de meeste studies hebben zich gericht op de pathogene soorten van deze groep vanwege hun klinisch belang. De meeste pathogene leden zijn B. pseudomallei en B. mallei (die melioïdose en kwade droes respectievelijk veroorzaakt) 3,4 en opportunistische pathogenen (de 17 gedefinieerde soorten van het Burkholderia cepacia complex, BCC) 5, die ziekte bij cystic fibrosis (CF) en chronische granulomateuze ziekte (CGD) veroorzaken 1. De tweede cluster met meer dan 30 niet-pathogene species omvat bacteriën geassocieerd met planten of met de omgeving, en worden beschouwd als potentieel gunstig voor de gastheer 2.

Talrijke complicaties ontstaan ​​frOM bacteriële infectie met pathogene leden van het genus Burkholderia, zoals overdracht van het pathogeen tussen patiënten, verspreiding van de ziekte en het falen van de behandeling vanwege de intrinsieke of verworven resistentie tegen antibiotica die hardnekkig in de meeste gevallen 6-9. Derhalve verkrijgen van een beter begrip van de basis voor vaststelling van bacteriële infecties is essentieel voor de behandeling van ziekten veroorzaakt door deze organismen. Om inzicht te krijgen in de totstandkoming van de infectie te krijgen, zijn uitgebreide onderzoek naar de bacteriële componenten in verband met pathogenese nodig. Studies gericht op de proteomics analyse van Burkholderia organismen met behulp van proteomics methoden beschreven eiwitten die zijn betrokken bij bacteriële pathogenese alsook veranderingen in hun proteoom profielen 10-16.

Eiwit extractiemethoden middels sonicatie en bevroren en ontdooid cycli lysisbuffer die hoge concentration van ureum, heeft thiourea in combinatie met een schoonmaakmiddel en amfolyten toegepast in Burkholderia proteomics studies 10-13. Hoewel ureum is zeer efficiënt voor eiwitdenaturatie kan een evenwicht te bereiken in waterige oplossing met ammonium-isocyanaat, die kunnen reageren met aminozuurgroepen, onder vorming van artefacten (carbamylering reactie) 17. Daarom wordt aanbevolen drager amfolyten, die als cyanaat vangers omvatten en temperaturen boven 37 ° C 17 voorkomen. Bovendien, elke chemische interferentie lysisbuffer met eiwitten kwantificering voorkomen, dezelfde lysisbuffer kan worden gebruikt om de standaardkromme te genereren zodat de monsters en standaarden hebben dezelfde achtergrond 10. Andere methoden omvatten het gebruik van alkalische buffers en wasmiddelen met warmte incubatieperiode 17,18, maar deze voorwaarden kunnen veranderingen in het proteoom induceren en sommige wasmiddelen zijn niet compatibel met proteomics aanvraag, tenzij latere detergensverwijdering stappen zijn inbegrepen 17,18.

Na voldoende extractie en kwantificering kunnen globale eiwitexpressie van elk individueel eiwit worden onderzocht door proteoomanalyses zoals twee-dimensionale (2-D) gelelektroforese. Deze techniek werd eerst beschreven door O'Farell 19 en uit de scheiding van eiwitten op basis van hun iso-elektrisch punt van iso-elektrische focussering in de eerste dimensie, en vervolgens naar hun molecuulgewicht van acrylamide gel elektroforese in de tweede dimensie. Door de resolutie en gevoeligheid van deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de analyse en detectie van eiwitten uit complexe biologische bronnen 19,20. Deze scheidingstechniek is beschikbaar als eiwit-centric aanpak met het grote voordeel van het oplossen eiwit isovormen veroorzaakt door post-transcriptionele modificaties of proteolytische bewerking. Kwantitatieve veranderingenkan worden gedetecteerd door vergelijking van de intensiteit van de overeenkomstige plek na kleuring van de gel 20. Echter is deze techniek niet geschikt voor de identificatie van zeer grote eiwitten, membraaneiwitten, zeer basische en zure of hydrofobe eiwitten, en is een enigszins moeizame en tijdrovende techniek 20. Nieuw peptide-centrische benadering (niet gel-gebaseerde) die robuuster en objectieve beschikbaar zijn en kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve vergelijking van differentiële stabiele isotopen methoden zoals cysteïne etikettering isotoop gecodeerde affiniteit tagging (ICAT) 21 en aminogroep etikettering door isotoop tagging voor relatieve en absolute kwantificatie (iTRAQ) 22. Het gebruik van een enkele proteomics techniek kan onvoldoende informatie geven, daarom het gebruik van twee complementaire benaderingen proteomics is noodzakelijk voor de meeste volledig om veranderingen in de proteoom. Niettemin is 2-D gelelektroforese gebruikte en kan routinematig worden toegepast hoeveeltieve expressie van verschillende eiwitten in verschillende organismen.

Hier beschrijven we een whole-cell eiwitextractie en 2-D gel elektroforese procedures voor Burkholderia soorten die werden aangepast en geoptimaliseerd van de GE Healthcare 2-D elektroforese Principes en methoden Handboek 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Het eiwit extractie werd uitgevoerd met een kraal klopper glaskralen in aanwezigheid van PBS met 5 mM EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) en 1 mM PMSF (fenylmethylsulfonylfluoride). Deze procedure maakt kwantificering van eiwitten met minimale degradatie en bewerkbaar voor proteomische benaderingswijzen zoals eerder gemeld 15,23,24. 2-D gelelektroforese werd uitgevoerd met 24 cm lang geïmmobiliseerde pH gradiënt 4-7 en eiwitten werden gescheiden op basis van hun iso-elektrisch punt. Daarna werden eiwitten gescheiden volgens hun Molecular gewicht door SDS-polyacrylamide gel. Verder beschrijven we een zilverkleuring werkwijze voor visualisatie van spot eiwitten en een zilverkleuring methode die compatibel massaspectrometrie analyse. Samen vormen deze procedures kunnen de identificatie van belangrijke eiwitten uit Burkholderia soorten die kunnen worden betrokken bij de pathogenese staan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultuur Groei (dagen 1 +2)

  1. Groeien een starter cultuur: 3 ml Luria Bertani (LB) bouillon in een handomdraai top 15 ml tube, bij 37 ° C gedurende de nacht rotator. Verdunnen groei gedurende de nacht om een OD 600 van 0,6. Voeg 1 ml van deze verdunning met 100 ml LB-medium in een 250 ml erlenmeyer. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm gedurende 16 uur in de stationaire fase (SP), een betere benadering, in batch cultuur, infectie omstandigheden onder controle van de stationaire fase signaal factoren zoals RPO en quorum te zorgen dat bacteriële virulentiefactoren detectie, worden uitgedrukt. Als alternatief kunnen de bacteriën gekweekt in een vroeg SP of mid-of late-logaritmische fase worden gebruikt om informatie over de bacteriële adaptatie fase krijgen.
  2. Na 16 uur meten van de OD 600 en zorgen de cultuur SP bereikt in vergelijking met een eerder geconstrueerde groeicurve onder identieke omstandigheden.

2. Eiwitextractie (dag 3)

  1. Bereid verse 0.1 M fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF, 174,19 g / mol) oplossing in aceton door het oplossen van 0,0174 g PMSF ('LET OP' PMSF is giftig en bijtend, gebruik gezicht schilden en handschoenen) in 1 ml aceton ('LET OP' aceton is giftig en brandbaar, gebruik gezicht schilden en handschoenen).
  2. Maak een PBS / EDTA / PMSF-oplossing: 0,1 ml 0,1 M PMSF, 0,1 ml 0,5 M EDTA en 9,8 ml PBS. Controleer de OD van de 16 uur cultuur is ongeveer waar het zou moeten zijn in de SP.
  3. Neem 35 ml van de bacteriële cultuur en overbrenging naar een Oakridge centrifugebuis en centrifugeer de kweken bij 4500 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
  4. Verwijder supernatant naar een afvalcontainer en35 ml gekoelde PBS en resuspendeer de pellet. Centrifugeer opnieuw bij 4500 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
  5. Verwijder de supernatant en resuspendeer in 1 ml koude PBS. Transfer naar steriel 2 ml Eppendorf centrifuge en 1 min te hoog in de microcentrifuge bij 14.000 x g bij 4 ° C. Supernatans verwijderen en afvoeren.
  6. Voeg 1 ml PBS / EDTA / PMSF oplossing, resuspendeer de pellet en overbrengen in een 2 ml schroefdop buis (met o-ring) met ~ 0,5 ml glazen kralen (gesteriliseerde). Voeg de geresuspendeerde pellet aan de buis met de glazen kralen en kralen rammen ze bij 4 ° C gedurende 1 min in koude kamer. Doe dit 3x, waardoor het monster op het ijs na elke dreun.
  7. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 1 min in microcentrifuge. Verwijder de bovenstaande vloeistof en zet het in een steriele 5 ml polystyreen buis.
  8. Voor het verhogen van de opbrengst voeg 1 ml PBS / EDTA / PMSF oplossing voor dezelfde buis bevatten glasparels weer. Kraal bash de buis bij 4 ° C gedurende 1 minuut. Doe dit 2x zetten het monster op het ijs after bash. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende een minuut op de centrifuge en verwijder het supernatant en toe te voegen aan bovenstaande vanaf stap 2.8. Gebruik een 1 ml spuit en een 0,20 pm filter het supernatans van de polystyreen buis naar een nieuwe steriele 2 ml Eppendorf buis.
  9. Op dit punt de monsters moeten worden getest op eiwit hoeveelheid via de Pierce MicroBCA eiwit extractie kit en aliquots van 200 ug dient te worden ingevroren -80 ° C totdat ze nodig waren.

3. Monstervoorbereiding (Dag 4)

  1. Bereid 25 ml rehydratie stockoplossing (8 M ureum, 2% CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% broomfenolblauw) en op te slaan in 2,5 ml fracties bij -20 ° C. Voeg 7 mg dithiothreitol (DTT, 154.2 g / mol) juist voor gebruik met een 2,5 ml aliquot van rehydratatie stamoplossing.
  2. Werkwijze ontdooide monsters van stap 2.10 een 2-D opruimen kit met uiteindelijke hersuspenderen in 450 pl rehydratatie voorraadoplossing bereid in stap 3.1.

4. Eerste-Dimensie focussering (IEF) (Dag 4)

Alle stappen in deze sectie zijn met behulp van de Ettan IGPhor IEF System.

  1. Het opzetten van de IPG eerste dimensie strips: schoon strip houders met strip reinigingsmiddel en daarna wassen met Milli-Q water, laat ondersteboven te drogen. Elk monster toewijzen aan een gel strip houder nummer.
  2. Laad het monster van rehydratie stap in de tweede bredere gebied van de (-) uiteinde. Gebruik schone tang om gelstroken trekken uit de verpakking. Neem beschermende laag van gel strips. Line strips ruwe kant naar beneden in een langzame, glijdende beweging om de stroken natte langs de weg uit te krijgen (-) einde aan (+) einde.
  3. Zet vochtig vloeipapier met gesteriliseerd water op de top van de elektrode en onder de gel strips burnout te voorkomen. Pincet Spoel in-tussen de rondes met gezuiverd water en ethanol. Verwijder alle bellen, overlay dun met minerale olie droog outs te voorkomen. Lijn de gel strip houders op de machine.
  4. Run 12 uur bij 20 ° C gedurende rehydrantsoen, 1 uur bij 200 V, 1 uur bij 500 V, 1 uur bij 1000 V, 0,5 uur bij 4000 V, 12 uur bij 8000 V, 24 uur houden op 300 V en kan worden afgesloten op dit moment.
  5. Na IEF is voltooid, is het raadzaam om de tweede dimensie SDS-polyacrylamidegelelektroforese voeren, tenzij de IPG strip worden bij -80 ° C in Saran Wrap bedekt met minerale olie voor toekomstige analyse bevroren. Alternatief, om te voorkomen punt strepen door DTT toegang is het mogelijk een tweede stap equilibratie van de IPG strips vóór de tweede dimensie met een buffer die iodoacetamide bevat omvatten.

5. Tweede dimensie SDS-polyacrylamidegelelektroforese (Dag 5)

Alle stappen in deze sectie zijn met behulp van de Ettan DALTsix elektroforese apparaat.

  1. Om de gel caster apparaat monteren, grondig alle onderdelen schoon te maken en ervoor te zorgen dat gel caster waterpas en de grijze rubberen band wordt gesmeerd met siliconen gel. Zet de zwarte rubber driehoekige stopper aan de onderzijde. Nadien afwisselend plaats de afscheider en de glasplaten met de kortere plaat van glas naar voren gericht. Zorg ervoor dat de scheiders zijn aan de achterkant en de voorkant. Vul de resterende ruimte met de vulstoffen (ongeveer 5 vellen) zodat de bovenkant is vlak. Plaats het voorpaneel van het rode uiteinde aan de buitenkant. Gebruik de klemmen aan beide zijden vast en draai de onderste schroeven.
  2. Voorbereiden van de gel: Voeg 297,3 ml Duracryl, ('LET OP' Duracryl is giftig gebruik gezicht schilden en handschoenen), 147 ml Tris buffer 1,5 M pH 8,8 en 143,3 ml Milli-Q water in een kolf met vacuüm tip dat een roerstaafje. Doe het deksel op de top en meng oplossing met matige snelheid met het vacuüm op gedurende 20 minuten. Het vacuüm wordt gebruikt om gas dE de oplossing. Voeg een nieuwe 10% ammoniumpersulfaat oplossing (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g APS om 2 ml Milli-Q water.
  3. Het toevoegen van het gel mengsel de gel caster: Wanneer vacuüm wordt gedaan voeg 6 ml 10% natriumdodecylsulfaat (SDS, 228,38 g / mol)aan de zijkant van de kolf om te vermijden dat meer bubbels in de oplossing. APS toevoegen, roeren, voeg 0,25 ml N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED, 116,20 g / mol) (' LET 'TEMED is ontvlambaar gebruik gezicht schilden en handschoenen) en roer.
  4. Giet het mengsel in gel gel loopwiel door een trechter geplaatst aan de achterkant van het apparaat. Giet tot een centimeter onder de korte plaat. Voeg 1,5 ml met water verzadigde butanol naar de top van de gel en wrap top met Saran Wrap om uitdroging te voorkomen. Wacht 1 uur volledige polymerisatie te waarborgen.
  5. Controle van de gel: Wanneer de gel wordt gedaan (check de kolf), demonteer de gel caster door een wastafel. Controleer op gel integriteit terwijl het spoelen van de glazen platen met warm water, laten het water niet aan de plaat in te voeren. Giet de butanol en spoel de top van gel tweemaal met water om zich te ontdoen van butanol krijgen. Vul het bovenste weer met water en laat zitten als de gels zijn niet meteen gebruikt.
  6. Voorbereiden van de strips: Bereid equilibreerbuffer oplossing uit devriezer (6 M ureum, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% SDS, 0,002% broomfenol blauw). Dit kan voorbereide en opgeslagen in 10 ml porties worden bij -20 ° C. Los 0,1 g DTT een 10 ml equilibratiebuffer oplossing. Een buis kan worden gebruikt voor twee IPG strips. Plaats de gels van de strip gezicht naar beneden op de buffer en laat zitten voor 30 minuten. Vergeet niet welk einde is welke.
  7. Voorbereiden elektroforese-eenheid (2-D scheidingsapparaat) Voeg 4,5 L van 1x elektroforese buffer (25 mM Tris Base [121,1 g / mol], 192 mM Glycine [288,38 g / mol], en 0,1% w / v SDS [288,38 g / mol]) aan de lopende tank. Deze buffer kan worden gebruikt tot 3x. Draai het elektroforeseapparaat op. Controleer het waterniveau in waterkoeling machine en vul het met water als het laag is. Zet het apparaat aan, drukt u op mode naar de aangewezen temperatuur, die moet 10 ° C. Controleer
  8. Voeg 1 L 2x lopende buffer en 1 l 1X loopbuffer en opgeslagen bij 4 ° C. Make-agarose afdichting oplossing: gewicht 0,25 g agarose en los op in 50 ml 1 x loopbuffer. Pulse 15 seconden elk.
  9. Het opzetten van het elektroforeseapparaat: Gebruik een pincet tot het afsluiten van elke strip en verwijder de overtollige buffer aan beide zijden met een schone papieren handdoek. Raak de strips NIET aan. Giet het water op de top van de gel en lijn de gel top met 1x lopende buffer. Gebruik schone pincet en plaats de strips op de bovenkant van de lange plaat, met de gel zijde naar u toe. Toevoegen 1x buffer om de stroken te smeren. Slide strips verder naar beneden door het gebruik van plastic strips. Verwijder alle luchtbellen tussen de strip en de gel.
  10. Add-agarose afdichting oplossing naar de top van de strip te verzegelen. Herhaal de rest van de stroken. Plaats de glazen platen met de gels in gel cradle en lager in de gel tank. Zorg ervoor dat de 1x buffer niveau in de buitenste kamer is op de aangewezen onderste regel voordat de bovenste kamer op.
  11. Plaats het frame voor bovenste bufferruimte op de top van de glasplaten en zorgen het is allemaal de way naar beneden door op de onderkant naar beneden. Gebruik een trechter en voeg de 2x running buffer in de bovenste kamer tot aan de middenlijn. Gebruik een trechter en voeg 1x running buffer om de buitenste kamer tot aan de bovenste lijn bereikt. Plaats het deksel op de top en zet de elektroforese toestel en de power pack.
  12. Lopen 's nachts bij 52 V, 96 mA, 5 W. Controleer of de stroom gaat door op zoek naar bubbels op de zilveren draad bij de top. Voer de gel tot de leidende lijn is 1 cm van de onderkant.
  13. Eiwitten kunnen ook worden geanalyseerd met behulp van apparatuur en reagentia van andere bedrijven BIORAD of Hoefer, volgens de instructies van de fabrikant.

6. Zilverkleuring van de gels van Gel Visualization (dag 5-6)

  1. Bereid een oplossing paraat 1 (800 ml ethanol, 200 ml azijnzuur en 1000 ml Milli-Q water in zuurkast in een plastic emmer). Oplossing is goed voor 6 gels. Draai alle machines uit en neem de hele middelste gedeelte van het elektroforeseapparaat en pull in de gootsteen. Ook zet de witte stand in de gootsteen. Trek de bovenste lade met de 2x running buffer.
  2. Demonteer het apparaat en verwijder de gels van de glasplaten in fix oplossing 1. Gels kunnen worden geïdentificeerd door het afsnijden van hoeken wanneer ze uit de glasplaten, het aantal bezuinigen overeenkomt met de gel orde in het zwenkwiel.
  3. Plaats de houder met de fix oplossing en gels op een rocker ten minste 1 uur tot een nacht bij 4 ° C.
  4. Breng de gel aan oplossing 2 vast (20 ml 50% glutaaraldehyde, 600 ml ethanol, 5 g kalium tetrathionaat (302,46 g / mol), 136 g natriumacetaat (82,03 g / mol) en Milli-Q water 2000 ml) en plaats op een wip voor 1 uur.
  5. Was de gels 4x 15 minuten elk in Milli-Q water.
  6. Vlekken op de gels zilvernitraatoplossing (4 g zilvernitraat (169,87 g / mol), 500 ui formaldehyde en Milli-Q water tot 2000 ml) gedurende 30 minuten of tot 48 uur.
  7. Was gel voor 1min in Milli-Q water.
  8. Transfer ontwikkelaar oplossing (60 g natriumcarbonaat (105,99 g / mol), 300 gl formaldehyde, 15 mg natriumthiosulfaat (158,11 g / mol) en Milli-Q water tot 2000 ml) gedurende 5-30 min tot de gel is gekleurd.
  9. Zet de gels Stop Solution (100 g Tris-Base (121,14 g / mol), 40 ml azijnzuur en Milli-Q water tot 2000 ml) gedurende 10 minuten.
  10. Voor de opslag, overdracht van de gels aan glycerol oplossing (40 ml glycerol of 400 ml als lange termijn opslag gewenst is, en 1600 ml Milli-Q water) gedurende 10 minuten en droog ze met behulp van een gel droger.
  11. Gels kunnen worden gevisualiseerd na kleuring met behulp van beeldvormende systemen, zoals een scanner / densitometer, gefotografeerd met behulp van licht transilluminator of Gel imager. Image Analysis software zoals PDQuest 2-D analyse van BIORAD kan dan worden gebruikt om kwantitatieve en kwalitatieve informatie te verkrijgen van proteïnen in een monster.

7. Gel Zilverkleuring voor massaspectrometrie Analyse

  • Bevestig de gel in 50% methanol en 5% azijnzuur gedurende 1 uur.
  • Was in 50% methanol gedurende ten minste 10 minuten een nacht.
  • Wassen in gedestilleerd water 3x gedurende 10 minuten.
  • Sensibiliseren met 0,02% natriumthiosulfaat (158,11 g / mol) 2x gedurende 15 minuten.
  • Wassen 3x in CHILLED gedestilleerd water 3x gedurende 10 minuten.
  • Dompel gel GEKOELD 1% zilvernitraatoplossing (169,87 g / mol) gedurende ten minste 20 min tot 1 uur bij 4 ° C
  • Wash 2x 1 min met gedestilleerd water. Wijzig lade / emmer.
  • Ontwikkelen op 0,04% formaldehyde in 2% natriumcarbonaat watervrij (105,99 g / mol) en gooi als blijkt geel vrij snel; hebben drie partijen en klaar zijn om elke 5 minuten te veranderen.
  • Was in 5% azijnzuur bewaar in 1% azijnzuur.
  • Spoel 1,5 ml Eppendorf buizen (om vast te houden krijgen spot cut-outs) met USP ethanol en drogen aan de lucht voor gebruik.
  • Schoon pincet, scheermesjes en oppervlakken met 100% methanol.
  • Spray handschoenen en oppervlakken met ethanol.
  • Accijnzen plekken in een stroming kap of schone lucht gebied. Locaties kunnen worden uitgesneden met een geautomatiseerde snij plek.
  • Doe ze in Eppendorf buizen en schip op ijs of in de koelkast bewaren.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Vergelijkende analyse van eiwitprofielen geëxtraheerd uit dezelfde bacteriecultuur op twee verschillende gelegenheden toonde vergelijkbare patronen streepvorming aangeeft succesvol eiwitextracties. Molecuulgewicht eiwitten geëxtraheerd varieerde 10-150 kDa. Figuur 1 toont representatieve Coomassie blauwkleuring gel van de gehele cel proteïne extracten uit Burkholderia multivorans (een lid van de BCC) klinische isolaten gekweekt in LB of gist / Manitol (YEM) bouillon en geoogst uit stationaire fase.

    Bij 2-D gelelektroforese analyse, 200 ug totaal eiwit uit Burkholderia pseudomallei werd gebruikt (figuur 2). Aangezien deze ziekteverwekker wordt erkend als een B-type biologische oorlogvoering middel door de Amerikaanse Centra voor de Controle en de Preventie van 25 Ziekte, werden eiwitbereiding procedures in Bio Safety Level 3 containment laboratorium en dus met standaard operatie procedures.Eiwitten werden geresuspendeerd in rehydratie oplossing en aangebracht op een 24 cm lang geïmmobiliseerde pH gradiënt 4-7 en eiwitten werden gescheiden op basis van hun iso-elektrisch punt (pI). Vervolgens werden stroken op een SDS-polyacrylamidegel en proteïnen geplaatst werden gescheiden op basis van hun molecuulgewicht (MW). Vervolgens gel was zilver gekleurd voor het eiwitpunt visualisatie. De resultaten toonden de overvloed van meer dan 500 eiwitvlekken die afzonderlijk kunnen worden geïdentificeerd door massaspectrometrie.

    Figuur 1
    Figuur 1. Totaal eiwitprofielen van Burkholderia multivorans isolaten. SDS-PAGE-analyse van eiwitten geëxtraheerd in de stationaire fase uit D-2214 en D-2094 isolaten gekweekt in LB of gist / Manitol (YEM) bouillon op twee verschillende gelegenheden (1 en 2). 4 ug eiwit werden in elke laan van een 12,5%-gel en gekleurd with Coomassieblauw. Laan M, eiwit marker.

    Figuur 2
    Figuur 2. 2-D gel-elektroforese analyse van Burkholderia pseudomallei 1234B isoleren. Vertegenwoordiger-zilver gekleurde 2-D gel die scheiding van eiwitten in de PI 4-7 bereik strip. Whole-cell eiwitextracten (200 ug) in de stationaire fase werden gebruikt en gescheiden op een 15% SDS-PAGE gel.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Werkwijze voor eiwitten preparaat beschreven dat de meeste Burkholderia eiwitten met goede reproduceerbaarheid kan halen. Dit wordt aangetoond door het verkrijgen van hetzelfde eiwit profiel van twee onafhankelijke preparaten uitgevoerd op verschillende dagen met dezelfde bacteriële kweek in LB bouillon of YEM zoals getoond in figuur 1. Extractie was efficiënt voor bacteriën gekweekt in vloeibare media, maar we hebben niet deze methode getest op bacteriën gekweekt op platen. Deze werkwijze werd ook gebruikt voor andere eiwit karakterisatie dmv proteoomanalyse instrumenten; onze groep succesvol proteoom veranderingen bestudeerd met 2-D gelelektroforese en isotoop tagging voor relatieve en absolute kwantificatie (iTRAQ) proteomica 15,23,24. Voor deze laatste werden eiwitten geëxtraheerd in een buffer die 0,5 M EDTA in PBS om elke inmenging van PMSF met de iTRAQ experimenten te voorkomen 15.

    Het is belangrijk remark dat tijdens het eiwit extractieproces en 2-D gelelektroforese alle stappen worden uitgevoerd bij 4 ° C of koude omstandigheden met ijs juist om eiwitafbraak te beperken, alsmede aangesloten spuittips en draag nitril en betrekking uitgevoerd huid keratine besmetting van een vlekken voorkomen geknipt voor latere identificatie met behulp van massaspectrometrie. Bij het uitvoeren eiwitextracties, is het ook belangrijk om te overwegen dat de PMSF heeft een korte halfwaardetijd in waterige oplossingen volgens de fabrikant, derhalve 0,1 mM voorraadoplossing in aceton onmiddellijk vóór gebruik worden gemaakt. Alternatief kunnen andere serine-remmers of proteaseremmers die meer oplosbaar en stabiel en minder toxisch gebruikt, hoewel we niet getest in onze experimenten.

    De lysisbuffer die in deze procedure niet ureum, wat belangrijk is voor het oplosbaar zowel water (cytosol) eiwitten en minder oplosbare extract bevatten proteins, met inbegrip van sommige membraaneiwitten 17. Maar, tijdens de voorbehandeling voor de eerste dimensie focussering (stap 3 van dit protocol), monsters worden opnieuw gesuspendeerd in rehydratatie buffer die ureum bevat. Andere proteomics technieken omvatten ook een soortgelijke behandeling 26. Voordat u met de rehydratatietrap, lijkt het erop dat het verwijderen van storende materialen of laag moleculair gewicht onzuiverheden is cruciaal voor hoge resolutie, raden we aan om de 2-D Clean-up kit te gebruiken in elk eiwit monsters resultaten verbeterd. Eerder het laden van de monsters voor de eerste dimensie focussering scheiding, zorg ervoor om voorbereid stroken vloeipapier de juiste grootte van de strip houders, want dit is problematisch om de juiste grootte in aseptische manier ter plaatse te snijden (voor stap 3.4 van deze protocol).

    Voordat u een 2-D SDS-polyacrylamide gelelektroforese, dient ervoor te zorgen dat de gel percentage past de verwachte groottes van belang (a120,5% percentage gel kunnen eiwitten oplossen in het bereik van 14-100 kDa). Na tweede dimensie gel elektroforese voltooid, kan visualisatie van eiwitten worden bereikt door Coomassie blauw of zilverkleuring, de laatste kleuring is gevoelig detectiegrens is zo laag als 0,1 ng / eiwit / spot 20. Eiwit spots gevisualiseerd met zilverkleuring geschikt voor verdere analyse door massaspectrometrie. Het is echter belangrijk te vermelden dat zilverkleuring oplossing glutaaraldehyde moet bevatten omdat dit middel verknoopt eiwitten, dus het is niet compatibel met verdere massaspectrometrie 20. Alternatief differentieel tot expressie gebrachte eiwitten te detecteren en kwantificeren, een gel gebaseerde benadering zoals twee-dimensionale verschil in gelelektroforese (2D-DIGE) met geautomatiseerde software kan worden gebruikt. Deze benadering stelt verschillende fluorescente labels (bijv. Cy 3, 5 en 2) die worden gebruikt om monsters label en een universele interne standaard prior tweede dimensie elektroforese overwinnen, in zekere mate, de nadelen van variatie en reproduceerbaarheid van 2-D elektroforese 27. Bovendien kunnen gels worden gekleurd dan de tweede dimensie SyproRuby, die een organometallische ruthenium chelaat vlek ontworpen voor proteomische toepassingen. Het kan eiwitvlekken detecteren met gelijke gevoeligheid die zilverkleuring, maar met een grotere gevoeligheid dan Coomassie blauw. Na het kleuren gels kan worden gefotografeerd met laserscanner of transilluminator 28.

    Kortom, deze video beschrijft een hele cellen bacterieel eiwit extractiemethode en 2-D gelelektroforese methode die de bestudering van globale veranderingen in het proteoom van Burkholderia soort kan toestaan.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

    Acknowledgements

    Dit werk werd ondersteund door een studententijd van de Universiteit van British Columbia (naar BV) en subsidies van Cystic Fibrosis Canada en de Canadese Institutes of Health Research (DPS). Wij danken Jacqueline Chung voor de eerste voorbereidingen van protocollen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
    Acetone Fisher A18-1 Flammable
    PBS Buffer Bioscience R028
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
    Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
    Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
    MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
    Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
    2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
    Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
    CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
    Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
    Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
    Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
    Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
    N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
    Agarose Invitrogen 15510-027
    Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
    Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
    Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
    Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
    Sodium acetate EM Science 7510
    Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
    Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
    Sodium thiosulfate Sigma S7026
    Tris Base EMD 9230
    Glycine MPBiomedical, LCC 808831
    Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
    Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
    Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
    Mineral oil ACROS 415080010
    Equipment
    JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
    Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
    Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
    Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
    2. Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. (2011).
    3. Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
    4. White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
    5. Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
    6. Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
    7. Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
    8. Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
    9. Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
    10. Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
    11. Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
    12. Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
    13. Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
    14. Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
    15. Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
    16. Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
    17. Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
    18. von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
    19. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
    20. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
    21. Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
    22. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
    23. Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
    24. Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
    25. Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
    26. Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
    27. Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
    28. Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics