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 JoVE Immunology and Infection

培養およびメンテナンス

1, 1, 1

1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

Article
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    Summary

    クロストリジウム·ディフィシルは、厳密な嫌気性菌で、抗生物質関連下痢(AAD)を引き起こす病原性細菌である。ここで、単離培養し、Cを維持するための方法ディフィシル栄養細胞と芽胞が記載されている。これらの技術は、最適C.ための適切な条件を確実にするために定期的なメンテナンスを必要とする、嫌気性チャンバーを必要とディフィシル栽培。

    Date Published: 9/14/2013, Issue 79; doi: 10.3791/50787

    Cite this Article

    Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

    Abstract

    クロストリジウム·ディフィシルは、抗生物質関連下痢症(AAD)の主な原因であり、重要な院内感染病原体であるグラム陽性嫌気性、胞子形成細菌である。C.ディフィシルは隔離し、育成することで悪名高いことは困難であり、環境中の酸素でさえ低いレベルに非常に敏感である。ここでは、Cを単離する方法糞便サンプルからディフィシル 、その後培養すること長期保存用グリセロールストックの調製のためディフィシルが提示される。顕微鏡や動物実験を含む下流の様々なアプリケーションのために、実験室での胞子株を作製し、列挙するための手法についても説明します。これらの技術は、最適C.ための適切な条件を確保するための一貫性嫌気性環境を維持する嫌気性チャンバーを必要とするディフィシル成長。我々は、約なくチャンバの内外に物質を移送するためのプロトコルを提供する効率的かつ一貫したC.ための適切な嫌気性環境を維持するのに必要な定期的なメンテナンスのための提案と共に有意な酸素汚染を用いディフィシル栽培。

    Introduction

    クロストリジウム·ディフィシルは、絶対嫌気性菌と人間と動物の致命的な胃腸病原体であるグラム陽性、芽胞形成細菌である。最初は新生児1、Cから糞便中に見られる共生生物として1935年に記載されてディフィシルは後に抗生物質治療2に関連した偽膜性大腸炎の原因物質であることが実証されました。Cをディフィシル感染症(CDI)は、典型的にはCのニッチを作成して、正常な結腸細菌叢の破壊をもたらし、抗生物質による治療が先行している2℃発育ディフィシルディフィシルは、糞口経路を介して休眠胞子として送信され、その後、いくつかの毒素を生成し、重篤な疾患や大腸炎3を引き起こすことができる栄養細胞を生産する、消化管の中に発芽している。 CDIは、多くの場合、従来の治療と、これらの中に抵抗性fectionsは、頻繁に再発4です。その結果、CDIは米国5-7の医療費で最大48億ドルを担当している。

    クロストリジウム·ディフィシルは、環境中の酸素でさえ低レベルに非常に敏感である。 Cディフィシルが環境中に残留し、効率的にホストにホストから送信され、代謝的に不活性胞子の形成が重要で8です。なぜならCの実験室でのメンテナンスと操作ディフィシルは、これらの技術は、嫌気性チャンバーの使用を必要とし、制御され、嫌気性環境を必要とする。嫌気性チャンバーの使用は、偏性嫌気性菌の増加9-11回収及び単離をもたらした、分子の多くの技術が嫌気雰囲気下で行うことを可能にした。

    C.に加えてディフィシルは 、ここで説明する嫌気性チャンバーの使用と保守が適用されますこのような他のクロストリジウム種( 例えばウェルシュ菌 )、他の胃腸の種( 例えばバクテロイデス12)と歯周病原体( 例えばペプトストレプトコッカス属 13)のような他の偏性嫌気性菌に。

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    Protocol

    :C.ディフィシルは、消化器疾患を引き起こす可能性があり、人間と動物の病原体である。 Cを含む実験ディフィシルは、適切なバイオセーフティに関する注意事項(BSL-2)を用いて実施されなければならない。

    1。嫌気性チャンバー使用とメンテナンス

    クロストリジウム·ディフィシルは、厳密な嫌気性菌であり、大気中の酸素であっても、低濃度に非常に敏感である。このため、制御、嫌気的環境は、その成功の操作のために必要とされる。嫌気性チャンバー( 図1A)の使用は、C.の効果的な培養のために最も安定した環境で理想的な条件を提供ディフィシルや他の嫌気性細菌14。ここで、ガス混合物を含む雰囲気(5%CO 2、10%H 2、85%N 2)を安定的に維持することができる。

    重要な酸素汚染のない室内への任意の項目を導入するには、エアロック( 図1B)を使用する必要があります。この装置はガス交換として機能し、半手動でまたは手動で、自動的に動作する。エアロックの外側と嫌気槽の内部に、他のアクセスを提供へのアクセスを提供する1:エアロックは、二つのドアがあります。モデルによっては、エアロックは、このように別々のエアロックのコストを節約する、隣接する嫌気室へのアクセスを提供することができ、追加のドアを有することができる。積極的にチャンバー内や外にアイテムを移動しない限り、両方のドアは、酸素の混入を避けるために、常に閉じままにしてください。エアロックは、前面のオン/オフスイッチと4ボタンを含むパネルを持っています。ガスライン及び真空ポンプホース部の完全な手動操作するためのスイッチが配置されているパネルの近くにエアロックの後方に接続されている。 これは、2つのパージサイクルは、窒素ガスを用いて(N 2)が使用されることが推奨されるガス混合物(5%のCO 2との交流を充填する前に10%H 2、85%N 2) チャンバ内に導入される酸素の量を減少させる。なお、アイテムを移動させるために必要な量の時間よりも長く開いたドアのいずれかを残さないし、インターチェンジを出て、に決してすることも重要である慎重にチャンバー内と外にアイテムを移動する頻度を減らすための実験を​​計画しています。ビニール嫌気チャンバーに異なる操作手順は以下のとおりです。これらのプロトコルを実行する前に、これらのチャンバを備え、メーカーの指示と互換性があることを確認してください。

    1. 自動モード
      これは、プログラム可能な、カスタマイズ可能なモードであり、エアロックによって完全に実行されます。エアロックをプログラムするには、製造元の説明書をご覧ください。チャンバ内への一般的なエントリのための推奨プログラムは密接チャム内に維持雰囲気にマッチしたガス混合物とエアロックを再充填することによって、その後窒素ガスを用いて2パージサイクルを必要とするBER。各真空サイクル中に、標準的な工場手順は10Hgで20に真空を引き、1 10Hgでパージに示唆している。
      1. 内側のエアロックのドアが完全に閉じていることを確認してください。
      2. 外側のエアロックのドアを開きます。
      3. エアロックにアイテムを配置し、外側のエアロックのドアを閉めます。液体を導入する場合は、効率的なガス交換を確保するために、途中でキャップを外します。密封されたパッケージとコンテナが前のサイクルを開始するために開かれるべきである。そうすることを控えるワープダメージプラスチック容器や容器があります。無菌性を維持するために、唯一の効率的なガス交換を可能にするのに十分なパッケージを開く。
      4. [スタート]ボタンを押してください。
      5. エアロックは、プログラムを通して循環していると表示が読み取るまで待機」嫌気を。 "
      6. 内側のエアロックのドアを開きます。
      7. チャンバー内に項目を移動します。
      8. 内扉を閉じます。
    2. 半手動モード
      このモードでは、チャンバの中や外のアイテムを移動させる際に使用され、必要に応じて、Cであることがチャンバー内のガスをyclingすることは必要である。
      1. 内側のエアロックのドアが完全に閉じていることを確認してください。
      2. 外側のエアロックのドアを開きます。
      3. エアロックにアイテムを配置し、外側のエアロックのドアを閉めます。液体を導入する場合は、効率的なガス交換を確保するために、途中でキャップを外します。ループや96ウェルプレートに接種するよう密封されたパッケージは、前のサイクルを開始するために開かれている必要があります。
      4. を押してメニューを表示します。
      5. [スタート]を押し​​ます。エアロックは、各ボタンの機能が表示され、これが完了するまで応答しません。
        • 上矢印:真空ポンプを作動させる。
        • 下矢印:窒素(パージ)ガスの流れを開始します。
        • 開始:ガス混合の流れを開始します。
        • メニュー:デフォルトの表示に戻ります。
      6. を押して「アップ」表示が20 10Hgでを読み取るまで、エアロックからガスを除去する。
      7. を押して「下」の表示が1未満10Hgでを読み取るまで、窒素でエアロックを充填。 OVしないでくださいershoot、このようにその整合性に影響を与える可能性がある、エアロック内の正圧が作成されます。
      8. 繰り返して、追加のパージサイクルを実行するために6と7を繰り返し。
      9. を押して「UP」表示が20 10Hgでを読み取るまで。
      10. を押して「スタート」の表示が1未満10Hgでを読み取るまで、ガス混合物との交流を充填。
      11. 内側のエアロックのドアを開きます。
      12. チャンバー内に項目を移動します。
      13. 内扉を閉じます。
    3. 手動モード
      自動または半手動モードが機能していないか、エアロックに電源がないときはいつでも、このモードを使用することができる。エアロックがオンの場合、このモードでは機能しないので、それがエアロック内の圧力を決定することは困難である。真空およびガス流量に依存する真空引きとガスパージ時間ので、それぞれ、インターチェンジ内の圧力計の使用は、圧力を監視し、けがとエアロックへの損傷のリスクを低減する必要がある。
      1. 内側のエアロックのドアが完全に閉じていることを確認してください。
      2. 外側のエアロックのドアを開きます。
      3. エアロックに、圧力計などの項目を配置し、外側のエアロックのドアを閉めます。液体を導入する場合は、効率的なガス交換を確保するために、途中でキャップを外します。ループや96ウェルプレートに接種するよう密封されたパッケージは、前のサイクルを開始するために開かれている必要があります。
      4. ラベルされたエアロックの背面に3のスイッチ位置を確認し、「手動制御は、スイッチを。 "これらは個別にラベル付けされているような。
        • 真空に
        • 窒素
        • ガスミックス
      5. 圧力計が約20 10Hgでを読み取るまでトグルを真空にスイッチを入れる。
      6. 圧力計は、約1 10Hgでを読み込むまで窒素トグルスイッチを入れる。
      7. 圧力計が約20 10Hgでを読み取るまでトグルを真空にスイッチを入れる。
      8. 圧力計は、約1 10Hgでを読み込むまで窒素トグルスイッチを入れる。
      9. 圧力計が約20 10Hgでを読み取るまでトグルを真空にスイッチを入れる。
      10. 圧力計は、約1 10Hgでは読み込むまでガスミックストグルスイッチを入れる。
      11. 内側のエアロックのドアを開きます。
      12. チャンバー内に項目を移動します。
      13. 内扉を閉じます。

    2。培養、列挙と保存便検体からディフィシル

    この手順は、C.を回復するように設計されているディフィシルは、糞便サンプルから胞子を含む、その後、グリセロールストックとして長期保存中の栄養細胞または胞子などの単離されたコロニーを維持する。代替的に、この手順は、C.数を列挙するために使用され得る糞便サンプル( 例えば 、動物試験から)に存在するディフィシル 。選択的かつ差別的濃縮するためにディフィシルは 、タウロコール酸、セフォキシチン-サイクロセリン-フルクトース寒天(TCCFA)は、正常な糞便叢15-16の増殖を阻害するために使用される。より広義にはセフォキシチンC.除いて、両方のグラム陰性及び陽性細菌の増殖を阻害しながら、サイクロセリンは、グラム陰性細菌用静菌であるディフィシルほとんどが球菌株を入力してください。フルクトースの発酵はpHの低下や黄、赤/橙色から後続の色の変化をもたらすようにpH指示薬、ニュートラルレッドは、培地中に含めることができる。効率的にCの胞子を回復するには栄養型細菌としてディフィシルは 、胆汁酸塩は、タウロコール酸ナトリウム17-18発芽誘導するために使用される。 C.理由C.ディフィシルは、効率を増大させる可能性がある、混入微生物叢の増殖を制限する、栄養細胞を低減または排除するために使用することができる胞子、アルコールまたは試料の熱処理を形成するディフィシル回復19。上述のように、残留酸素の除去を確実にするために、使用前に、嫌気チャンバー内で少なくとも1〜2時間、すべてのプレートを事前に低減することが重要である。空気dryiNG室で使用する前にプレートが結露を減らすことができます。液体培地は、ボリュームや使用される容器の対空比に応じて削減する、最大24時間が必要になる場合があります。

    開始する前に、以下の項目が嫌気チャンバー内に配置する必要があります。

    • 糞便サンプル
    • 無菌綿棒
    • 無菌接種ループ
    • 1×PBS(材料を参照してください)
    • TCCFAプレート(材料を参照してください)
    • BHISプレートとブロス(酵母エキスとのブレインハートインフュージョン培地)(材料を参照してください)
    • 50%グリセロール(滅菌)
    • 10%のL-システイン(滅菌)
    • 低温貯蔵バイアル

    *あるいは、単離されたコロニーを、-80℃での長期保存のために15%グリセロールでBHIS寒天プレート上に広げ、その後、掻き取りBHIS液体培地に再懸濁することができる**これは、グラム染色はCを識別するための効果的な戦略ではないことに注意することが重要です糞便サンプル23から直接ディフィシル でディフィシルは、最初の糞便中に存在する他の植物相から分離されなければならない。

    1. 1X PBS(これは好気的条件で行うことができる)での糞便試料を再懸濁し、糞便サンプルが完全にボルテックスで1×PBSに再懸濁されていることを確認してください。 Cを列挙した場合便からのディフィシルは 、従来の1X PBSを添加する便試料の重量を量る。
    2. 便のグラムあたりのコロニー形成単位(CFU)の適切な分離又は計数のための1×PBSで再懸濁した便試料の連続希釈を行う。
    3. 無菌法を用いて、TCCFAプレートに各シリアル希釈液100μlを適用します。
    4. 適用された文化が単離されたコロニーのために、無菌接種一連のループをストリーク使用するか、均等にコロニーの計数のためにTCCFA板の表面に適用される文化を広める。
    5. 37℃で48時間、嫌気的にプレートをインキュベートこれは、C.を検出し、同定することが可能である24時間以内でディフィシルコロニーが上のベースコロニー15の平らな、不規則な、すりガラスの外観、より正確な同定および算定には48時間後に達成されているが。
    6. 無菌接種ループを使用して、 温度のように見える任意のコロニーを継代培養0.03%L-システイン20を補充した予備還元BHIS寒天プレート上へのディフィシレ 。単離されたコロニーを得るために、各象限のための新しい滅菌接種ループを使用して、象限にプレートに、個々のコロニー、およびストリークを選択します。代わりに、Cを数える各希釈のディフィシレのコロニー(これは、好気的条件下で行うことができる)、および糞便試料1g当たりのコロニー形成単位の数を計算する。
    7. C.を確認グラム染色を経由ディフィシル識別。後のグラム染色、C.ディフィシルは、紫色の棒として表示され、いくつかの細胞は、端末内生胞子を含むことができる。毒素Bをコードする遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の同定は、さらなる確認を提供することができるCの毒素産生株ディフィシル 21多座シークエンスタイピング(MLST)が識別およびCの未知の非毒素株の正確なタイピング成功しながら、 ディフィシル 22。
    8. Cの株式を維持するために、 -80℃でディフィシルは 、無菌の接種ループを用いてBHIS寒天プレートからの個々の、単離されたコロニーを選択し、液体媒体が0.03%L-システインを補充した予備還元BHIS 10mlにコロニーを再懸濁する。*
    9. 37℃で嫌気的に一晩インキュベートするか、文化が濁るまで。
    10. 50%グリセロールの333μL、Cの 666μLを追加分離株の15%のグリセロールストックを作成するには、1.8ミリリットルの低温チューブにディフィシル文化。
    11. しっかり極低温チューブにキャップを、よく混ぜ、すぐに長期保存のための-80℃の冷凍庫に嫌気性チャンバーと場所から株式を削除します。

    3。 C.を培養ディフィシル

    この手順では、Cの回復を提供-80℃で保存し、グリセロールストックからディフィシル凍結融解の繰り返しは、栄養細胞を死滅させることができるので、常に凍結グリセロールストックを維持することが重要である。私たちは、ドライアイスの蒸発は、チャンバ内の環境を変更することができるように、チャンバの内外の株を転送するためのドライアイスを使用することをお勧めしません。代わりに、我々は、輸送中に凍結グリセロールストックを維持するために凍結された冷却ラックを使用することをお勧めします。様々な選択と差分目的のために、3つのメディアは、一般C.を培養するために使用されるディフィシル 。 TCCFAは、上述したように、C.に対して選択的であるディフィシル及びタウロコール酸ナトリウム、発芽が含まれています。酵母エキス(BHIS)を補充したブレインハートインフュージョンは、多種多様な生物( 2A)24の成長を可能にする一般的に使用される、濃縮された、非選択培地である。頻繁に、L-システインeは、還元剤20としてBHISに添加される。最後に、媒体( 図2B)への血液の添加はTCCFAよりも、より効率的な胞子形成を可能にし、C.によって示される独特の緑がかった黄緑色又は蛍光の検出を提供する長波長紫外線(UV)光15( 図2C)の下でディフィシルCを培養するとき胞子ストックからディフィシルは 、それはタウロコール酸ナトリウムが発芽を確実にするために培地に添加されなければならないことを覚えておくことは重要です。

    開始する前に、以下の項目が嫌気チャンバー内に配置する必要があります。

    • 凍結したグリセロールストック(ラックを冷却する)
    • 無菌接種ループ
    • TCCFAまたはBHISプレート(材料を参照してください)
    • BHISブロス(材料を参照してください)
    • 50%グリセロール(滅菌)
    • 低温貯蔵バイアル
    1. Cの凍結したグリセロールストックを配置-80°Cで保存した広報された冷却ラックにディフィシル解凍を防ぐために使用するIOR。
    2. 嫌気性チャンバー内にドライアイス上で凍結グリセロールストックを持参してください。
    3. 無菌テクニックと滅菌した接種ループを使用して、プレートの1象限にわたるプレートとストリークの上に少量入荷を置く。
    4. プレートを90°回転して、新しい滅菌接種ループを使用して、第二象限全体で連勝を続けています。
    5. 個々のコロニーを単離を確保するために、第三及び第四象限のために繰り返します。
    6. すぐに嫌気性チャンバーからの凍結グリセロールストックを削除し、-80℃に戻す
    7. 37℃で嫌気的に一晩プレートをインキュベート個々の孤立したコロニーを一晩増殖させた後に観察する必要があります。

    4。 Cから精製胞子ディフィシル

    胞子形成は、酸素が ​​豊富な環境での生存のためにと病気8の効率的な伝送のために必要とされるように、胞子株の調製はofteですダウンストリームアプリケーションのために必要なN、顕微鏡や動物の研究に限定されない。これは、胞子を列挙するカウントの再現性を確保するために繰り返しを必要とすることに留意することが重要である。胞子は穴プラスチックに付着するので希釈液との間で上下にピペッティング数回しても損失を低減することができる。

    Cの胞子形成ディフィシルは 、他の胞子形成種とし ​​て、急速なまたは均一ではありません。どちらの胞子形成培地(SMC)17,25または70:30の媒体26、胞子の生産と回収を最適化することが推奨されます。成長の72時間後- (ミリリットル当たり10 8胞子10 7)一般的に使用される他のメディアは、効率的な胞子が27を見られる前に、成長の4-5日を必要とBHIS、およびClospore、胞子の高い力価を生成し、液体培地である。他のプロトコルではなく、PBS 1X 20よりも氷のように冷たい水を使用するが、等張液の使用は、互いにプラスチック表面に付着する胞子を低減することができる。別の方法として、一部の研究者はさらに、完全栄養細胞および破片29を除去するためショ糖勾配を使用して胞子を浄化する。

    開始する前に、以下の項目が嫌気チャンバー内に配置する必要があります。

    • 無菌接種ループ
    • BHIS、SMCおよび/または70:30のプレート(材料を参照してください)
    • BHISブロス(材料を参照してください)
    • 1×PBS、濾過滅菌(材料を参照してください)
    1. 培養物を予備還元BHISプレート上に凍結グリセロールストックから株し、37℃で終夜嫌気的にインキュベートする
    2. いくつかの予備還元SMCまたは70:30プレートにRestreak 24〜48時間、37℃で嫌気的に培養する。胞子形成は、位相差顕微鏡を介して追跡することができる。栄養と母細胞が相暗く見えますが、胞子は、位相明るく表示されます。 *代替として、胞子はstraiに応じて、ミリリットル当たり10 5〜10 6胞子を生じるもの、24〜48時間後に70:30液体培地から精製することができるN使用。
    3. 無菌接種ループを用いて、プレートをこすり、10mlの滅菌1×PBSで細胞を再懸濁する。
    4. プレートを捨て、嫌気性チャンバーから胞子懸濁液を削除します。 15分間3000×gで細胞をペレット化。完全に細胞ペレットを毎回再懸濁、1×PBSで2回細胞を洗浄。
    5. 栄養と母細胞の溶解を助けるために4℃で一晩インキュベートする。
    6. 任意の残余の栄養細胞を死滅させるために20分間70℃でインキュベートする。
    7. ミリリットル当たりのコロニー形成単位(CFU)を測定するために、シリアルにBHIS +0.1%タウロコール酸ナトリウムでの1X PBSおよびプレート中の各胞子準備を希釈。コロニーを列挙する前に、24時間の最小値のため、プレートをインキュベートする。
    8. 胞子は、長期保存を室温または4℃のいずれかで1×PBSに記憶することができる。 4℃で保存した場合は、効率的な発芽を復元するために15分間55℃で胞子調製物を再加熱することが有用であり得る。

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    Representative Results

    Cの例BHISコロンビア嫌気ヒツジ血液寒天培地上で増殖させディフィシルは、 図2に見ることができる。C.ディフィシルは平坦であり、両方のメディアに明らかであるすりガラスの外観を持っている不規則なコロニーを形成している。ここでは、Cのエリスロマイシンに敏感な臨床分離株ディフィシル 、630E 30は 、37°C( 図2A)で24時間、BHIS寒天、濃縮された、非選択培地上で成長させる。コロンビア嫌気ヒツジ血液寒天培地上のコロニーは、白色光( 図2B)の下でBHIS上に成長したのと同様に表示されますが、この培地の使用はまた、Cで示さ緑がかったりシャルトリューズ蛍光の検出を提供長波長紫外線(UV)光15( 図2C)の下でディフィシル。C. TCCFA寒天上ディフィシルコロニーはBHIS寒天上での成長に似ています。なぜならTCCFA媒体、ティムの2つの抗生物質の存在の48時間の成長のE期間がコロニーを列挙する前に必要となる。

    図1
    図1。コイラボラトリーズタイプCビニル室とそのコンポーネント。(インチ×32 42インチ)1度に一人の個人のためのワークスペースを提供し、(A)のAコイラボラトリーズタイプCビニル室。それが循環し、空気を加熱し、STAK朴は任意の酸素汚染を減少させるために必要なパラジウム触媒を含む保持した触媒ファンボックス(左後方の角)が含まれています。 (B)はエアロックは、インターチェンジとして機能し、嫌気的環境の中で重要な酸素の混入を防止しながら、内とチャンバーの外の物質の移動のためのメカニズムを提供します。エアロックは、2ドアがあります。エアロックの外側と目の内部に、他のアクセスを提供へのアクセスを提供する1 E嫌気性チャンバー。エアロックは、プログラム可能で、室内に入るためのカスタマイズされたサイクルを可能にします。これは、自動半手動モードと手動モードで動作可能である。 (C)添付、柔軟性のあるラテックス手袋、動きのフルレンジを可能にし、室内に到達が提供される。手袋は、チャンバの嫌気的雰囲気を破壊することなく、手袋の交換を可能にする、ビニル接着剤を用いてビニルスリーブに取り付けられた特殊なカフに固定されている。ネオプレン製手袋も用意しています。 (D)モデル10ガス分析装置は、連続的にレベルが、チャンバ内の雰囲気を瞬時に読み取りを提供し、酸素と水素の両方を監視します。リークが発生した場合、本機は、誤ったガス混合物が使用されるか、別の問題が可聴アラームと点滅するLEDライトを経由して発生している、すぐにアラートが可能になります。

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    図2。 Cの外観様々なメディアにディフィシルコロニー。特性のフラット、不規則な、すりガラスの外観がCのエリスロマイシンに敏感な臨床分離株とは明らかであるディフィシル 、630E 30は 、24時間(A)および48白色光(B)の下で時間と長波紫外線(C)のためのコロンビア嫌気ヒツジ血液寒天のためBHIS寒天上で増殖させた。

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    Discussion

    ここに記載された方法は、Cの簡単かつ迅速なリカバリを可能にヒト、マウスおよびハムスター、ならびにC.の長期保存を含む糞便サンプル、種々からディフィシルグリセロールまたは胞子ストックとしてディフィシルでディフィシルは、育成することは困難生物であってもよいが、慎重な嫌気性環境の維持と無菌技術の適用は、堅調な成長と汚染の低減を提供することができます。

    嫌気性チャンバー:考慮事項とメンテナンス

    剛性チャンバまたはビニル室:嫌気性チャンバーの2種類がある。硬質チャンバは、典型的には、苛性化学薬品の使用を可能にする、アルミニウムまたは硬質ポリマー( 例えば、プレキシグラス又はアクリル材料)で形成されている。リジッド室はglovelessスタイルに変換され、パンクの可能性も低くなりますできますが、漏れは検出して見つけることが困難であり、剛性の室がためにいくつかの方法が必要です使用中にガス置換を補う。ポリマー単位は、多くの場合、動作するように多くを要することがあり、パージ専用エアロックを装備している。厳しい大気条件、コスト、柔軟性、実験室のスペース要件と容易なメンテナンスの維持のため、ビニール嫌気室は(コイラボラトリープロダクツ、 図1A)をお勧めします。この嫌気性チャンバーは、ラテックスまたはネオプレン手袋を使用して、管状のアルミニウム構造によって支持され、チャンバに出入りする物質の移動( 図1B)のための交換として機能するエアロックに接続されているビニルグローブボックスから構成されているビニールの袖( 図1C)に装着。それは正確に嫌気室の適切なセットアップのためのメーカーの指示に従うことが重要です。これは、(チャンバのサイズに応じて、またはそれ以上)のパラジウム触媒を介して空気循環を提供するヒータボックス単位温度制御されたものとすることができる。パラジウムCAtalystを水に水素と酸素を変換することにより交換による導入された酸素汚染を低減するのに役立つ。理想的には、両方の酸素および水素のレベルは、パーセントとして百万分の一重量部での酸素濃度(ppm)と水素濃度を表示し、ガス分析器( 図1D)を使用して監視される。

    液体および固体培地は、使用前に嫌気性チャンバーに予め低減されるべきである。ペトリ皿(直径100mm)の31を使用する前に2時間だけ減少させることができるが、液体培地で一晩低減されるべきである。重要なことに、メディアは、エアロックの排気中に液体の点滅を防止するためにチャンバ内に転送する前に冷却する必要がある。例えば、96ウェルプレートのようなプラスチック消耗品は、プラスチックが多孔質であるように、使用前に一晩予め低減されるべきであると酸素分子32を格納することができる。アプリケーションによっては、一部のプラスチックは、使用前に33までの48時間前還元されなければならない。バイオハザード廃棄物bにすべきE適切に処分した。小さなバイオハザードバッグは室内に保管してもよいが、頻繁に交換する必要があります。

    これはC.両方の良好な成長を確保するように、少なくとも3%の水素濃度は、チャンバ内に維持されなければならないディフィシルで効率的な酸素除去。水素濃度が3%を下回ると、チャンバは、数日間使用されていない場合、チャンバサイクルが所望のレベルに水素濃度を回復するために実行されるべきである。ここでは、チャンバ内のガスの約三分のうち真空(ビニルボックスが大幅に収縮します)と、新鮮ガスミックスに置き換えられます。エアロックを開始する前に、嫌気性であることを確認してください。チャンバー内にあまりにも多くのガスをポンプでは、これがビニール袋に不必要なストレスを配置していないだけのように、避けるべきであるだけでなく、室内の背面に到達するユーザーを排除します。常に換気の良い場所でこの手順を実行する。追加の予防策を取る場合CHAmber、小さな、換気の悪い部屋に保管されている。チャンバー内のガスの内容は、ユーザーが窒息することができますようにお部屋への扉を開きます。

    付加的なメンテナンスは、チャンバ内の効率的な酸素除去を確実にするために、パラジウム触媒の再生を含む。酸素と水素を触媒によって還元されるように、水は、時間の経過とともにその効率を低下させる、パラジウム、アルミニウムで覆われたペレットの表面上に蓄積することができる。これを克服するために、パラジウム触媒を1時間、少なくとも230°Cで焼成して少なくとも週に一度再生されるべきである。さらに、プレートおよびメディアから酸素還元および水の蒸発の両方の結果として、水蓄積は、嫌気性チャンバー内の共通の問題である。快適な操作性を確保し、チャンバ内の機器の半減期を増加させるために、乾燥剤パックが使用され得るが、パラジウム触媒に用いたのと同じ手順に従って、頻繁に乾燥させなければならない。別の方法として、A·デ加湿器は、水を凝縮し、容器内に回収される金属ブロックを介して空気を循環を使用してもよい。デバイスは、水容器のオーバーフローを防止しますが、除湿機を監視する必要があり、完全に近いときの容器を空にする必要があります。ビニールチャンバを洗浄するためには、ポリ塩化ビニル(PVC)のために推奨される柔らかい布や市販の洗浄剤の使用は、( 例えば、プラスチックマジッククリーナー、部品番号1600480、コイ·ラボラトリーズ)をお勧めします。ビニールチャンバーを傷や損傷を防ぐために、紙タオル、キム·ワイプまたはケトンまたはPVCを損傷する他の化合物を含む製品を使用しないでください。

    最後に、C.ディフィシルは、極めて反応性、腐食性、硫化水素ガス(H 2 S)を生成する。硫化水素は、計装、パラジウム触媒および任意の露出金属に損傷を与えることができる。可能であれば、CHAMBでは、このようなホモジナイザーや分光光度計などの任意の器具を残していない硫化水素による腐食を避けるために、時間の長期間えー。なぜなら硫化水素の産生のようなパラジウム触媒およびガス分析器などのアイテムは、定期的に定期的なチャンバーメンテナンスの一部として交換される必要がある。硫化水素を吸収または化学的に除去するために活性炭、酢酸鉛、塩化銀または銀硫酸塩を使用するなど、チャンバ内の硫化水素濃度を低減するための選択肢は、34に記載されており、装置の腐食を遅くするために利用することができる。

    その他の注意について

    他のドアが閉じられ、酸素の混入を防ぐためにロックされていることを確認せずにエアロックの1の扉を開くことはありません。さらに、ビニルを穿刺のリスクを低減するため、チャンバ内のシャープなアイテムの使用を避ける。

    なお、水素は酸素の存在下で可燃性ガスであることに注意することが重要である。項目Iを導入する際には注意してください酸素汚染の高レベル(999 PPMより大きい)が発生しないチャンバーNTO。これは、新しいガソリンタンクを使用する場合は特に、唯一の予混合不燃性嫌気性ガス混合物を使用し、密接に室内にガス分析装置を監視することが重要である。 4%以上の両方の水素と酸素の濃度が発生した場合は、検査室の標準作業手順(SOP)で概説されるべきで、適切な緊急時の手順は、従っていることを確認してください。

    C.のトラブルシューティングディフィシル成長

    もしCの生育不良ディフィシレ培養物を富栄養培地において観察され、これがチャンバ内に最も頻繁に酸素汚染に起因する。媒体への還元剤( 例えば、L-システインまたはチオグリコレート)の添加は、増殖を改善することができるが、チャンバ内の酸素汚染の問題に対処する必要があろう。すぐにガス分析器を用いてチャンバ内の酸素および水素のレベルを監視することができラートの進歩と生産性の低下の遅れの前の問題にユーザーが発生します。酸素汚染が発生した場合は、すぐに(コイ·ラボラトリーズ社製)ガス漏れ検知器を使用してソースを特定するのをお勧めします。ガス漏れ検知器は、炭化水素のレベルの増加、並びに水素のレベルの増加を識別することができるので、漏れの場所を見つける機会を増やすために、アルコールに浸した布は、チャンバ内に配置することができる。漏れの発生源が発見されると、製造者の指示に従って接着剤またはシリコーンを使用して修復することができる。

    生物の数は、容易に他の一般的なクロストリジウム種( 例えばウェルシュ菌 )及び通性嫌気性菌、 大腸菌などの嫌気性環境で育つ。無菌技術および他の戦略は、汚染のリスクを低減することができる。このような潜在的なFを軽減するために手の届くところにアイテムを配置するように、チャンバ内の適切な組織、あるいは流出し、蓄積された、バイオハザード廃棄物の迅速な除去は、汚染リスクを減らすことができます。さらに、希薄漂白剤溶液で湿らせたペーパータオルは、定期的に表面およびラテックスまたはネオプレン手袋を拭うためにチャンバ内に導入することができます。これは、Cを殺し、これらが大気と固体と液体のメディアを透過することができるように、長時間室内部の漂白剤やアルコールのソリューションを残さないようにすることが重要ですディフィシルだけでなく、レコード34にダメージ与える。さらに、ラテックスまたはネオプレン手袋の定期的な交換も汚染リスクを減らすことができます。わからない場合は、上記に述べたように生物がCである場合にはディフィシル又は汚染物質、PCRを用いてのtdcB遺伝子の存在についての試験を迅速に生物はC.であるか否かを判定することができるディフィシル 21。同じ嫌気性チャンバー内で複数の生物体を培養する場合には最後に、留意することが重要であるC.ディフィシルは代謝副産物(Eを生成することができますその逆に、他の嫌気性生物の成長とを阻害する。gの硫化水素)。

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    Disclosures

    利害の対立が宣言されていません。

    Acknowledgements

    私たちは親切嫌気室の写真を提供するためのコイ研究所に感謝したいと思います。この作品は、DK087763(SMM)とSTEP /ハワードヒューズカリキュラム開発フェローシップ(ANE)を付与国立衛生研究所によってサポートされていました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Proteose Peptone no. 2 BD 212120
    Na2HPO4 Fisher S373
    KH2PO4 Fisher BP362
    NaCl Fisher S27
    MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
    á´…-Fructose Fisher L96
    Sodium taurocholate Sigma T4009
    á´…-cycloserine Sigma C6880
    Cefoxitin Fluka C4786
    Brain heart infusion medium BD 237300
    Proteose Peptone BD 211684
    (NH4)2SO4 Sigma A5132
    Tris base Fisher BP152
    Agar BD 214010
    L-cysteine Sigma C7755
    BactoPeptone BD 211684
    Columbian sheep blood agar Fisher L21928
    NaCl Fisher S27
    KCl Fisher P217
    Glycerol Fisher BP2291
    Sterile inoculating loops Fisher 22363596
    Sterile swabs Fisher 1495990
    Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
    Materials
    TCCFA agar

    Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
    Na2HPO4 5 g
    KH2PO4 1 g
    NaCl 2 g
    MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
    Fructose 6 g
    Agar 20 g

    Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    After autoclaving, add:
    10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
    25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
    1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

    BHIS Medium

    Brain heart infusion 37 g
    Yeast extract 5 g

    For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    Optional (add after autoclaving):

    3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
    10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

    SMC Sporulation Medium

    BactoPeptone 90 g
    Protease peptone 5 g
    (NH4)2SO4 1 g
    Tris base 1.5 g
    Agar 15 g

    Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    Optional (add after autoclaving):
    3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

    70:30 Medium

    BactoPeptone 63 g
    Protease peptone 3.5 g
    Brain heart infusion 11.1 g
    Yeast extract 1.5 g
    (NH4)2SO4 0.7 g
    Tris base 1.06 g

    For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

    Blood agar

    The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

    1X Phosphate buffered saline (PBS)

    NaCl 8.01 g
    KCl 0.2 g
    Na2HPO4 1.44 g
    KH2PO4 0.27 g

    Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

    References

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