Het kweken en onderhouden

Published 9/14/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Clostridium difficile is een pathogene bacterie die een strikt anaerobe en veroorzaakt antibiotica geassocieerde diarree (AAD). Hier, werkwijzen voor het isoleren, kweken en onderhouden C. difficile vegetatieve cellen en sporen worden beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die regelmatig onderhoud nodig heeft om te zorgen voor een goede voorwaarden voor een optimale C. difficile teelt.

Cite this Article

Copy Citation

Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Clostridium difficile is een Gram-positieve, anaërobe, sporogenic bacterie die primair verantwoordelijk is voor antibiotica geassocieerde diarree (AAD) en is een belangrijke nosocomiale pathogenen. C. difficile is notoir moeilijk te isoleren en cultiveren en is zeer gevoelig voor zelfs kleine zuurstof in de omgeving. Hier, werkwijzen voor het isoleren C. difficile van fecale monsters en vervolgens het kweken van C. difficile voor de bereiding van glycerol bestanden langetermijnopslag gepresenteerd. Technieken voor het bereiden en het opsommen spore aandelen in het laboratorium voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals microscopie en dierlijke studies beschreven. Deze technieken vereisen een anaërobe kamer, die een consistente anaëroob milieu te zorgen voor een juiste omstandigheden voor een optimale C. onderhoudt difficile groei. Wij bieden protocollen voor de overdracht van materialen in en uit de kamer zonder camet behulp van aanzienlijke verontreiniging zuurstof samen met suggesties voor regelmatig onderhoud nodig om de juiste anaëroob milieu te ondersteunen voor een efficiënte en consistente C. difficile teelt.

Introduction

Clostridium difficile is een grampositieve, sporenvormende bacterie die een obligaat anaërobe en een potentieel fatale gastrointestinale pathogenen van mensen en dieren. Aanvankelijk beschreven in 1935 als een commensaal organisme gevonden in fecale monsters van pasgeborenen 1, C. difficile werd later aangetoond dat de verwekker van pseudomembraneuze colitis geassocieerd met antibiotica 2 zijn. C. difficile infecties (CDI) worden gewoonlijk voorafgegaan door antibiotische behandeling die resulteert in de verstoring van de normale darmflora, het creëren van een nis voor C. difficile te gedijen 2. C. difficile als een slapende spore via de fecaal-orale weg overgebracht en vervolgens ontkiemt in het maagdarmkanaal, vegetatief cellen kan genereren verscheidene toxine en veroorzaken ernstige ziekte en colitis 3. CDI zijn vaak ongevoelig voor conventionele behandelingen en deze infections worden vaak terugkerende 4. Daardoor CDI zijn verantwoordelijk voor $ 4,8 miljard aan gezondheidszorgkosten in de Verenigde Staten 5-7.

C. difficile is zeer gevoelig voor zelfs kleine zuurstof in de omgeving. Voor C. difficile te blijven in het milieu en efficiënt worden overgedragen van gastheer naar gastheer, de vorming van een metabolisch inactieve spore is van cruciaal belang 8. Omdat het laboratorium onderhoud en manipulatie van C. difficile is een gecontroleerde, anaëroob milieu, deze technieken vereisen het gebruik van een anaërobe kamer. Gebruik van anaërobe kamers heeft geleid tot een toegenomen terugwinning en isolatie van obligate anaerobe 9-11, en ​​heeft geleid tot een aantal moleculaire technieken in een anaërobe atmosfeer worden uitgevoerd.

Naast C. difficile, de anaërobe kamer gebruik en onderhoud hier beschreven toepassingandere obligate anaerobe bacteriën zoals Clostridium andere soorten (bijv. C. perfringens), andere maag-soorten (bijvoorbeeld Bacteroides soorten 12) en periodontale pathogenen (bv. Peptostreptococcus species 13).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: C. difficile is een menselijke en dierlijke ziekteverwekker die gastro-intestinale aandoeningen kunnen veroorzaken. Experimenten met C. difficile moet worden uitgevoerd met de juiste voorzorgsmaatregelen bioveiligheid (BSL-2).

1. Anaërobe Chamber gebruik en onderhoud

C. difficile is een strikt anaërobe en is zeer gevoelig voor zelfs lage concentraties van zuurstof in de atmosfeer. Daarom wordt een gecontroleerde, anaëroob milieu nodig voor een succesvolle manipulatie. Het gebruik van een anaërobe kamer (figuur 1A) geeft de meest stabiele omgeving en ideale omstandigheden voor een effectieve kweken van C. difficile en andere anaërobe bacteriën 14. Hier kan een atmosfeer die een gasmengsel (5% CO2, 10% H2, 85% N2) stabiel worden gehandhaafd.

Om alle items in de kamer zonder noemenswaardige verontreiniging zuurstof te introduceren,een luchtsluis moet worden gebruikt (figuur 1B). Dit apparaat fungeert als een gas-uitwisseling en werkt automatisch, semi-handmatig of handmatig. De sluis heeft twee deuren: een toegang tot de buitenkant van de luchtsluis en de andere toegang tot het inwendige van de anaërobe kamer. Afhankelijk van het model, kan de luchtsluis een extra deur, die toegang geeft tot een aangrenzende anaerobe kamer kan aanbieden, dus besparing van de kosten van een aparte luchtsluis. Tenzij actief verplaatsen van items in of uit de kamer, moeten beide deuren gesloten blijven te allen tijde aan zuurstof te voorkomen. De luchtsluis beschikt over een aan / uit schakelaar aan de voorzijde en een paneel met vier knoppen. De gasleidingen en vacuümpomp slang worden aangesloten aan de achterzijde van de luchtsluis, vlakbij het ​​paneel wanneer de schakelaars voor volledig handmatige bediening van het apparaat bevinden. Aanbevolen wordt twee spoelcycli, met stikstofgas (N2), worden gebruikt voor het vullen van de uitwisseling met gasmengsel (5% CO 2, 10% H2, 85% N2) de hoeveelheid zuurstof ingebracht in de kamer verminderen. Het is ook belangrijk om nooit beide deur open langer dan de hoeveelheid tijd die nodig is om items te verplaatsen in en uit de uitwisseling en zorgvuldig plannen van experimenten om de frequentie van het verplaatsen van items in en uit de kamer te verminderen. De verschillende operationele procedures voor vinyl anaërobe kamers worden hieronder beschreven. Voordat u deze protocollen, ervoor zorgen dat deze verenigbaar zijn met de instructies van de fabrikant, mits met de kamer.

  1. Automatische modus
    Dit is een programmeerbare en aanpasbare modus en wordt volledig door de luchtsluis. Om de luchtsluis te programmeren, raadpleegt u de instructies van de fabrikant. Een aanbevolen programma voor typische binnenkomst in de kamer bestaat uit twee spoelcycli met behulp van stikstofgas, gevolgd door het vullen van de sluis met een gasmengsel dat overeenkomt met de sfeer gehandhaafd binnen de chamber. Tijdens elke vacuüm cyclus, raden de standaard fabrieksinstellingen procedures trekken van een vacuüm tot 20 Hg en zuiveren tot 1 Hg.
    1. Zorg ervoor dat de binnenste luchtsluis deur volledig is gesloten.
    2. Open de buitenste luchtsluis deur.
    3. Plaats items in de luchtsluis en sluit de buitenste luchtsluis deur. Als de invoering van vloeistoffen, draai de doppen half in om een ​​efficiënte uitwisseling van gas te garanderen. Verzegelde verpakkingen en containers moeten voor het begin van de cyclus worden geopend; afzien van dit kan vervormen en beschadiging plasticware en containers. Om de steriliteit te behouden, opent u de pakketten genoeg om alleen een efficiënte gasuitwisseling.
    4. Druk op de knop Start.
    5. Wacht tot de luchtsluis heeft gefietst door het programma en op de display "Anaërobe."
    6. Open innerlijke luchtsluis.
    7. Verplaats items in de kamer.
    8. Sluit binnendeur.
  2. Semi-manual modus
    Deze modus kan worden gebruikt bij het verplaatsen van voorwerpen in of uit de kamer en is noodzakelijk wanneer cycling het gas in de kamer nodig.
    1. Zorg ervoor dat de binnenste luchtsluis deur volledig is gesloten.
    2. Open de buitenste luchtsluis deur.
    3. Plaats items in de luchtsluis en sluit de buitenste luchtsluis deur. Als de invoering van vloeistoffen, draai de doppen half in om een ​​efficiënte uitwisseling van gas te garanderen. Gesloten verpakkingen, zoals entnaalden en 96 putjes, moet voor het begin van de cyclus worden geopend.
    4. Druk op Menu.
    5. Druk op Start. De sluis zal de functie van elke knop weer te geven en zal niet reageren totdat deze is voltooid:
      • Pijl omhoog: activeert de vacuümpomp.
      • Pijl omlaag: initieert de stikstof (purge) gasstroom.
      • Start: initieert het gasmengsel flow.
      • Menu: terug naar de standaard weergave.
    6. Druk op "Up", het verwijderen van gas uit de luchtsluis, tot de display 20 Hg.
    7. Druk op "Omlaag", het vullen van de luchtsluis met stikstof, tot de display minder dan 1 Hg. Niet overshoot, want dit positieve druk in de luchtsluis creëren, die de integriteit kunnen beïnvloeden.
    8. Herhaal de stappen 6 en 7 om een ​​extra spoelcyclus uitvoeren.
    9. Druk op "Up" tot de display 20 Hg.
    10. Druk op "Start", het vullen van de uitwisseling met gasmengsel, tot de display minder dan 1 Hg.
    11. Open innerlijke luchtsluis.
    12. Verplaats items in de kamer.
    13. Sluit binnendeur.
  3. Handmatige modus
    Deze modus kan worden gebruikt wanneer de automatische of semi-handmatige modus niet werken of als er geen stroom naar de luchtsluis. Deze modus werkt niet wanneer de luchtsluis is, daarom is het moeilijk om de druk in de luchtsluis bepalen. Omdat het vacuüm trekken en gasspoelen tijd is afhankelijk vacuüm en de gasstromen, respectievelijk het gebruik van een drukmeter in de uitwisseling moet Drukregelaar en het risico van persoonlijk letsel en schade aan de luchtsluis verminderen.
    1. Zorg ervoor dat de binnenste luchtsluis deur volledig is gesloten.
    2. Open de buitenste luchtsluis deur.
    3. Plaats items, waaronder de manometer, in luchtsluis en sluit de buitenste luchtsluis deur. Als de invoering van vloeistoffen, draai de doppen half in om een ​​efficiënte uitwisseling van gas te garanderen. Gesloten verpakkingen, zoals entnaalden en 96 putjes, moet voor het begin van de cyclus worden geopend.
    4. Zoek de drie schakelaars op de achterkant van de luchtsluis label "Handbediening Switches." Deze worden afzonderlijk aangeduid als:
      • Stofzuigen
      • Stikstof
      • Gas Mix
    5. Flip de om te schakelen vakuumschakelaar totdat de drukmeter ongeveer 20 Hg.
    6. Flip de Stikstof schakelaar totdat de drukmeter ongeveer 1 Hg.
    7. Flip de om te schakelen vakuumschakelaar totdat de drukmeter ongeveer 20 Hg.
    8. Flip de Stikstof schakelaar totdat de drukmeter ongeveer 1 Hg.
    9. Flip de om te schakelen vakuumschakelaar totdat de drukmeter ongeveer 20 Hg.
    10. Flip de Gas Mix schakelaar totdat de drukmeter ongeveer 1 Hg.
    11. Open innerlijke luchtsluis.
    12. Verplaats items in de kamer.
    13. Sluit binnendeur.

2. Kweken, opsommen en opslaan C. difficile van ontlasting

Deze procedure is bedoeld om C. herstellen difficile van fecale monsters die sporen en vervolgens te houden geïsoleerde kolonies als vegetatieve cellen of sporen in de lange-termijn opslag als glycerol voorraden. Alternatief kan deze procedure worden gebruikt om het aantal C. sommen difficile aanwezig in de ontlasting monsters (bijvoorbeeld uit dierproeven). Om selectief en differentieel verrijken voor C. difficile, taurocholaat-cefoxitine-fructose cycloserine-agar (TCCFA) wordt gebruikt om de groei van normale fecale flora 15-16 remmen. Cycloserine is bacteriostatisch Gram-negatieve bacteriën, terwijl cefoxitine ruimer remt groei van zowel Gram-negatieve en-positieve bacteriën, behalve C. difficile en meest voer kokken stammen. Een pH-indicator, neutraal rood, kunnen in het medium als de fermentatie fructose leidt tot een afname in pH en een volgende kleurverandering van rood / oranje naar geel. Om efficiënt herstellen sporen van C. difficile als vegetatieve bacteriën, de galzouten natriumtaurocholaat wordt gebruikt om kieming 17-18 induceren. Omdat C. difficile vormt sporen, alcohol of warmtebehandeling monsters kan worden gebruikt om de vegetatieve cellen te verminderen of te elimineren, het beperken van de groei van verontreinigende flora die de efficiëntie van C stijgen difficile herstel 19. Zoals hierboven vermeld, is het essentieel om vooraf verminderen alle platen tenminste 1-2 uur in de anaërobe kamer voor gebruik bij de verwijdering van de achtergebleven zuurstof te garanderen. Air drying de platen voor gebruik in de kamer kan condens. Vloeibare medium kan tot 24 uur moeten verminderen afhankelijk van het volume en het oppervlak-tot-luchtverhouding van de verpakking worden gebruikt.

Voordat u begint, moet de volgende items in de anaërobe tank worden bevestigd:

  • Kruksteekproef
  • Steriele wattenstaafjes
  • Steriel entnaalden
  • 1x PBS (zie ook Materiaal)
  • TCCFA platen (zie ook Materiaal)
  • BHIS (Brain Heart Infusion medium met gistextract) borden en bouillon (zie ook Materiaal)
  • 50% glycerol (gesteriliseerd)
  • 10% L-cysteïne (gesteriliseerde)
  • Cryogene opslag flacons

* Alternatief kunnen geïsoleerde kolonies worden uitgespreid op BHIS agarplaten en vervolgens afgeschraapt en gesuspendeerd in BHIS vloeibaar medium met 15% glycerol voor langdurige opslag bij -80 ° C. ** Het is belangrijk op te merken dat de Gram-kleuring is niet een effectieve strategie om C. te identificeren difficile direct van ontlasting 23 C. difficile zich eerst worden geïsoleerd van de andere flora in de ontlasting.

  1. Resuspendeer de ontlasting monster in 1x PBS (dit kan in aërobe omstandigheden worden uitgevoerd), en ervoor zorgen dat de ontlasting volledig is gesuspendeerd in 1x PBS door vortexen. Als opsommen C. difficile uit de ontlasting, wegen de ontlasting vóór de toevoeging van 1 x PBS.
  2. Maak seriële verdunningen van de geresuspendeerde ontlasting in 1x PBS passende isolatie of opsomming van kolonievormende eenheden (CFU) per gram ontlasting.
  3. Met behulp van aseptische techniek, toepassing 100 pi van elke seriële verdunning tot TCCFA platen.
  4. Met behulp van een reeks van steriele entogen, streep de toegepaste cultuur voor geïsoleerde kolonies of gelijkmatig verdeeld de toegepaste cultuur op het oppervlak van de TCCFA plaat voor de telling van de kolonies.
  5. Incubeer de plaat anaëroob gedurende 48 uur bij 37 ° C. Het is mogelijk de detectie en identificatie C. difficile kolonies binnen 24 uur gebaseerd opde platte, onregelmatige, geslepen glas uiterlijk van de kolonies 15, hoewel meer accurate identificatie en telling wordt bereikt na 48 uur.
  6. Met behulp van steriele entogen, subcultuur elke kolonies die lijken te zijn C. difficile op voorgereduceerd BHIS agarplaten, aangevuld met 0,03% L-cysteïne 20. Kies een individuele kolonie, en streep op de plaat in kwadranten, met een nieuwe steriele entnaald voor elk kwadrant, om geïsoleerde kolonies te verkrijgen. Als alternatief, tel de C. difficile kolonies van elke verdunning (dit kan worden uitgevoerd in aërobe omstandigheden), en bereken het aantal kolonievormende eenheden per gram ontlasting.
  7. Bevestig C. difficile identificatie via Gram-kleuring. Na Gram-kleuring, C. difficile zal verschijnen als paarse staven en sommige cellen kunnen terminal endosporen bevatten. Polymerase kettingreactie (PCR) identificatie van de genen die coderen voor toxine B kan verder bevestigd biedentoxigene stammen van C. difficile 21 terwijl multilocus sequence typing (MLST) succesvol voor de identificatie en nauwkeurig typen van onbekende en niet-toxigene stammen van C. is difficile 22.
  8. Om een voorraad van C te houden difficile bij -80 ° C, kies individuele, geïsoleerde kolonie van de BHIS agarplaat met een steriele entnaald en resuspendeer de kolonie in 10 ml voorgereduceerd BHIS vloeibaar medium aangevuld met 0,03% L-cysteïne. *
  9. Incubeer overnacht anaëroob bij 37 ° C, of ​​tot de kweek troebel.
  10. Voeg 333 ul van 50% glycerol en 666 pl van de C. difficile cultuur naar een 1,8 ml cryogene buis naar een 15% glycerol voorraad van de geïsoleerde stam te creëren.
  11. Nauw cap de cryogene buis, goed mengen en onmiddellijk de voorraad bij de anaërobe kamer en plaats in een -80 ° C vriezer voor opslag op lange termijn.

3. Het kweken van C. difficile

Deze procedure voorziet in het herstel van C. difficile uit glycerol voorraden bewaard bij -80 ° C. Omdat herhaalde vries-dooi cycli vegetatieve cellen te doden, is het belangrijk om de glycerol voorraden te allen tijde houden bevroren. We raden het gebruik van droogijs voor het overbrengen van stammen in en uit de kamer als de verdamping van droogijs het milieu binnen de kamer kan veranderen aanraden. In plaats daarvan raden wij het gebruik van bevroren koeling rekken tot glycerol voorraden tijdens het transport bevroren te houden. Voor diverse selectieve en differentiële doeleinden worden drie media gebruikt voor kweken C. difficile. TCCFA, zoals hierboven besproken, is selectief voor C. difficile en bevat natriumtaurocholaat, een ontkiemende. Brain Heart Infusion aangevuld met gistextract (BHIS) is een veel gebruikte, verrijkte, niet-selectief medium dat zorgt voor de groei van een grote verscheidenheid van organismen (figuur 2A) 24. Vaak, L-cysteïnee wordt aan BHIS toegevoegd als reductiemiddel 20. Tenslotte, het toevoegen van bloed aan het medium (figuur 2B) maakt een efficiënter sporulatie dan op TCCFA en detectie verschaft van de unieke groen of chartreuse fluorescentie vertoond door C. difficile op basis van lange-golf ultraviolet (UV) licht 15 (figuur 2C). Bij het ​​kweken van C. difficile uit spore voorraden, is het essentieel om te onthouden dat natriumtaurocholaat moet worden toegevoegd aan het medium om kieming te garanderen.

Voordat u begint, moet de volgende items in de anaërobe tank worden bevestigd:

  • Bevroren glycerol voorraad (in koeling rack)
  • Steriel entnaalden
  • TCCFA of BHIS platen (zie ook Materiaal)
  • BHIS bouillon (zie ook Materiaal)
  • 50% glycerol (gesteriliseerd)
  • Cryogene opslag flacons
  1. Plaats de bevroren glycerol voorraad van C. difficile in kuvettenstandaard die is opgeslagen bij -80 ° C prIOR gebruiken om ontdooien te voorkomen.
  2. Breng de bevroren glycerol voorraad op droog ijs in de anaërobe kamer.
  3. Met behulp van aseptische techniek en een steriel entnaald, plaats een kleine hoeveelheid van de voorraad op de plaat en streep over een kwadrant van de plaat.
  4. Draai de plaat 90 ° en, met behulp van een nieuwe steriele entnaald, blijven streep over het tweede kwadrant.
  5. Herhaal voor het derde en vierde kwadrant voor isolatie van afzonderlijke kolonies garanderen.
  6. Verwijder direct de bevroren glycerol voorraad bij de anaërobe kamer en terug te keren naar de -80 ° C.
  7. Incubeer de plaat anaëroob nacht bij 37 ° C. Individuele geïsoleerde kolonies worden waargenomen na een nacht kweken.

4. Zuiveren Sporen van C. difficile

Zoals sporulatie is vereist voor overleving in zuurstofrijke omgeving en efficiënte overdracht van ziektes 8, de bereiding van spore voorraden often noodzakelijk zijn voor verdere toepassingen niet beperkt tot microscopie en dierstudies. Het is belangrijk op te merken dat het opsommen van sporen vereist herhaling om reproduceerbaarheid van tellingen te garanderen. En neer te pipetteren meerdere malen tussen verdunningen vermindert ook het verlies sinds sporen zich aan plastic ook.

Sporulatie van C. difficile is niet zo snel of homogeen andere sporogenic soorten. Om spore productie en herstel te optimaliseren, ofwel sporulatie medium (SMC) 17,25 of 70:30 medium 26 wordt aanbevolen. Andere media gebruikte zijn BHIS, die 4-5 dagen van groei vereist voordat efficiënte sporulatie wordt gezien 27 en Clospore, een vloeibaar medium dat hoge titers van sporen produceert (10 juli-10 augustus sporen per milliliter) na 72 uur van de groei. Andere protocollen ijskoud water dan 1x PBS 20, maar kan het gebruik van een isotone oplossing sporen van aan elkaar plakken en kunststof oppervlakken verminderen. Als alternatief,sommige onderzoekers verder te zuiveren hun sporen met behulp van een sucrose gradiënt om de vegetatieve cellen en puin 29 volledig te verwijderen.

Voordat u begint, moet de volgende items in de anaërobe tank worden bevestigd:

  • Steriel entnaalden
  • BHIS, SMC en / of 70:30 platen (zie ook Materiaal)
  • BHIS bouillon (zie ook Materiaal)
  • 1x PBS, filter-gesteriliseerd (zie ook Materiaal)
  1. Cultuur stammen uit bevroren glycerol voorraad op pregereduceerde BHIS platen en incubeer anaëroob overnacht bij 37 ° C.
  2. Restreak op verscheidene voorgereduceerd SMC of 70:30 platen en incubeer anaëroob bij 37 ° C gedurende 24-48 uur. Spore vorming kan via fasecontrastmicroscopie worden gevolgd. Sporen verschijnt fase helder terwijl vegetatieve en moeder cellen fase donker lijken. * Als alternatief kunnen sporen worden gezuiverd 70:30 vloeibaar medium na 24-48 uur, waarbij 10 5 -10 6 sporen per ml, afhankelijk strai oplevertn gebruikt.
  3. Met behulp van een steriele entnaald, schraap borden en resuspendeer de cellen in 10 ml steriel 1x PBS.
  4. Gooi borden en verwijder sporesuspensie uit de anaërobe kamer. Pellet de cellen bij 3000 g gedurende 15 minuten. Was de cellen tweemaal in 1x PBS, volledig resuspenderen de celpellet elke keer.
  5. Incubeer overnacht bij 4 ° C om te helpen bij lysis van vegetatieve moedercellen.
  6. Incubeer bij 70 ° C gedurende 20 minuten om eventuele vegetatieve cellen te doden.
  7. Om kolonie bepalen eenheden (CFU) per milliliter, serieel vul telkens spore voorbereiding in 1x PBS en plaat op BHIS + 0,1% natriumtaurocholaat. Incubeer de platen gedurende minimaal 24 uur voor het opsommen kolonies.
  8. Sporen kunnen worden opgeslagen in 1x PBS bij hetzij kamertemperatuur of 4 ° C voor langdurige opslag. Indien opgeslagen bij 4 ° C, kan het nuttig zijn om de spore bereiding warmen bij 55 ° C gedurende 15 min efficiënte kieming herstellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een voorbeeld van C. difficile geteeld op BHIS en Columbia schapen anaërobe agar media kan worden gezien in figuur 2. C. difficile vormt onregelmatige kolonies die plat zijn en beschikken over ingeslepen verschijning die duidelijk op beide media. Hier, een erytromycine gevoelige klinisch isolaat van C. difficile, 630E 30, wordt gekweekt op agar BHIS een verrijkte, niet-selectief medium gedurende 24 uur bij 37 ° C (Figuur 2A). Kolonies op Columbia schapen anaërobe agar lijken op die geteeld op BHIS onder wit licht (Figuur 2B), maar het gebruik van dit medium ook voor detectie van het groen of chartreuse fluorescentie vertoond door C. difficile op basis van lange-golf ultraviolet (UV) licht 15 (figuur 2C). C. difficile kolonies op TCCFA agar lijken op groei op BHIS agar. Door de aanwezigheid van twee antibiotica in TCCFA medium, een time periode van 48 uur groei is noodzakelijk voordat het opsommen van kolonies.

Figuur 1
Figuur 1. De Coy Laboratories Type C vinyl kamer en zijn componenten. (A) A Coy Laboratories Type C vinyl kamer die werkruimte voorziet in een enkel individu op een bepaald moment (42 inch x 32 inch). Het bevat een katalysator fan doos (linksachter), die circuleert en verwarmt de lucht, en houdt de Stak-Pak met de palladium katalysator verplicht om zuurstof besmetting te verminderen. (B) De luchtsluis dient als knooppunt en biedt een mechanisme voor de overdracht van materialen in en uit de kamer terwijl het voorkomen van aanzienlijke verontreiniging zuurstof binnen het anaëroob milieu. De sluis heeft twee deuren: een toegang tot de buitenkant van de luchtsluis en de andere toegang tot het inwendige van e e anaërobe kamer. De luchtsluis is programmeerbaar en zorgt voor aangepaste fietsen voor binnenkomst in de kamer. Deze is operationeel in automatische, semi-handmatig en handmatige modi. (C) Gebonden, flexibele latex handschoenen zijn voorzien die volledige waaier van beweging toe te staan ​​en te bereiken binnen de kamer. De handschoenen zijn bevestigd aan een gespecialiseerde manchet aan de vinyl mouwen met vinyl lijm, waardoor vervanging handschoenen zonder verstoring van de anaërobe atmosfeer van de kamer. Neopreen handschoenen zijn ook beschikbaar. (D) Het Model 10 Gas Analyzer houdt voortdurend zowel de zuurstof en waterstof niveaus die een onmiddellijke uitlezing van de sfeer in de kamer. Dit apparaat zorgt voor onmiddellijke waarschuwt als er een lek optreedt, een onjuist gasmengsel wordt gebruikt of bijkomende problemen ontstaan ​​via de akoestische alarmsignalen en een knipperende LED-licht.

ig2.jpg "/>
Figuur 2. Het uiterlijk van C. difficile kolonies op verschillende media. De karakteristieke platte, onregelmatige, geslepen glas uiterlijk is duidelijk met een erytromycine gevoelige klinisch isolaat van C. difficile, 630E 30, gekweekt op BHIS agar voor 24 uur (A) en Columbia anaërobe schapen bloed agar voor 48 uur onder wit licht (B) en lange golf ultraviolet licht (C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methoden is het mogelijk voor een eenvoudige en snel herstel van C. difficile uit verschillende fecale monsters, waaronder mensen, muizen en hamsters, alsmede de opslag van C. langdurige difficile glycerol of spore voorraden. C. difficile kan een moeilijke organisme te kweken, maar zorgvuldig onderhoud van een anaëroob milieu en de toepassing van aseptische technieken voor robuuste groei en een vermindering van verontreiniging.

Anaërobe kamers: Overwegingen en onderhoud

Er zijn twee soorten van anaërobe kamers: stijve kamers of vinyl kamers. Stijve kamers zijn meestal gemaakt van aluminium of een stijf polymeer (bijv. Plexiglas of acrylmaterialen), waardoor het gebruik van bijtende chemicaliën. Stijve kamers kunnen worden omgezet in een gloveless stijl en zijn minder gevoelig voor lekken, maar lekken zijn moeilijk te detecteren en te vinden en stijve kamers vereisen een methodecompenseren voor gas verplaatsing tijdens het gebruik. Het polymeer eenheden vaak voorzien van een alleen-zuivering luchtsluis, die meer kosten te bedienen. Voor het onderhoud van strenge atmosferische omstandigheden, kosten, flexibiliteit, laboratoriumruimte vereisten en eenvoudig onderhoud, zijn vinyl anaërobe kamers aanbevolen (Coy laboratorium producten, figuur 1A). Deze anaerobe kamer bestaat uit een vinyl handschoenenkast die wordt ondersteund door een buisvormige aluminium constructie en is verbonden met een luchtsluis dat functioneert als een knooppunt voor de overdracht van materialen in en uit de kamer (Figuur 1B), met latex of neopreen handschoenen vinyl mouwen (figuur 1C) bevestigd. Het is belangrijk om de instructies van de fabrikant voor de juiste set-up van de anaërobe kamer precies te volgen. Het kan geconditioneerd met een (of meer, afhankelijk van de grootte van de kamer) kachel box eenheden die luchtcirculatie door een palladiumkatalysator. De palladium catalyst dient om zuurstof besmetting ingevoerd via de verkeerswisselaar te verminderen door het omzetten van waterstof en zuurstof in het water. Idealiter zijn beide zuurstof en waterstof spiegels met behulp van een gasanalysator (figuur 1D), tonen zuurstofconcentratie in delen per miljoen (dpm) en waterstofconcentratie in procenten.

Vloeibare en vaste media moet vooraf zijn verminderd in de anaërobe kamer voor gebruik. Petrischalen (100 mm) kan worden verminderd twee uur vóór gebruik 31, maar moet vloeistoffen nachts worden verminderd. Belangrijkste is dat de media vóór de overdracht naar de kamer om vloeibare knipperen tijdens luchtsluis evacuatie voorkomen worden gekoeld. Plastic verbruiksgoederen, zoals 96-putjes, worden overnacht voorgereduceerd voor gebruik plastic is poreus en kan zuurstofmoleculen opslaan 32. Afhankelijk van de toepassing, sommige kunststoffen moet vooraf worden verminderd tot 48 uur vóór gebruik 33. Biohazard afval moet be verwerking ervan. Een kleine biohazard zak mag in de kamer blijven, maar moet regelmatig worden vervangen.

Een waterstof concentratie van ten minste 3% moet worden gehandhaafd binnen de kamer, omdat zo zowel goede groei C. difficile en efficiënt zuurstof te verwijderen. Als de waterstofconcentratie beneden 3% of wanneer de kamer niet wordt gebruikt voor meerdere dagen, dienen een kamer cyclus uitgevoerd om de waterstofconcentratie herstellen gewenst niveau. Hier wordt ongeveer een derde van het gas in de kamer gestofzuigd (de doos vinyl zal aanzienlijk leeglopen) en vervangen door verse gasmengsel. Zorg ervoor dat de luchtsluis is anaërobe voordat u begint. Verpompt teveel gas in de kamer moet worden vermeden, omdat deze plaatsen niet alleen onnodige stress op de vinyl zak, maar zal ook de weg aan de gebruiker uit tot in de achterkant van de kamer. Altijd deze procedure in een goed geventileerde ruimte. Neem extra voorzorgsmaatregelen als de chamber wordt bewaard in een kleine, slecht geventileerde ruimte. Open alle deuren naar de kamer als de inhoud van gas in de kamer van de gebruiker kan verstikken.

Extra onderhoud omvat regeneratie van de palladium katalysator om efficiënt zuurstof verwijdering binnen de kamer te verkrijgen. Zuurstof en waterstof worden verminderd door de katalysator, kan water ophopen op het oppervlak van de palladium beklede aluminium pellets, waardoor hun goede werking. Om dit te ondervangen dient de palladium-katalysatoren ten minste eenmaal per week worden geregenereerd door bakken bij minstens 230 ° C gedurende een uur. Bovendien, als gevolg van zowel zuurstof reductie en verdampen van water uit platen en media, water accumulatie is een veel voorkomend probleem in anaërobe kamers. Om comfortabele manipulatie en voor de verbetering van de halfwaardetijd van de apparatuur binnen de kamer, kan droogmiddel verpakkingen worden gebruikt, maar moet worden gedroogd regelmatig volgens dezelfde procedure gebruikt voor het palladium katalysatoren. Als alternatief, een debevochtiger worden gebruikt die de lucht circuleert door een metalen blok, dat het water condenseert en wordt opgevangen in een container. Voorkomt het apparaat dat overloop van het water containers, maar moet ontvochtigers worden gecontroleerd en containers moeten bij bijna volledig worden geleegd. Om de vinyl kamer schoon te maken, is het gebruik van een zachte doek en ander in de handel verkrijgbaar reinigingsmiddel aanbevolen voor polyvinylchloride (PVC) geadviseerd (bijv. Plastic Magic Cleaner, best. 1.600.480, Coy Laboratories). Om krassen of beschadiging van het vinyl kamer te voorkomen, geen gebruik maken van papieren handdoeken, Kim-doekjes of producten die ketonen of andere verbindingen die PVC beschadigen.

Tenslotte C. difficile produceert waterstofsulfide (H2S), die zeer reactief en corrosief. Waterstofsulfide kan schadelijk zijn voor instrumentatie, het palladium katalysator en blootgestelde metalen. Indien mogelijk, geen enkel instrumentatie niet weg, zoals homogeniseerders en spectrofotometers, in de chamber langere tijd corrosie door waterstofsulfide voorkomen. Door de productie van waterstofsulfide zal artikelen zoals palladium katalysator en gasanalysator moeten periodiek worden vervangen als onderdeel van normale kamer onderhoud. Alternatieven voor het verminderen van waterstofsulfide niveaus binnen de kamer, zoals het gebruik van actieve kool, loodacetaat, zilverchloride of zilver sulfaat absorberen of chemisch verwijderen waterstofsulfide, beschreven 34 en kan worden gebruikt om vertragen corrosie van apparatuur.

Extra voorzorgsmaatregelen

Open nooit een deur naar de luchtsluis zonder om de andere deur gesloten en vergrendeld om zuurstof verontreiniging te voorkomen. Bovendien, gebruik geen scherpe voorwerpen in de kamer om het risico van doorprikken het vinyl verminderen.

Het is belangrijk op te merken dat waterstof een brandbaar gas in de aanwezigheid van zuurstof. Wees voorzichtig bij het invoeren van artikelen into de kamer die hoge zuurstof verontreiniging voordoen niet (meer dan 999 ppm). Het is belangrijk om alleen voorgemengde onbrandbaar anaërobe gasmengsel gebruiken en nauwlettend toezien op de gas analyzer binnen de kamer, vooral bij gebruik van een nieuwe gastank. Als zowel waterstof en zuurstof concentraties van meer dan 4% optreden, zorgen dat de juiste noodprocedures, die in standaard operationele procedures van het laboratorium (SOP) moet worden geschetst, worden gevolgd.

Problemen C. difficile groei

Als slechte groei van C. difficile culturen wordt waargenomen in rijk medium, is dit meestal te wijten aan zuurstof verontreiniging in de kamer. De toevoeging van een reductiemiddel (bijv. L-cysteïne of thioglycolaat) aan het medium kan de groei te verbeteren, maar de afgifte van zuurstof verontreiniging in de kamer zou moeten worden aangepakt. Monitoring van zuurstof en waterstof niveaus binnen de kamer met behulp van een gas analyzer kan snel eenlert de gebruiker om problemen voor een vertraging in de voortgang en afname van de productiviteit optreedt. Als er zuurstof besmetting optreedt, snel identificeren van de bron met een gaslek detector (verkrijgbaar bij Coy Laboratories) wordt geadviseerd. Om de kans op het vinden van de locatie van een lek te vergroten, kan een doekje gedrenkt in alcohol in de kamer worden geplaatst omdat de gaslekdetector verhoogde koolwaterstoffen evenals verhoogde niveaus van waterstof kan identificeren. Wanneer de bron van de lekkage wordt gevonden, kan het worden gerepareerd met behulp van lijm of silicone de instructies van de fabrikant.

Een aantal organismen gemakkelijk groeien in anaërobe omgevingen, waaronder andere gemeenschappelijke Clostridium soorten (bijv. Clostridium perfringens) en het facultatief anaërobe, Escherichia coli. Aseptische techniek en andere strategieën kan het risico van besmetting te verminderen. Goede organisatie binnen de kamer, zoals het plaatsen van voorwerpen binnen handbereik om de potentiële f verminderenof morsen en snelle verwijdering van opgehoopte biologisch gevaarlijk afval, kan besmetting risico's te beperken. Daarnaast kunnen papieren handdoeken, bevochtigd met een verdunde bleekwater oplossing periodiek worden gebracht in de kamer te vegen van oppervlakken en de latex of neopreen handschoenen. Het is cruciaal om geen bleekmiddel of alcohol oplossingen binnen de kamer te verlaten voor langere tijd als deze kunnen de sfeer en vaste en vloeibare media doordringen, het doden van C. difficile, alsook beschadiging van de folie 34. Daarnaast kunnen regelmatige vervanging van de latex of neopreen handschoenen ook besmettingsrisico te verminderen. Zoals hierboven vermeld, als onzeker als een organisme C. difficile of verontreiniging, kan een test op de aanwezigheid van de tdcB gen met PCR snel vaststellen of het organisme C. difficile 21. Tenslotte, indien kweken meerdere organismen in dezelfde anaerobe kamer, is het belangrijk op te merken dat C. difficile kan metabolische bijproducten produceren (e. G. Waterstofsulfide) die de groei van andere anaërobe organismen en vice versa remmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Wij willen Coy Laboratories bedanken voor vriendelijk verstrekken van foto's van de anaërobe kamer. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie ​​DK087763 (SMM) en een STEP / HHMI Leerplanontwikkeling Fellowship (ANE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Proteose Peptone no. 2 BD 212120
Na2HPO4 Fisher S373
KH2PO4 Fisher BP362
NaCl Fisher S27
MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
á´…-Fructose Fisher L96
Sodium taurocholate Sigma T4009
á´…-cycloserine Sigma C6880
Cefoxitin Fluka C4786
Brain heart infusion medium BD 237300
Proteose Peptone BD 211684
(NH4)2SO4 Sigma A5132
Tris base Fisher BP152
Agar BD 214010
L-cysteine Sigma C7755
BactoPeptone BD 211684
Columbian sheep blood agar Fisher L21928
NaCl Fisher S27
KCl Fisher P217
Glycerol Fisher BP2291
Sterile inoculating loops Fisher 22363596
Sterile swabs Fisher 1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar

Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

After autoclaving, add:
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

BHIS Medium

Brain heart infusion 37 g
Yeast extract 5 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):

3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

SMC Sporulation Medium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):
3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3.5 g
Brain heart infusion 11.1 g
Yeast extract 1.5 g
(NH4)2SO4 0.7 g
Tris base 1.06 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

Blood agar

The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

1X Phosphate buffered saline (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
  2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
  3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
  4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
  5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
  6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
  7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
  8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
  9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
  10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
  11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
  12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
  13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
  14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
  15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
  17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
  18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
  19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
  20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
  21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
  22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
  23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
  24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
  25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
  26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. (2013).
  27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
  28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
  29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
  30. O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
  31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
  32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
  33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. (2012).
  34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
  35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats