Legame covalente di BMP-2 su superfici utilizzando un auto-assemblato Monolayer Approccio

Chemistry

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Summary

Noi descriviamo un metodo per realizzare immobilizzazione efficiente di BMP-2 sulle superfici. Il nostro approccio si basa sulla formazione di un monostrato auto-assemblato per realizzare il legame di BMP-2 attraverso i suoi residui amminici liberi covalente. Questo metodo è un utile strumento per studiare la segnalazione alla membrana cellulare.

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Pohl, T. L., Schwab, E. H., Cavalcanti-Adam, E. A. Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach. J. Vis. Exp. (78), e50842, doi:10.3791/50842 (2013).

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Abstract

Proteina morfogenetica 2 (BMP-2) è un fattore di crescita incorporato nella matrice extracellulare del tessuto osseo. BMP-2 funge da innesco della differenziazione delle cellule mesenchimali in osteoblasti, stimolando così la guarigione e la formazione ossea novo de. L'uso clinico di ricombinante umano BMP-2 (rhBMP-2) in combinazione con ponteggi ha sollevato controversie recenti, in base alla modalità di presentazione e l'importo da erogare. Il protocollo qui presentato fornisce un modo semplice ed efficace per fornire BMP-2 per studi in vitro su cellule. Si descrive come formare un monostrato auto-assemblato composto da un linker eterobifunzionale, e mostriamo la successiva fase vincolante per ottenere l'immobilizzazione covalente di rhBMP-2. Con questo approccio è possibile ottenere una presentazione sostenuta di BMP-2, pur mantenendo l'attività biologica della proteina. Infatti, l'immobilizzazione superficie di BMP-2 consente indagini mirate impedendo annunci aspecificheorption, riducendo la quantità di fattore di crescita e, in particolare, ostacolando rilascio incontrollato dalla superficie. Entrambi gli eventi di segnalazione a breve e lungo termine, innescato da BMP-2 si svolgono quando le cellule sono esposte a superfici che presentano covalentemente immobilizzato rhBMP-2, rendendo questo approccio adatto per studi in vitro sulle risposte cellulari ai BMP-2 stimolazione.

Introduction

Proteina morfogenetica ossea 2 (BMP-2) è un membro del fattore di crescita trasformante (TGF-β) famiglia e agisce come induttore del de novo formazione ossea e regolatore di diversi tessuti durante lo sviluppo embrionale e adulta omeostasi 1-3. Ogni monomero del omodimerica BMP-2 proteina biologicamente attiva contiene un motivo "cisteina nodo", che è altamente conservata in tutti BMP 4. Sei dei sette residui di cisteina formano legami disolfuro intramolecolari che stabilizzano ciascun monomero, mentre la settima cisteina è coinvolto nella dimerizzazione, formando un legame intermolecolare tra i due monomeri 5,6. Questo nodo di cisteina altamente conservati definisce la struttura tridimensionale della proteina BMP-2 e determina le proprietà uniche, come la resistenza al calore, denaturanti e acido pH 7-9. BMP-2 si lega a serina / treonina chinasi recettori transmembrana, inducendo così la trasduzione del segnale 12-14.

In osso, BMP-2 induce la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in osteoblasti, stimolando così la guarigione e de novo formazione di osso. Attualmente, ricombinante espresso BMP-2 è applicata clinicamente per migliorare la guarigione di siti fratturati. Una strategia comune in ingegneria del tessuto osseo è l'uso di fattori di crescita iniettabili, che è meno invasivo rispetto a sistemi di applicazione locale. Tuttavia, studi in vivo ed applicazioni cliniche hanno dimostrato che la breve emivita biologica, loc aspecificalizzazione e rapida domiciliazione del BMP-2 può portare a diversi problemi locali, ectopiche e sistemiche 15. Quindi, per ottenere una presentazione efficace, l'intrappolamento o immobilizzazione di BMP-2 all'interno o sul materiale necessario alla sua consegna locale e costante a sito bersaglio. Consegna sostenuta può essere ottenuto con metodi di conservazione non covalenti, come intrappolamento fisico, adsorbimento o complessazione di ioni 16. Tuttavia, è noto che adsorbimento non specifico di proteine ​​su superfici può causarne la denaturazione delle molecole 17. Per il legame di fattori di crescita covalente, diversi tipi di supporti sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni. L'uso di molecole bifunzionali che mirano linking amminici o carbossilici gruppi della proteina per esempio, è un tipo di approccio che non richiede necessariamente modificazione delle proteine ​​per raggiungere la sua immobilizzazione. Infatti, mentre modificazione delle proteine ​​offre il vantaggio di controllare l'orientamento proteine,l'introduzione di domini artificiali, tag e catene peptidiche specifiche del sito può alterare l'attività biologica di fattori di crescita 17. Così, per aggirare denaturazione dovuta all'interazione con il materiale di supporto, le superfici possono essere funzionalizzati anticipo, per esempio, con un monostrato auto-assemblato (SAM) di una molecola di collegamento, seguito da accoppiamento del fattore desiderato 18. Abbiamo usato un approccio basato SAM per immobilizzare covalentemente BMP-2 su una superficie di mira i suoi residui amminici liberi e abbiamo dimostrato che la proteina immobilizzata mantiene sia la sua attività biologica a breve e lungo termine 19. Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficace per fornire BMP-2 alle cellule per studi in vitro sui meccanismi che si verificano a livello della membrana cellulare e regolano segnalazione intracellulare responsabili per la segnalazione osteogenico.

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Protocol

1. Sintesi di 11-Mercaptoundecanoyl-N-idrossisuccinimmide Ester (MU-NHS)

  1. Aggiungere goccia a goccia una soluzione di 500 mg di N-idrossisuccinimmide e 30 mg 4 - (dimetilammino) piridina in 10 ml di acetone (pa) a 1 g di acido 11-mercaptoundecanoic in 40 ml di diclorometano (pa) a temperatura ambiente (RT).
  2. Raffreddare la reazione a 0 ° C e aggiungere goccia a goccia 1,1 g N, N '-dicicloesilcarbodiimmide in 10 ml di diclorometano (in atmosfera di azoto). Mantenere la reazione a bassa temperatura per 1 ora e poi agitare a temperatura ambiente durante la notte.
  3. Filtrare il precipitato e asciugare sotto pressione ridotta. Purificare il prodotto mediante cromatografia flash con benzene petrolio e acetato di etile (pa) in un rapporto di 1:1.

2. Preparazione di strati d'oro omogenei

  1. Vetrini pulite con panni di precisione e sonicare per 5 minuti in una soluzione contenente una miscela 1:1 di acetato di etile (pa) e metanolo (pa). Rinse substrati con metanolo e asciugare sotto flusso di azoto.
  2. Posizionare i supporti puliti nel dispositivo di rivestimento polverizzazione. Evacuare la camera. Rimuovere lo strato di ossido di cromo superiore dal bersaglio di cromo sputtering per 60 sec. Porre i campioni sotto la trave di metallo e ricoprirli con uno strato di cromo 10 nm, seguita da rivestimento con uno strato di oro 40 nm.

3. Immobilizzazione superficie di BMP-2

  1. Sciogliere MU-NHS in N, N-dimethlyformamide (DMF) a una concentrazione finale di circa 1 mM e incubare substrati d'oro nella soluzione MU-NHS a temperatura ambiente per 4 ore sotto atmosfera di azoto.
  2. Superfici Sonicare in DMF per 2 minuti, sciacquare con DMF e MeOH e asciugare sotto flusso di azoto.
  3. Preparare una soluzione stock di rhBMP-2 in sterile HCl 4 mm, con una concentrazione di 100 pg / ml (negozio aliquote a -80 ° C). Per diluizioni di lavoro (3,5 mcg / ml), diluire la soluzione madre in PBS / NaCl (PBS contenente 1 M NaCl) e unegolare a pH 8,5 immediatamente prima dell'uso.
  4. Incubare superfici funzionalizzate MU-NHS nella soluzione rhBMP-2 ore a 4 ° C per una notte. Rimuovere il surnatante incubazione. Superfici Sonicare in PBS / NaCl per 2 minuti e lavare 3x con PBS sterile / NaCl.

4. Caratterizzazione superficiale

  1. Per bloccare l'adsorbimento non specifico di anticorpo, incubare superfici con BSA 5% (w / v) in PBS per 1 ora a RT, seguita da incubazione con un anti-BMP-2 anticorpi (1:100 in 1% (w / v ) soluzione di BSA / PBS) per 1 ora a RT. Lavare le superfici due volte con PBS e ultrasuoni per 30 sec.
  2. Incubare substrati con HRP-anticorpo secondario coniugato (1:1000 in 1% (w / v) di BSA / PBS) per 30 min a temperatura ambiente, poi lavare due volte con PBS.
  3. Utilizzare Ampliflu test Red per misurare l'attività enzimatica HRP a 570 nm con un lettore di piastre.

5. Analisi dell'attività biologica

  1. Seed 1 x 10 5 topo C2C12 mioblasti per pozzetto in 6 pozzetti plAtes in terreno di coltura, costituiti da un elevato glucosio DMEM contenente piruvato supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina e incubare per 24 ore a 37 ° C / 5% di CO 2.
  2. Morire di fame cellule in DMEM senza siero per 3-5 ore prima di semina sulle superfici decorate con immobilizzata BMP-2.
  3. Per le indagini dell'induzione segnalazione breve termine, sostituire il mezzo da 200 microlitri DMEM fresco senza siero e posizionare le immobilizzati BMP-2 superfici sopra le celle. La superficie deve essere maneggiato con le pinzette punta fine per evitare di graffiare.
  4. Rimuovere delicatamente le superfici e aspirare il terreno con una pipetta, lavare le cellule due volte con PBS. Procedere all'analisi delle risposte delle cellule.
  5. Per l'analisi dell'attività biologica a lungo termine, cellule piastra su superfici e cultura loro a 37 ° C / 5% di CO 2 in condizioni di siero bassi (2% FBS) per sei giorni.

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Representative Results

Nella nostra configurazione, l'oro è stato scelto come eccipiente in quanto fornisce un sistema biologicamente aspecifica ma chimicamente sintonizzabile. Inoltre, l'applicazione di monostrati auto-assemblaggio comporta molti vantaggi: SAM adsorbe spontaneamente tramite loro "testa-gruppi" a metalli e formare monostrati con pochi difetti, mentre i loro gruppi terminali funzionali possono essere ulteriormente modificati. Così prevedono la piattaforma per adattare le proprietà dell'interfaccia controllata in modo ancora altamente adattabile 20.

Per l'immobilizzazione di BMP-2 su superfici ricoperte d'oro, abbiamo utilizzato un approccio in due fasi: 1) il legame linker MU-NHS allo strato d'oro, e poi 2) far reagire il linker con la proteina (vedi Figura 1). Per dimostrare il legame del rhBMP-2, abbiamo utilizzato un test immuno-enzimatico. In questo saggio, presentando superfici immobilizzato rhBMP-2 sono stati incubati con un BMP-2 anticorpo specifico e un anticorpo secondario coniugato con HRP. L'associazione di questi ultimi può essere dDeterminati utilizzando una soluzione Ampliflu rosso. In presenza di perossido di idrogeno, HRP catalizza la conversione del incolore Ampliflu Rosso (10-acetil-3 ,7-dihydroxyphenoxazine) nel resorufina composto fluorescente. Abbiamo rilevato superficie immobilizzato rhBMP-2 (IBMP-2) prima e dopo l'accostamento cellule aderenti dall'alto con superfici funzionalizzate. Si noti che per la rilevazione di rhBMP con il saggio Ampliflu Red, i campioni sono sottoposti a diverse fasi di incubazione e trattamenti. Pertanto, non è possibile esaminare la stessa superficie prima e dopo stimolazione cellulare. Figura 2A mostra il successo vincolante della rhBMP-2 alla superficie in una conformazione riconosciuta dalla IgG anti-BMP-2. Figura 2B mostra un IBMP- 2 superficie che è stata usata per stimolare le cellule per 30 minuti prima della immunodosaggio HRP. Anche dopo stimolazione cellulare della proteina viene rilevato sulla superficie.

Le risposte delle cellule alle superfici che presentano rh immobilizzatoBMP-2 sono state valutate e confrontate con l'effetto di oro substrati non trattati (controllo negativo). Al fine di minimizzare l'influenza del processo di adesione sull'analisi della segnalazione breve termine, uno speciale set-up è stato sviluppato per la stimolazione delle cellule. Qui, cellule C2C12 sono state stimolate per 30 min in rhBMP-2 superfici funzionalizzate avvicinano dall'alto. La linea cellulare di mioblasti C2C12 topo è una linea di cellule precursori mesenchimali pluripotenti, che è ampiamente utilizzato come sistema modello per studiare la fase iniziale della differenziazione osteogenica durante la formazione ossea nei tessuti muscolari. In questo modello, BMP-2 inibisce la differenziazione delle cellule multinucleate in miotubi e induce osteoblasti fenotipi 21. L'attivazione di Smad 1/5/8, che sono reporter a valle della via di segnalazione BMP-2, viene analizzato mediante Western blotting. Come mostrato in Figura 3A, Smad fosforilazione si osserva dopo 30 min di stimolazione da IBMP-2, mentre non si verifica alcun fosforilazione di Smad 1/5/8in cellule esposte a campioni di oro non trattati. Questo risultato indica che il processo di immobilizzazione non altera BMP-2 a breve termine e innesca i primi passi nella segnalazione Smad.

Per determinare se IBMP-2 colpisce differenziamento osteogenico a lungo termine, il livello di espressione di fosfatasi alcalina (ALP), un marcatore osteogenico, è stata studiata mediante un saggio colorimetrico. Attività ALP delle cellule C2C12 è stata misurata dopo incubazione delle cellule per 6 giorni su oro pianura (controllo) e IBMP-2 superfici. Attività ALP in lisati di cellule coltivate su superfici IBMP-2 mostra un assorbimento significativamente maggiore rispetto al controllo (Figura 3B). Questo risultato rivela che IBMP-2 induce l'espressione del marcatore ALP osteogenico in cellule C2C12. Questa linea cellulare è noto per differenziare raggiungimento confluenza in condizioni di scarsa siero, formando così miotubi e caratteristici esprimere proteine ​​miogenico. Tuttavia, il trattamento con BMP-2 provoca uno spostamentoil percorso di differenziazione da myoblastic a osteoblastica, quindi sopprimendo la formazione di miotubi. Per studiare l'effetto di IBMP-2 sulla miogenesi, cellule C2C12 sono state piastrate direttamente su oro (controllo) o superfici funzionalizzate e coltivate sotto differenziazione (basso siero) condizioni. Dopo 6 giorni, è stata eseguita la colorazione di catena pesante della miosina (MHC). Come mostrato nella Figura 3C, cellule C2C12 non riescono a formare MHC miotubi positivi in presenza di IBMP-2, ma non su substrati d'oro.

Figura 1
Figura 1. Schema del processo di immobilizzazione rhBMP-2 su superfici d'oro. Vetrini sono ricoperte da uno strato di oro e successivamente incubato con un legante eterobifunzionale (MU-NHS) risultante in un monostrato auto-assemblato NHS-funzionalizzato (SAM). Ammine primarie di BMP-2 reagiscono con il linker che porta a covalentemente proteina immobilizzata sul substrato. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2. Surface-legato rhBMP-2 può essere rilevata mediante immunodosaggio enzimatico prima (A) e dopo (B) esperimenti di stimolazione cellulare. Immobilizzati rhBMP-2 è stata quantificata utilizzando Ampliflu Red colorimetrico saggio. L'assorbimento è stata misurata a 570 nm ed i dati sono stati normalizzati per il controllo (non trattato superfici d'oro) valori. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media n> 3.

Figura 3
Figura 3. Immobilizzato rhBMP-2 rimane biologicamente attiva e induce a breve terminenonché eventi di segnalazione a lungo termine. (A) cellule C2C12 sono state stimolate per 30 minuti dall'esposizione a superfici d'oro (controllo) e con superfici covalentemente immobilizzato rhBMP-2 (IBMP-2) si avvicina dall'alto. Dopo lisi cellulare, i campioni sono stati immunoblotting per p-Smad1/5/8 e β-actina. (B) L'attività enzimatica della fosfatasi alcalina (ALP) indica osteogenico differenziazione delle cellule C2C12 ed è stata misurata da lisati cellulari dopo 6 giorni di incubazione periodo sul controllo o IBMP-2 superfici, rispettivamente. Attività ALP è stata misurata con assorbanza a 405 nm. Bar grafico mostra i dati acquisiti dopo una reazione di 60 min. Le barre di errore indicano la deviazione standard, n = 3, * p <0,01. (C) cellule C2C12 sono state seminate su superfici indicate e coltivate per 6 giorni in condizioni di scarsa siero per consentire miogenesi. Le immagini mostrano miosina catena pesante (MHC) colorazione dei miotubi multinucleati (verde) e DAPI nuclei colorazione (blu). Immagine di ingrandimento 20x.

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Discussion

In questo protocollo si descrive la preparazione di superfici funzionalizzate con bioattivo rhBMP-2. Questo approccio comprende due fasi: 1) la formazione iniziale di una auto-assemblaggio monostrato (SAM) di un linker bifunzionale sulla superficie di oro; 2) immobilizzazione covalente della proteina rhBMP-2. Nel lavoro precedente, abbiamo convalidato l'effettivo legame del linker bifunzionale e il fattore di crescita, e dimostrato che in superficie immobilizzato rhBMP-2 mantiene la sua attività biologica 19. La bioattività di fattori di crescita presentati in forma immobilizzata è stato anche dimostrato in altri studi, indicando che il rilascio delle proteine ​​e la loro successiva internalizzazione non sono essenziali per la stimolazione delle cellule 24,25. Infatti, l'immobilizzazione covalente di fattori di crescita permette la stimolazione prolungata delle cellule bersaglio mantenendo un dosaggio efficace a causa del tasso di soggiorno migliorata di diversi tipi di recettori sulla membrana cellulare 22,23,26-28.

Per la preparazione delle superfici che presentano immobilizzato rhBMP-2, la cura dovrebbe essere presa nella gestione delle superfici in tutta la procedura e nella preparazione della soluzione rhBMP-2. I vetrini devono essere puliti e asciutti e senza segni di difetti o impurità devono essere visibili. Graffiare la superficie con le pinzette e pipette deve essere evitato. Per la funzionalizzazione passo superficie con rhBMP-2, è indispensabile utilizzare una proteina ricombinante carrier-free, cioè senza aggiunta di albumina sierica bovina nella preparazione, per evitare indesiderate immobilizzazione del vettore sulla superficie. Lo stock rhBMP-2 (100 mcg / ml) viene disciolto in HCl 4 mM. Quando le superfici vengono incubati con la soluzione rhBMP-2, il pH deve essere regolato in folle a leggero pH alcalino per migliorare la reazione del gruppo amminico della proteina con il gruppo NHS del linker-vincolati superficie. Se il pH è troppo basso, il gruppo NHS può essere idrolizzato prima che possa reagire spiritoh i gruppi amminici della proteina. Usiamo PBS contenente 1 M NaCl 29 e aggiungiamo rhBMP-2 a magazzino e quindi regolare il pH con KOH (10 mm).

Con questo protocollo abbiamo raggiunto l'immobilizzazione successo bioattivo rhBMP-2 su superfici perché: 1) abbiamo stabilito un approccio in due fasi, 2) abbiamo usato un linker appropriato per ottenere la distanza dalla superficie e di legare la proteina senza grandi interferenze sulla sua interazione con il recettore. Il alkanethiol ammina-reattiva, estere 11-mercaptoundecanoyl-N-idrossisuccinimmide (MU-NHS), è stato legato al substrato oro nel primo passaggio. Come alcantioli auto-assemblano in metalli come oro, formando un monostrato altamente ordinato, facilitano la decorazione di superfici con una varietà di molecole linker 30-32. La SAM biomolecole protegge dal contatto diretto con la superficie solida, minimizzando così il rischio di denaturazione 32. Inoltre, la lunghezza del linker determina anche la reactivity del SAM. I gruppi NHS di linker costituiti da almeno undici atomi di carbonio, come il MU-NHS, sono più accessibili, con conseguente aumento immobilizzazione di proteine ​​rispetto al legame linker brevi 34. L'immobilizzazione di rhBMP-2 avviene attraverso lo spostamento del gruppo NHS dai residui di lisina della proteina 34. Considerando soltanto l'ambiente sterico, la reazione dei gruppi NHS-superficiali immobilizzato avviene molto probabilmente luogo ai residui N-terminali flessibili 35. Tuttavia, come illustrato ad altri ligandi, la lunghezza e la flessibilità del linker potrebbe consentire l'interazione con altrimenti stericamente impedita siti di legame, compensando così orientamento sfavorevole 36,37. In inedito abbiamo confrontato il one-step con una strategia immobilizzazione due fasi. Il confronto tra l'utilizzo di una soluzione contenente proteine ​​e linker, e il legame del linker e la proteina di superficie sequenziale, ha mostrato che solo il duestrategia passo determinato bioattivo ligando immobilizzazione. Questo potrebbe essere dovuto ad un effetto schermante della SAM, che ostacola la denaturazione delle proteine ​​che potrebbero altrimenti avere luogo su oro. Inoltre, poiché il linker è già ancorato alla superficie, reticolazione tra proteine ​​attraverso i gruppi terminali dei linker e loro inattivazione conseguente elusione 38.

Per gli esperimenti con cellule stimolate con superficie immobilizzato rhBMP-2, è fondamentale per determinare in anticipo che C2C12 non formano miotubi nel pallone di coltura prima della semina loro sul substrato. Pertanto, le cellule devono essere tenute in coltura subconfluente. Il lotto di siero fetale bovino utilizzato per la coltura e per gli esperimenti deve essere testato per garantire che non stimoli osteogenico sono presenti. Questa operazione viene eseguita utilizzando il test Quantikine per rilevazione di proteine ​​morfogenetiche ossee e testando le cellule per marcatori di differenziazione osteogenica, ad esempio Alkal espressione di fosfatasi ine. Durante la manipolazione dei substrati per la stimolazione dall'alto di culture, è ancora importante evitare eventuali graffi con le pinzette. Essiccamento della cultura e spremitura delle celle deve essere evitata in ogni caso, altrimenti distorsione e morte cellulare influenzeranno negativamente la risposta a BMP-2 stimolazione. Si consiglia di pipettaggio circa 100 ml di DMEM in ogni pozzetto di una piastra da 6 pozzetti, in cui le cellule vengono coltivate prima di applicare il substrato sulle celle. Le cellule devono essere osservate al microscopio per assicurare che nessun cambiamenti morfologici sono innescati dalla presenza delle superfici sopra le culture. Infine, quando si rimuovono i supporti, un lato è alzato attentamente con le pinzette e il substrato viene delicatamente staccata. Un controllo immediato per qualsiasi danno cellulare con un microscopio in campo chiaro deve essere eseguita, nonché un controllo dei substrati per determinare se sono presenti eventuali attacchi delle cellule o le impurità principali.

_content "> In conclusione, la procedura in due fasi presentata fornisce uno strumento utile per immobilizzare rhBMP-2 su substrati con residui amminici per studiare l'impatto sulle risposte cellulari. La strategia descritta combina molti vantaggi. Da un lato, non è limitato a BMP-2, ma può essere applicato anche ad altri fattori di crescita della famiglia BMP, dal momento che presentano una struttura aminoacido altamente conservata. D'altra parte, impedendo adsorbimento non specifico, questo approccio permette lo studio di BMP-2 mirati , riducendo la quantità di fattore di crescita e, in particolare, ostacolando rilascio incontrollato dalla superficie.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Prof. JP Spatz (Dipartimento di chimica biofisica, Università di Heidelberg e attrezzature dei nuovi materiali e dei Biosistemi, Istituto Max Planck per Sistemi Intelligenti, Stuttgart) per il suo supporto gentile. Il sostegno finanziario della Max-Planck-Gesellschaft e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 a EAC-A.) Sono notevolmente riconosciuto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 130672  
4-(dimethylamino)pyridin Sigma-Aldrich 522805  
Acetone AppliChem A2282  
11-mercaptoundecanoic acid Sigma-Aldrich 674427  
Dichlormethane Merck 106050  
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Sigma-Aldrich D80002  
Petroleum benzene Merck  
Glass coverslips Carl Roth M 875  
Ethylacetate AppliChem A3550  
Methanol Carl Roth 4627  
N,N-dimethylformamide Carl Roth T921  
rhBMP-2 R&D Systems 355-BM Carrier-free; expressed in E.coli
PBS PAA H15-002  
NaCl Carl Roth HN00.2  
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) Dow Corning  
Sylgard 184 silicone elastomer kit Dow Corning  
Anti-rhBMP-2 Sigma B9553  
Goat anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz sc-2005 Secondary antibody
Ampliflu Red assay Sigma 90101  
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid Gibco 41966 High glucose
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F7524 Sterile filtered, cell culture tested
Pen/Strep Gibco 15140  
Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na Gibco 25300  
Glycine (0.1 M) Riedel-de Haën 33226  
IGEPAL CA-630 (1%) Sigma I8896 Lysis buffer (ALP assay)19
Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) Carl Roth HNO3.2  
Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) Carl Roth 3533.1  
p-nitrophenylphosphate (pNPP) Sigma S0942 Phosphatase substrate
Anti-mysin heavy chain (MHC) Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa MF20 Monoclonal antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG Invitrogen A11001  
DAPI Sigma D9542  
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz BANDELIN electronic GmbH Co. KG  
MED 020 Sputtercoating system BAL-TEC AG Coating conditions
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate reader Tecan  

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References

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