השתלות subretinal של תאי קולטי אור MACS המטוהר מבשר למבוגרי עכבר הרשתית

1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden
* These authors contributed equally
Published 2/22/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J. Vis. Exp. (84), e50932, doi:10.3791/50932 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ליקוי ראייה ועיוורון עקב האובדן של תאי חישת אור של הרשתית, כלומר קולטני האור, מייצגים את הסיבה העיקרית למוגבלות במדינות מתועשות. החלפה של קולטני אור מנוון על ידי השתלת תאים מייצגת אפשרות טיפול אפשרית ביישומים קליניים בעתיד. ואכן, מחקרים פרה האחרונים הוכיחו כי קולטני אור לא בוגר, מבודד מרשתית העכבר בילוד ביום הלידה 4, יש את הפוטנציאל להשתלב ברשתית העכבר המבוגר לאחר השתלת subretinal. תאי תורם שנוצרו מורפולוגיה קולטי אור בוגרת כוללים קטעים פנימיים וחיצוניים, גוף תא עגול הממוקם בשכבה החיצונית הגרעינית, ומסופים הסינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגני. ואכן, דיווחים עדכניים הראו כי קולטני אור תורם לשלב תפקודי לתוך המעגלים העצביים של עכברים מארחים. ליישום קליני בעתיד של גישת החלפת תא כזה, השעיות מטוהריםשל התאים של בחירה צריכה להיות שנוצר והוצב בעמדה הנכונה להשתלבות נכונה בעין. להעשרה של מבשרי קולטי אור, מיון צריך להיות מבוסס על פני השטח אנטיגנים תא ספציפיים, כדי למנוע שינוי כתב גנטי של תאי תורם. כאן אנו מראים תא הקשורים מגנטי מיון (MACS) - העשרה של מבשרי קולטי אור מוט השתלה מבודדים מהרשתית בילוד של עכברי כתב קולטי אור ספציפי המבוססים על CD73 הסמן פני התא. דגירה עם נוגדנים נגד CD73 ואחריו נוגדני מיקרו חרוז מצומדת משניים אפשרו להעשרה של מבשרי קולטי אור מוט ידי MACS כ 90%. בהשוואה לcytometry זרימה, יש MACS יתרון שזה יכול להיות קל יותר שימושי לתקני GMP וכי כמויות גבוהות של תאים ניתן למיין בתקופות זמן קצר יחסית. הזרקה של השעיות תא מועשרת לחלל subretinal של עכברים בוגרים פראי מהסוג הביאה compar שיעור אינטגרציה של פי 3 גבוה יותראד להשעיות תא ממוינים.

Introduction

ראייה היא אחד החושים העיקריים של בני אדם. ירידת ערך של תחושה זו ועיוורון הוא אחת הסיבות העיקריות לאובדן כושר במדינות מתועשות. הגורם הראשי לליקוי ראייה או עיוורון הוא ניוון רשתית, המתאפיין באובדן תאי קולטי אור, כפי שהוא יכול להיות שנצפה בניוון מקולרי, רטיניטיס פיגמנטוזה, ניוון חרוט מוט, ותנאים אחרים. נכון להיום, טיפול יעיל כדי לשחזר את הראייה שאבדה אינו זמין. ב2006 ו 2008 שתי מעבדות שונות דיווחו, עצמאי מהשני, השתלה מוצלחת של תאי קולטי אור מבשר מוט לעכברים בוגרים פראי מסוג רשתיות 1,2. לפיכך, הנובע האפשרות של השתלת תאי קולטי אור מבשר גם לתוך רשתית מנוונת, כדי להחליף את קולטני האור מנוון ולשחזר את חזון. ואכן, זה הוכח לאחרונה, כי בתאי קולטי אור מבשר מושתלים כגון לעורר קריטריונים מורפולוגיים של קולטני אור בוגר wild-type, כגון properly פיתח מגזרים חיצוניים 3, מסופים הסינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגני וגוף תא עגול הממוקם בשכבה החיצונית הגרעינית 2-4, כמו גם את היכולת לשלב מבחינה תפקודית למעגלים עצבי מארח 5-7. אחד העקרונות המרכזיים של אסטרטגיה זו הוא השימוש ביום שלאחר הלידה 4 (4 PN, PN0 מוגדר כיום לידה) רשתיות עכברים צעירות, וכתוצאה מתערובת של סוגי תאים שונים להשתלה. על רקע יישום טיפולי עתידי, תערובת זו צריכה להיות מטוהרת לתאים מבשר קולטי אור. CD73 תואר כסמן הראשון בתא השטח הספציפי לקולטני אור צעיר ב8-10 הרשתית. הנה, אנחנו מדגימים שיטת טיהור תא מבשר קולטי אור המבוססים על סמן בתא שטח זה, ועם השימוש בתא הקשורים המגנטי מיון טכניקה (MACS). MACS אולי יש יתרונות בהשוואה לטכניקות תא הופעל ניאון מיון,בשל מהירות מיון פעמים והסתגלות קלה יותר לתנאי GMP. אנחנו יכולים להפגין העשרה ~ 90% ושיעור אינטגרציה עד פי 3 גבוה יותר כאשר השתלת האוכלוסייה המועשרת למרחב subretinal ברשתית מבוגר wild-type. לפיכך, העשרה מבוססת MACS מבשר קולטי אור תא והשתלת subretinal, טכניקות אמינות ומבטיחות לפיתוח אסטרטגיה טיפולית משובי לטיפול בניוון רשתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

שימוש אתי וטיפול של שמירה על בעלי חיים:

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם קפדן עם חוקי האיחוד האירופי וגרמנים (Tierschutzgesetz) ודבקו בהצהרת ארוו לשימוש בבעלים חיים ברפואת עיניים וחזון מחקר. כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של דרזדן TU ודרזדן Landesdirektion (מספר אישור: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. לפני שמתחיל תא דיסוציאציה ומיון תא

  1. שלושה 15 מיליליטר צינורות תגובת תווית עם: לשטוף (W), חלק חיובי (+) וחלק שלילי (-).

2. רשתית דיסוציאציה

  1. לערוף PN 4 גורים באמצעות מספריים.
  2. יש לשטוף את הראש של הגורים זמן קצר ב70% אתנול ואחרי כביסה ב-PBS.
  3. להעביר את הראש לHBSS הקר וenucleate העין (חזור על שלב זה עבור כל הראשים). לenucleate, לפתוח את העפעפיים ולקבע tהוא עין עם מלקחיים מעוקלים באזור עצב הראייה. לאחר מכן, מושך את העין בזהירות אל מחוץ למסלול.
  4. לאחר enucleating כל העיניים, לבודד את הרשתית: להציג את המספריים סגורים לעצב הראייה ולפתוח את הלהבים. צלצול הרשתית / chorid החוצה. הסר את העדשות וכלי דם באמצעות מלקחיים מעוקלים.
  5. העבר את הרשתיות המבודדות לתוך צינור תגובה 1.5 מיליליטר המכיל את פתרון פפאין (המסופק על ידי ערכת ניתוק פפאין).
  6. דגירה הרשתית בפתרון פפאין ל30-60 דקות באמבט מים או שייקר (400 סל"ד) ב 37 ° C.
    1. בעוד רשתיות דגירה בפתרון פפאין, פיפטה 1 מיליליטר של תמיסת ovomucoid לצינור תגובה 15 מיליליטר (תווית "1").
    2. הוסף 60 μl של DNase אני (10 מ"ג / מיליליטר) + 60 μl של פתרון ovomucoid (המסופק על ידי הערכה) + 520 μl של EBSS לתגובת צינור 15 מיליליטר ("2" תווית).
  7. לאחר הדגירה פפאין, להעביר את פתרון פפאין המכיל את הרשתית מעוכלת חלקית לrצינור eaction "2".
  8. בעזרת פיפטה מלוטשת אש, לבצע ניתוק מכאני (10x למעלה ולמטה).
  9. פיפטה את ההשעיה התא בודדת לצינור תגובה "1". נסה ליצור 2 שכבות בעדינות על ידי שכבות ההשעיה התא על גבי פתרון ovomucoid.
  10. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב XG 300 (כ 1,300 סל"ד).
  11. בטל supernatant ו resuspend התאים ב500 μl של חיץ MACS.

3. מיון תא באמצעות תאים הקשורים מגנטיים מיון (MACS)

  1. להוסיף X μl נוגדן אנטי CD73 חולדה ל500 μl על מנת להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
  2. דגירה 5 דקות על קרח.
  3. מלא 15 מיליליטר צינור תגובה ל10 מיליליטר עם חיץ MACS צנטריפוגות למשך 5 דקות במהירות של 300 x גרם.
  4. הסר את supernatant.
  5. Resuspend את הכדור ב480 MACS μl חיץ ולהוסיף 120 μl של microbeads IgG נגד עכברוש העז.
  6. דגירה 15 דקות על קרח; לעשות nלהתסיס ot, לנער או לערבב אותו.
  7. מלא 15 מיליליטר צינור תגובה ל5 מיליליטר עם חיץ MACS צנטריפוגות זה במשך 5 דקות ב300 x גרם.
  8. כצינור התגובה הוא כבר centrifuged:
    1. התאם טור LS לדוכן המגנטי.
    2. שים את מסנן preseparation על גבי טור LS.
    3. מימה מסנן preseparation וטור LS עם MACS 3 מיליליטר החיץ ולאסוף מקים חיץ לשטיפה (W) צינור.
  9. הסר את supernatant.
  10. Resuspend את הכדור ב500 חיץ MACS μl.
  11. טען את ההשעיה תא 500 μl למסנן, ולאחר מכן להוסיף 1 MACS מיליליטר חיץ כדי לסנן ולאסוף את החלק השלילי לחלק השלילי (-) צינור תגובה.
  12. בשלב הבא, להוסיף 3 x 3 מיליליטר של חיץ MACS לעמודה כדי לשטוף את התאים שאינם מחויבים לעמודה
  13. ברגע ש9 מיליליטר אלה הם דרך העמודה LS, להסיר את העמודה מהדוכן המגנטי ולהתקין אותה על גבי reac החיובי שבריר (+)צינור tion.
  14. מהירות טעינת 5 מיליליטר של חיץ MACS לטור LS ולשים את הבוכנה בטור LS ולחץ אותו עד שכל החיץ הוא דרך העמודה.
  15. צנטריפוגה צינור התגובה המכיל את החלק החיובי של 5 דקות ב300 x גרם.
  16. הסר את supernatant, resuspend ב 500 μl של חיץ MACS ולשמור על 4 ° C.
  17. לספור את הכמות הכוללת של תאים באמצעות מכשיר ספירת תאים משותף.
  18. הכן את ההשעיה תא מהחלק החיובי ממוין המכיל 2 x 10 5 תאים / μl במאגר MACS ולשמור על 4 מעלות צלזיוס

4. השתלה של תאי קולטי אור מבשר מסודרים-MAC לתוך רשתית העכבר

  1. לוודא שיש את כל הפתרונות הבאים מוכן: 1 מיליליטר סטרילי PBS או HBSS, 10 μl DNAse אני, 1-2 H deionized מיליליטר סטרילי 2 O, aliquots של השברים ההשעיה התא ב 4 ° C.
  2. להרדים את העכבר הבוגר (כלומר ישן 2-4 חודשים)עם זריקת intraperitoneal של hydrochloride medetomidine (0.01 mg/10 משקל גוף ז), קטמין (0.75 משקל גוף mg/10 ז). אז תעשה הזרקה תת עורית של עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) להקלה על כאב.
  3. להתרחב תלמידים עם ירידה של Phenylephrin 2.5% Tropicamid 0.5%.
  4. תקן את העכבר בבעל ראש עכבר ומניח תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  5. החל ירידה של ג'ל Visidic כדי למנוע התייבשות של העין.
  6. עושה חור קטן בגבול בין לובן העין וקרני (בהתאמה serrata ora) באמצעות 30 G סטרילי ½ במחט.
  7. חותכים שקופית לכסות משותפת לחתיכות (כ 5 מ"מ x 5 מ"מ) קטנות באמצעות עט יהלום, מקום אחד מהכלים בחלק העליון של הקרנית הללו, ומאפשר הדמיה ישירה של הרשתית.
  8. לשטוף את מזרק microliter presterilized מספר פעמים עם מים deionized.
  9. טען את מזרק microliter עם 1 μl של השעיה תא, מחט ישירה בעקיפין דרך הלחמיתולובן עין ומקום תחת שליטה חזותית במחצית האף של הרשתית.
  10. אגרוף בעדינות חור ברשתית עד שמגיע לחלל subretinal, להזריק את ההשעיה התא לתוך חלל subretinal.
  11. שים לב לניתוק בולוס של רשתית, אשר אמור להיות אחיד, המכסה כ ¼ משטח הרשתית ללא כל דימום.
  12. למשוך את המזרק בעדינות, חותמות חור ברשתית באופן אוטומטי.
  13. לשטוף את מזרק microliter מספר פעמים עם מים deionized.
  14. שחרר את עכבר מבעל את הראש.
  15. להעיר את העכבר על ידי הזרקת hydrochloride atipamozole להיפוך של אפקט hydrochloride medetomidine.
  16. העבר את העכבר לזמן השכמה בחדר החשוך חמים (כ 25 מעלות צלזיוס).
  17. 2 ימים הקרובים לאחר ההשתלה, עצירות (0.05 מ"ג / ק"ג משקל גוף) צריך להיות מנוהל על ידי הזרקה תת עורית בבוקר ואחר הצהריים להקלה על כאב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 supplied DNase I is not used in the method
Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 BD Pharmingen 550738 Stock concentration 0.5 mg/ml
Goat Anti-Rat IgG MicroBeads Miltenyi 130-048-501 Total volume of 2 ml
PBS Gibco 10010-015 Used to count the total number of cells
DNase I Sigma D5025-150KU
HBSS Gibco 14025050 Used for dissociation of the retinas
Trypan blue Sigma Fluka93595 Used to count the total number of cells
Vidisic Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor Pfizer 76579
Ketamine 10% Ratiopharm 7538843
Antisedan Pfizer 76590
Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% University Clinics Dresden Pharmacy
Preseparation Filters Miltenyi 130-041-407
LS Columns Miltenyi 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Fire polish glass Pasteur pipette Brand 74777 20 The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved.
MACS 15 ml tube rack Miltenyi 130-091-052
Cell count chamber Carl Roth T728.1
Sterile 15 ml tubes Greiner Bio-One 188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD can be used instead of Olympus SZX10
Olympus SZX10 Olympus SZX10 can be used instead of Leica M651 MSD
Olympus inverted stereo microscope CKX41 Olympus CKX41
Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance Thermo Scientific 51025411
1.5 ml Reaction tube Sarstedt 727706400
2 ml Reaction tube Sarstedt 72695
Eppendorf Centrifuge 5702 VWR (Eppendorf) 521-0733
Mouse head holder myNeurolab 471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in BD Pharmingen 304000
Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN Hamilton 065-7634-01 delivered without needles
Hamilton RN special needle 34 G Hamilton 065-207434 Blunt, 12 mm length
Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight Fine Science Tools 15003-08
Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie Fine Science Tools 11272-40
Diamond pen Tools-tech
15 mm x 15 mm Cover slips Sparks MIC3366

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
  2. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
  3. Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
  4. Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
  5. Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
  6. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. (2012).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
  8. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
  9. Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
  10. Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
  11. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
  12. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  14. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  15. Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats