Subretinale Transplantation von MACS Gereinigtes Photorezeptor-Vorläuferzellen in der erwachsenen Maus Retina

1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden
* These authors contributed equally
Published 2/22/2014
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Medicine

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Summary

Zelltransplantation stellt eine Strategie für die Behandlung von Retinadegeneration, gekennzeichnet durch Photorezeptorverlust. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Anreicherung von transplantierbaren Photorezeptoren und deren subretinale Transplantation in erwachsenen Mäusen.

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Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J. Vis. Exp. (84), e50932, doi:10.3791/50932 (2014).

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Abstract

Sehbehinderung und Blindheit durch den Verlust der lichtempfindlichen Zellen der Netzhaut, dh Photorezeptoren, stellt die Hauptursache für Behinderung in den Industrieländern. Ersatz degenerierter Photorezeptoren durch Zelltransplantation stellt eine mögliche Behandlungsoption in zukünftigen klinischen Anwendungen. In der Tat, die jüngsten präklinischen Studien gezeigt, dass unreife Photorezeptoren, von der Neugeborenen-Maus Netzhaut im postnatalen Tag 4 isoliert, haben das Potenzial, in der adulten Maus Netzhaut folgende subretinale Transplantation zu integrieren. Spenderzellen erzeugt eine reife Photorezeptor Morphologie innere und äußere Segmente, einem runden Zellkörper an der äußeren Körnerschicht entfernt und synaptischen Terminals in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen. Tatsächlich zeigten die jüngsten Berichte, dass die Geberphotorezeptoren funktionell in die neuronalen Schaltkreise von Host-Mäuse integrieren. Für eine zukünftige klinische Anwendung solcher Zell-Ersatz-Ansatz, gereinigt Suspensionender Zellen der Wahl haben, erzeugt und an der richtigen Stelle für die richtige Integration in das Auge eingesetzt werden. Zur Anreicherung des Photorezeptors Vorstufen sollten Sortier an spezifische Zelloberflächenantigenen basieren, um genetische Reporter Modifikation von Spenderzellen zu vermeiden. Hier zeigen wir Magnet-assoziierten Zellsortierung (MACS) - Anreicherung von transplantierbaren Stange Photorezeptor-Vorstufen aus der Neugeborenen-Netzhaut des Photorezeptor-spezifischen Reportermäuse auf der Basis der Zelloberflächenmarker CD73 isoliert. Inkubation mit anti-CD73-Antikörper, gefolgt von Mikroperlen konjugierten Sekundärantikörper erlaubt die Anreicherung der Stange Photorezeptor Vorstufen von MACS um ca. 90%. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie hat MACS den Vorteil, dass sie einfacher zu GMP-Standards angewandt werden und dass große Mengen von Zellen kann in relativ kurzen Zeiträumen sortiert werden können. Die Injektion von angereicherten Zellsuspensionen in den subretinalen Raum von erwachsenen Wildtyp-Mäusen führte zu einer 3-fach höhere Integrationsrate Vergleichbarkeited unsortierte Zellsuspensionen.

Introduction

Vision ist einer der wichtigsten Sinne des Menschen. Wertminderung von diesem Sinn und Blindheit sind eine der Hauptursachen für Behinderung in den Industrieländern. Der überwiegende Ursache für Sehbehinderung oder Blindheit ist Netzhautdegeneration, gekennzeichnet durch Photorezeptorzellverlust, da es bei der Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, Zapfen-Stäbchen-Dystrophie und andere Bedingungen zu beachten. Bis heute ist eine wirksame Therapie, um verlorene Sehvermögen wieder herzustellen nicht verfügbar. In 2006 und 2008 zwei verschiedene Labors berichtet, unabhängig voneinander, eine erfolgreiche Transplantation von Vorläuferzellen Stange Photorezeptor zu erwachsenen Wildtyp-Mäusen Netzhaut 1,2. Damit sich die Möglichkeit der Photorezeptor-Vorläuferzell-Transplantation auch in einer degenerierten Netzhaut, an degenerierten Photorezeptoren ersetzen und Wiederherstellung Vision. In der Tat hat es sich vor kurzem gezeigt, dass solche transplantierten Photorezeptorvorläuferzellen hervorzurufen morphologischen Kriterien von reifen Wildtyp-Photorezeptoren, wie properly entwickelt äußeren Segmente 3, Synapsen in der Nähe endogenen bipolaren Zellen und einer runden Zellkörper in der äußeren Kernschicht 2-4, sowie die Fähigkeit, funktionell in das Wirts neuronalen Schaltkreise 5-7 integrieren entfernt. Einer der wichtigsten Grundsätze dieser Strategie ist der Einsatz von postnatalen Tag 4 (PN 4, PN0 wird als Tag der Geburt definiert) jungen Mäusen Netzhaut, was zu einer Mischung verschiedener Zelltypen für die Transplantation. Auf dem Hintergrund eines zukünftigen therapeutischen Anwendung hat diese Mischung für Photorezeptor-Vorläuferzellen gereinigt werden. CD73 wurde als erste Zelloberflächenmarker spezifisch für junge Photorezeptoren in der Netzhaut 8-10 beschrieben. Hier zeigen wir, einen Photorezeptor Vorläuferzelle Reinigungsverfahren auf der Basis dieser Zelloberflächenmarker und mit der Verwendung des Magnet-assoziierten Zellsortierung (MACS)-Technik. MACS kann Vorteile gegenüber fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechniken haben,durch schnelle Sortierzeiten und die einfachere Anpassung an GMP-Bedingungen. Wir könnten eine ~ 90% Anreicherung und eine bis zu 3-fach höhere Integrationsrate beim Verpflanzen der angereicherten Bevölkerung in den subretinalen Raum bei erwachsenen Wildtyp-Netzhaut zu demonstrieren. Somit MACS-basierte Photorezeptor Vorläuferzellanreicherung und subretinale Transplantation, sind zuverlässige und vielversprechende Technik für die Entwicklung eines regenerativen therapeutischen Strategie zur Behandlung von Retina-Degeneration.

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Protocol

Ethische Nutzung und Pflege von Tieren Aussage:

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit der Europäischen Union und der deutschen Gesetze (Tierschutzgesetz) durchgeführt und mit der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research geklebt. Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der TU Dresden und der Landesdirektion Dresden (: 24D-9168.11-1/2008-33 Zulassungsnummer) genehmigt.

1. Vor dem Start Zelldissoziation und Zellsortierung

  1. Etiketten drei 15 ml Reaktionsgefäße mit: Wash (W), Positive Fraktion (+) und negativen Fraktion (-).

2. Retina Dissoziation

  1. Enthaupten die PN 4 Welpen mit einer Schere.
  2. Spülen Sie den Kopf der Welpen kurz in 70% Ethanol, gefolgt von Waschen in PBS.
  3. Bringen Sie den Kopf nach kaltem HBSS entkernen und das Auge (wiederholen Sie diesen Schritt für alle Köpfe). Um entkernen, die Augenlider öffnen und fixieren ter Auge mit einer gebogenen Pinzette an den Sehnerv Region. Ziehen Sie dann die Augen vorsichtig aus der Umlaufbahn.
  4. Nach enucleating alle Augen zu isolieren, die die Netzhaut: die Einführung einer geschlossenen Schere in den Sehnerv und öffnen Sie die Klingen. Peal der RPE / chorid aus. Entfernen Sie die Linsen und die Blutgefäße mit einer gebogenen Pinzette.
  5. Übertragen Sie die isolierten Netzhaut in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß mit der Papain-Lösung (nach der Papain-Dissoziation Kit enthalten).
  6. Die Netzhaut in der Papain-Lösung für 30-60 min in einem Wasserbad oder Schüttler (400 rpm) bei 37 ° C.
    1. Während in der Netzhaut inkubieren Papain-Lösung, Pipette 1 ml Ovomucoids Lösung in ein 15 ml Reaktionsrohr (Bezeichnung "1").
    2. Man gibt 60 &mgr; l DNase I (10 mg / ml) + 60 ul Ovomucoid-Lösung (von dem Kit bereitgestellt) + 520 &mgr; l EBSS in ein 15 ml Reaktionsrohr (Bezeichnung "2").
  7. Nach Inkubation Papain, übertragen Sie die Papain-Lösung, die die Netzhaut teilweise verdaute reaction Rohr "2".
  8. Mit einem feuerpolierte Pipette, führen mechanische Dissoziation (10x hoch und runter).
  9. Pipettieren Sie die Einzelzellsuspension auf Reaktionsrohr "1". Versuchen Sie, 2 Schichten, die durch sanft Schichtung der Zellsuspension auf der Ovomucoids Lösung zu generieren.
  10. Zentrifugieren für 5 min bei 300 × g (ca. 1.300 rpm).
  11. Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren in 500 ul MACS-Puffer.

3. Zellsortierung mit magnetischen assoziierten Zellsortierung (MACS)

  1. Add x ul Ratten-Anti-CD73-Antikörpers an die 500 ul, um eine Endkonzentration von 10 ug / ml zu erreichen.
  2. Inkubation 5 min auf Eis.
  3. Füllen die 15 ml Reaktionsröhrchen auf 10 ml mit MACS-Puffer und Zentrifuge für 5 Minuten bei einer Geschwindigkeit von 300 x g.
  4. Entfernen Sie den Überstand.
  5. Das Pellet in 480 ul MACS-Puffer und fügen Sie 120 ul Ziege-anti-Ratte-IgG-Mikrokügelchen.
  6. Inkubation 15 min auf Eis; tun not aufregen, Schütteln oder mischen Sie.
  7. Füllen die 15-ml-Reaktionsrohr mit 5 ml MACS Puffer und Zentrifuge für 5 min bei 300 x g.
  8. Als das Reaktionsrohr zentrifugiert worden:
    1. Stellen Sie eine LS Säule in den Magnetständer.
    2. Setzen Sie den Vorabscheidefilter auf der LS-Säule.
    3. Hydrat der Vorabscheidefilter und den LS Säule mit 3 ml MACS-Puffer und sammeln die MACS-Puffer in die Wasch (W) Röhre.
  9. Entfernen Sie den Überstand.
  10. Das Pellet in 500 ul MACS-Puffer.
  11. Laden der 500 ul Zellsuspension zu dem Filter, dann 1 ml MACS-Puffer zu dem Filter zu sammeln und das negative Fraktion in die negative Fraktion (-) Reaktionsrohr.
  12. Weiter, add 3 x 3 ml MACS-Puffer in die Säule zum Auswaschen der Zellen, die nicht an die Säule gebunden sind,
  13. Sobald diese 9 ml sind über die LS Säule, entfernen Sie die Säule aus dem magnetischen Stand und installieren Sie es auf der positiven Fraktion (+) Reaktionention Röhre.
  14. Schnell laden 5 ml MACS-Puffer in die LS-Säule und setzen Sie den Kolben in der LS-Spalte und drücken Sie ihn nach unten, bis der gesamte Puffer ist durch die Säule.
  15. Zentrifugieren Sie das Reaktionsrohr, das die positive Fraktion für 5 min bei 300 x g.
  16. Entfernen Sie den Überstand resuspendieren in 500 ul MACS-Puffer und halten bei 4 ° C
  17. Zählen der Gesamtmenge der Zellen mit einer gemeinsamen Zelle Zähleinrichtung.
  18. Bereiten Sie eine Zellsuspension von der positiven sortiert Fraktion mit 2 x 10 5 Zellen / ul in MACS-Puffer und halten bei 4 ° C

4. Transplantation von MAC-Photorezeptor sortiert Vorläuferzellen in die Retina-Maus

  1. Stellen Sie sicher, dass Sie alle der folgenden Lösungen parat haben: 1 ml sterilem PBS oder HBSS, 10 ul DNAse I, 1-2 ml sterilem deionisiertem H 2 O, Aliquots der Zellsuspension Fraktionen bei 4 ° C
  2. Anesthetize die erwachsenen Maus (dh 2-4 Monate alt)mit einer intraperitonealen Injektion von Medetomidin Hydrochlorid (0,01 mg/10 g Körpergewicht), Ketamin (0,75 mg/10 g Körpergewicht). Tun eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) zur Schmerzlinderung dann.
  3. Dilate Schüler mit einem Rückgang von 2,5% Phenylephrin-Tropicamid 0,5%.
  4. Fix Maus in der Maus Kopfhalter und legen Sie unter Stereomikroskop.
  5. Einen Tropfen Visidic Gel um das Trocknen des Auges zu verhindern.
  6. Machen Sie ein kleines Loch an der Grenze zwischen Lederhaut und der Hornhaut (bzw. Ora serrata) mit einer sterilen 30 G ½ in Nadel.
  7. Schneiden Sie einen gemeinsamen Deckglas in kleine (ca. 5 mm x 5 mm) Stücke mit einem Diamantstift, legen Sie eine dieser Stücke auf der Hornhaut, die eine direkte Visualisierung der Netzhaut.
  8. Spülen Sie die vorsterilisierten Mikroliterspritze mehrmals mit VE-Wasser.
  9. Laden Sie die Mikroliter-Spritze mit 1 ul Zellsuspension, Direkt Nadel tangential durch die Bindehautund Lederhaut und Ort unter Sichtkontrolle in der Nasen Hälfte der Netzhaut.
  10. Lochen Sie vorsichtig ein Loch in die Netzhaut bis zum Erreichen der subretinalen Raum, injizieren die Zellsuspension in den subretinalen Raum.
  11. Beachten Sie die bullösen Ablösung der Netzhaut, die einheitlich sein sollten, für rund ¼ des retinalen Raum ohne Blutung.
  12. Ziehen Sie die Spritze vorsichtig, die Netzhautloch Dichtungen automatisch.
  13. Spülen Sie die Mikroliter-Spritze mehrmals mit VE-Wasser.
  14. Lassen Maus von Kopfhalter.
  15. Beginnen Sie mit der Maus durch die Injektion von atipamozole Hydrochlorid für Umkehr der Medetomidinhydrochlorid Wirkung.
  16. Legen Sie die Maus für die Weckzeit in warmen, dunklen Kammer (ca. 25 ° C).
  17. Die nächsten 2 Tage nach der Transplantation, Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) durch subkutane Injektion am Morgen und am Nachmittag zur Schmerzlinderung verabreicht werden.

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Representative Results

Um die Fähigkeit von Stäbchen-Photorezeptoren in der Netzhaut der Maus integriert zu beurteilen, wurde eine Maus-Reporter Leitung verwendet, in der GFP wird durch das neuronale Netzhaut-Leucin-Zipper (NRL, Nrl-GFP)-Promotor 11 angetrieben. Nrl ist der früheste Marker der Stäbchen-Photorezeptoren beginnen ihren Ausdruck bei E12.5 im Erwachsenenalter, so dass eine spezifische Markierung der Geberstange Photorezeptorzellen.

PN 4 Nrl-GFP Jungtiere wurden enthauptet und die Augen wurden enukleiert. Netzhäute wurden dann isoliert und dissoziiert unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens. Die resultierende Zellsuspension wurde dann sortiert mit CD73-basierte Macs (Bilder 1 und 2). Nach MAC-Sortierung, analysierten wir die während dieses Verfahrens erreicht Bereicherung.

Wie in 3A gezeigt ist, die anfängliche Zellsuspension (Input) enthalten 30,4% GFP-positive Zellen, dh. Stäbchen-Photorezeptoren. Nach CD73-basierten MAC-Sortierung,eine Anreicherung von bis zu 86,9% in der CD73-positiven Fraktion (CD73 +) wurde mittels Durchflusszytometrie beobachtet. In der CD73-negativen Fraktion (CD73-) nur 9,9% der Zellen waren positiv für GFP (3A) erfasst. Die Anreicherung Nrl-GFP-positive Zellen nach CD73-Macs ist zusätzlich nach der Beschichtung in vitro (3B) visualisiert.

Nach MAC-Sortierung wurden Spenderzellen in der CD73-positiven Fraktion zentrifugiert und auf eine Endkonzentration von 200.000 Zellen / ul resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde für die Transplantation in den subretinalen Raum des Wildtyp-Wirtsnetzhaut (Fig. 4) verwendet. Drei bis vier Wochen nach der Transplantation wurden die Hostnetzhaut befestigt, getrennt und geschnitten. Mehrere Spenderzellen in der äußeren Körnerschicht der Gastgeber integriert und in der äußeren Körnerschicht und Formatio erworben auf die Morphologie von Photorezeptoren mit Lokalisierung des Zellkörpers n synaptischer Kügelchen und Innensegmente (Fig. 5). Detailbilder haben vor unserer Gruppe 3,8 zeigt ein Ergebnis vergleichbar mit FAC-sortierten Zellen transplantiert werden, um Netzhaut durch andere Gruppen 4,6,10 Gastgeber veröffentlicht. Konsequent in all dieser Studien ist, dass die transplantierten Zellen bleiben an der Injektionsstelle, von der bullösen freistehende Gastnetzhaut definiert und nicht weg zu migrieren. Einige Integration in das Wirtsnetzhaut (dh äußeren Körnerschicht) und in den subretinalen Raum 3 einige bleiben. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Verteilung der Spenderzellen an der Stelle der Integration hängt von der Art des verwendeten Mausmodell 5. Keine akute Host / Transplantatabstoßung Zeichen wurden bei Transplantationen zwischen C57BL/6J Mäusen nachgewiesen.

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Fig. 1 ist. Gesamtschema der subretinale Transplantation von MACS Photorezeptor-Vorläufern in erwachsenen Maus Netzhaut. Spenderzellen aus PN 4 Nrl-GFP Welpen isoliert werden gereinigt, gefolgt von CD73-basierten MAC-Sortierung und in den subretinalen Raum von Maus-Host Netzhaut transplantiert. Klicken Sie hier zur Ansicht größere Zahl .

Figur 2
2. Anreicherung von transplantierbaren Photorezeptoren von MACS. Die aus allen gesammelten PN4 Netzhaut erzeugten Zellsuspension wird mit primären Ratten-Anti-CD73-Antikörper, gefolgt von Waschen und Inkubation mit anti-Ratte-Antikörper, konjugiert mit Microbeads inkubiert. Nicht gebundene Antikörper werden weggespült. Die Zellsuspension wird throug weitergegebenha LS-Spalte, die mit einem magnetischen Ständer verbunden ist. Zellen, die durch Antikörper gebunden sind, bleiben an der Säule befestigt, während die restlichen Zellen eluiert und gesammelt (CD73-negative Fraktion). Schließlich wird die LS-Säule aus dem magnetischen Stand entfernt und die restlichen Zellen eluiert und gesammelt (CD73-positive Fraktion). Klicken Sie hier, um volle Film anzusehen .

Fig. 3
3. Analyse der Nrl-GFP positiven Zellanreicherung folgenden CD73-basierten MAC-Sortierung. (A) Vor dem Sortieren der Anfangspopulation von Spenderzellen enthielt 30,4% der Nrl-GFP-positiven Zellen. Folgende MAC-Sortierung, konnte eine Anreicherung von GFP-positiven Zellen in der CD73 +-Fraktion (86,9%) festgestellt werden, während die CD73-Fraktion enthielt nur geringe Mengen von GFP +-Zellen (9,9%). (B) Repräsentative Bild zeigt das Ergebnis der CD73-basierten MAC-Sortierung von PN4 Nrl-GFP-Zellen. 1 Million Zellen aus jeder Fraktion wurden auf mit Laminin beschichteten Deckgläschen ausplattiert. Zellen wurden 4 Stunden nach dem Ausstreichen mit 4% PFA für 10 Min. fixiert. Zellen wurden mit DAPI (4 ',6-Diamidino-2-phenylindol, 1:20.000) gefärbt. Im Vergleich mit dem Eingang-Fraktion oder der CD73-Fraktion wurde eine signifikante Anreicherung von GFP-positiven Zellen in der CD73 +-Fraktion beobachtet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 4
4. Subretinale Injektion. Schematische Darstellung des Transplantationsprozesses in der adulten Maus retinein. Die Nadel wird durch ein Loch in der Ora serrata durch Vermeidung Berühren der Linse durch die Glaskörperraum navigiert und auf der Netzhaut unter Sichtkontrolle platziert eingesetzt. Durch leichtes Drücken wird die Nadel durch die Netzhaut ausgestanzt und in den subretinalen Raum platziert. Schließlich wird die Zellsuspension vorsichtig unter Sichtkontrolle durch Auswertung des Ablöseprozesses injiziert.

Figur 5
5. Integration von transplantierten Photorezeptorzellen. Vertreter Bild, die Darstellung integriert CD73-basierten Macs sortiert PN4 ​​Nrl-GFP-Zellen nach Transplantation in der erwachsenen Maus Netzhaut. Transplantierte Photorezeptor-Vorstufen richtig in die äußere Körnerschicht (ONL) integrieren und erzeugen reifen Photorezeptormorphologie.

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Discussion

Subretinale Transplantation von Photorezeptor-Vorläuferzellen stellt ein zuverlässiges Instrument zur Integration dieser lichtempfindlichen Zellen der Netzhaut in Wirts in großer Zahl 1,2 zu erreichen. Dies könnte die Einrichtung von einer Zelltherapie für die Behandlung von degenerativen Retinaerkrankungen in Zukunft 6 zu ermöglichen. Spenderpopulation von Zellen, die derzeit von PN 4 Retina isoliert, ist ein Gemisch aus verschiedenen Zelltypen, von denen nur die Photorezeptor-Vorläuferzellen zu integrieren, nachdem subretinale Injektion. Durch die Verwendung von CD73-basierten MAC-Sortierung, kann der Anteil der Photorezeptoren in der Spenderzellsuspension auf ≈ 90%, die eine ca. 3-fach höhere Integrationsrate in Wildtyp-Hostnetzhaut ermöglicht im Vergleich zu den unsortierten Zellpopulation 8 erhöht werden. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie hat MACS den Vorteil einer schnellen Sortierverfahren und dass sie relativ einfach zu GMP-Standards angewendet werden. Die Reinigung von transplantierbaren Photorezeptoren ist von specific Interesse im Lichte der jüngsten Vorteile für die in-vitro-Erzeugung von Photorezeptoren aus pluripotenten Stammzellen 12-14. Kulturen differenzierter pluripotenten Stammzellen werden von verschiedenen Zelltypen machen die Verfügbarkeit von spezifischen Sortierverfahren eine wesentliche Voraussetzung für ihren künftigen Einsatz in der Zelltransplantationstherapien zusammen.

Nach der MACS-Reinigungsverfahren sind mehrere Punkte bemerkenswert, wodurch eine Workflow ohne größere Störungen. Je höher die Anzahl der Netzhaut, die sortiert werden, desto mehr Zeit wird für die Spaltung benötigt. Nach dem Verdau während des Sortierverfahrens mit der Aggregation von Zellen zu vermeiden. Dies erfolgt vorzugsweise vor der Zugabe des sekundären Antikörpers und während seiner Inkubation. In diesem Fall weist das Aggregat sofort mit einer Pipette entfernt werden. Während der Elution von MACS-Puffer während der Erfassung des MACS-negative Fraktion, ist es unbedingt notwendig, mehr als 3 ml auf die Säule nicht hinzuzufügen.Der Druck des Puffers auf die Säule zu hoch sein, wenn mehr als 3 ml Puffer zugegeben. Dadurch wird die Bindung des Antikörpers an die Zellen und senkt Sortiereffizienz stören. Beim Entfernen der Säule aus dem magnetischen Stand zu sammeln die MACS-positiven Fraktion, muss dieser Schritt schnell durchgeführt werden. Die 5 ml MACS-Puffer in die Säule sollte so schnell wie möglich zugegeben werden. Auch sollte die Tauch gelegt und gepresst werden schnell, bis der gesamte Puffer durch die Säule. Es ist nicht notwendig, um den aufgebrachten Druck zu sorgen. Der MACS-Puffer isotonisch und kann variiert werden. Es ist möglich, FACS-Puffer, Zellkulturmedium, PBS EBSS oder HBSS verwendet. Sterilität des Puffers kann durch Filtrieren durch einen 0,4 &mgr; m-Filtermembran erreicht werden.

Nach der Anreicherung durch MACS kann eine erfolgreiche Transplantation von Spenderzellen in den subretinalen Raum, indem sie die folgenden Punkte beachten erreicht werden. Da Photorezeptor-Zellen scheinen sehr empfindlich auf die Behandlung ex vivo zu sein,es ist nicht ratsam, sie auf 4 ° C länger zu halten als nötig. Gehen Sie für die Transplantation so schnell wie möglich. Beim Einsetzen der Injektionsnadel in den Augapfel, ist es wichtig zu vermeiden, berühren Sie die Linse wie die relativ scharfen Metall Nadel können die Linse was die Induktion von Objektiv-induzierte Uveitis beschädigen. Der letzte Schritt auf dem Weg in den subretinalen Raum, die das Eindringen der Netzhaut, ist entscheidend. Da nicht visuell beobachtet, ob der subretinalen Raum erreicht wird, ist es wichtig, ein Gefühl für den richtigen Schiebedruck und Gewebewiderstand zu entwickeln. Um zu testen, ob der Nadelkopf richtig platziert ist, könnte ein kleines Volumen angewendet werden und die Ablösung der Netzhaut an der Nadelkopf sollten sorgfältig beobachtet werden. Wenn eine runde, bullöse Ablösung ohne Blutung bilden, korrekt ist die Position und der Rest der Lösung kann vorsichtig angewendet werden. Während der Injektion sollte die Nadel in ihrer Position, um weitere Schäden zu vermeiden, das Gewebe bleiben. Die Netzhautloch creATED durch die Injektionsnadel wird von selbst abzudichten, wenn die Nadel langsam zurückgezogen wird. Das gesamte Verfahren sollte in der minimalen möglichen Zeit durchgeführt werden, um weitere Belastung und Beschädigung des Tieres zu vermeiden. Während der Transplantation, neigt der Zellsuspension zum Verklumpen und blockieren die Mikroliter-Spritze. Wenn dies geschieht, wird eine Verdünnung der Zellsuspension unter Verwendung von sterilem PBS oder HBSS vorgeschlagen. Eine weitere Möglichkeit, dieses Problem zu überwinden, ist, 1 &mgr; l DNAse I zu der Zellsuspension hinzugefügt, um DNA Klumpen aus toten Zellen, die mit lebenden Zellen miteinander zu verkleben neigen aufzulösen.

Dieses Protokoll ist auf die magnetische Sortierung von Zellen. Daher könnten die Zellen nur eine Markierung pro Sortierrunde sortiert werden. Im Vergleich zu Durchflusszytometrie, wo Zellen könnte unter Verwendung verschiedener Marker (einschließlich physiologischen Eigenschaften sowie unterschiedliche Zelloberflächenmarker) gleichzeitig sortiert werden, ist dies ein großer Nachteil dieser Technik. Immer, wenn die Sortierung für verschiedene Marker inein kurzes Zeitfenster benötigt, Durchflusszytometrie kann die bessere Lösung. Auch die Sortierung für Fluoreszenzeigenschaften von Zellen, wie transgen exprimierten GFP oder andere Lebenszellmarker ist mit dieser Technik nicht möglich. Es wird derzeit die Verwendung von Zelloberflächenantikörpern, die mit magnetischen Kügelchen konjugiert werden können, beschränkt. Trotzdem könnte diese Technik auf der Grundlage der technischen Ausrüstung skaliert werden.

Seit Miltenyi Biotec ist derzeit der einzige Anbieter von magnetischen Zellsortierung Tools, gibt es keine Alternative zur Verfügung zu halten. Für Zell Dissoziation könnten andere Enzyme als Papain (dh Trypsin) verwendet werden. Zu beachten ist, erreicht unser Labor die besten Ergebnisse mit Papain, da scheint die sanfte Dissoziation Enzym in unseren Händen sein. Das Zeitfenster von Papain-Verdau (30-60 min) variabel ist. In diesem Zeitfenster eine optimale Verdauung wurde in unserem Labor erreicht. Kürzere oder längere Inkubationszeit kann je nach Probengröße notwendig sein, ein Probenqualitätnd Enzym verwendet. Einzelprüfung vorgeschlagen.

Da die Einzelschritt-MACS nicht Reinheitsgrad so hoch wie Durchflusszytometrie zu erreichen, könnte eine weitere mögliche Anwendung dieser Technik negativ Sortierung von unerwünschten und potentiell schädlichen Zellen sein. Es kann die positive Zellfraktion für eine bestimmte Zelloberflächenmarker, aber nicht von Interesse aussortiert werden, so dass die Fraktion von Interesse in der Strömung getrennt durch. Dies kann im voraus oder nach einer positiven Sortierschritt durchgeführt werden und ermöglicht die weitere Unterscheidung der Zellen unter Verwendung von verschiedenen Zelloberflächenmarker als auch die Entfernung unerwünschter Zellen, wie Feeder-Schicht von Zellen oder undifferenzierten Zellen aus pluripotenten Stammzellkulturen mit ihren potentiellen Risiko tumorigenen . Daher könnte MACS geeignet zur Reinigung von Photorezeptoren aus ES-oder IPS-Zellkulturen in mögliche zukünftige therapeutische Anwendungen, da es eine leichte, schnelle und einfache Behandlung zur Reinigung von großen Mengen an kultivierten Zellen darstellt. MACSleicht an GMP-Bedingungen, da die Einzelheiten der Sortierschritte angewendet werden, sind also Mechanik, Flüssigkeiten und Verfahren im Vergleich zu Durchflusszytometrie reduziert. Es ist bemerkenswert, dass MACS bereits routinemäßig in klinischen Studien für die Anreicherung von Zellen aus Blut oder Knochenmark verwendet. Interessanterweise kann MACS auch auf Zellen angewendet werden, wenn keine geeignete Zelloberflächenmarker vorhanden ist, durch die Einführung einer gentechnisch Oberflächenmarker von Zellen für die anschließende magnetische Zellsortierung Schritte 15 machen "zuständig".

Zusammenfassend stellt MACS ein zuverlässiges und schnelles Werkzeug zur Bereicherung Photorezeptor-Vorläuferzellen mit Zelloberflächenmarker für Transplantationsstudien. Darüber hinaus ist es eine leicht einsetzbare Methode für zukünftige klinische Anwendungen, die GMP-Bedingungen erfordern.

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Disclosures

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

Wir möchten Anand Swaroop für die Bereitstellung Nrl-GFP Mäusen, Jochen Haas für technischen Support und Sindy Böhme und Emely Lessmann für die Tierhaltung zu danken.

- Zentrum für Regenerative Therapien Dresden, CRTD Seed Grant Program, dem SFB 655 und der ProRetina eV Gründung der DIGS-BB Graduate Program Dresden, und der Fundação para a FZT 111: Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 supplied DNase I is not used in the method
Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 BD Pharmingen 550738 Stock concentration 0.5 mg/ml
Goat Anti-Rat IgG MicroBeads Miltenyi 130-048-501 Total volume of 2 ml
PBS Gibco 10010-015 Used to count the total number of cells
DNase I Sigma D5025-150KU
HBSS Gibco 14025050 Used for dissociation of the retinas
Trypan blue Sigma Fluka93595 Used to count the total number of cells
Vidisic Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor Pfizer 76579
Ketamine 10% Ratiopharm 7538843
Antisedan Pfizer 76590
Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% University Clinics Dresden Pharmacy
Preseparation Filters Miltenyi 130-041-407
LS Columns Miltenyi 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Fire polish glass Pasteur pipette Brand 74777 20 The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved.
MACS 15 ml tube rack Miltenyi 130-091-052
Cell count chamber Carl Roth T728.1
Sterile 15 ml tubes Greiner Bio-One 188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD can be used instead of Olympus SZX10
Olympus SZX10 Olympus SZX10 can be used instead of Leica M651 MSD
Olympus inverted stereo microscope CKX41 Olympus CKX41
Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance Thermo Scientific 51025411
1.5 ml Reaction tube Sarstedt 727706400
2 ml Reaction tube Sarstedt 72695
Eppendorf Centrifuge 5702 VWR (Eppendorf) 521-0733
Mouse head holder myNeurolab 471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in BD Pharmingen 304000
Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN Hamilton 065-7634-01 delivered without needles
Hamilton RN special needle 34 G Hamilton 065-207434 Blunt, 12 mm length
Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight Fine Science Tools 15003-08
Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie Fine Science Tools 11272-40
Diamond pen Tools-tech
15 mm x 15 mm Cover slips Sparks MIC3366

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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