Transplantation de cellules sous-rétinien MACS purifiée photorécepteur précurseurs dans la rétine de souris adulte

1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden
* These authors contributed equally
Published 2/22/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

La transplantation de cellules représente une stratégie pour le traitement de la dégénérescence de la rétine caractérisée par une perte des photorécepteurs. Ici, nous décrivons une méthode pour l'enrichissement de photorécepteurs transplantables et leur greffage sous-rétinien chez des souris adultes.

Cite this Article

Copy Citation

Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J. Vis. Exp. (84), e50932, doi:10.3791/50932 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Troubles de la vision et de la cécité due à la perte des cellules de détection de lumière de la rétine, soit photorécepteurs, représente la principale raison de l'invalidité dans les pays industrialisés. Le remplacement des photorécepteurs dégénérés par la transplantation de cellules représente une option thérapeutique possible dans des applications cliniques futurs. En effet, des études précliniques récentes démontré que les photorécepteurs immatures, isolés à partir de la rétine de la souris néonatale à jour postnatal 4, ont la possibilité d'intégrer dans la rétine de souris adulte après la transplantation sous-rétinienne. Les cellules donneuses généré une morphologie de photorécepteur matures y compris les segments intérieur et extérieur, un corps cellulaire ronde située à la couche nucléaire externe, et les terminaisons synaptiques à proximité de cellules bipolaires endogènes. En effet, de récents rapports ont montré que les photorécepteurs donateurs intégrer fonctionnellement dans les circuits de neurones de souris d'accueil. Pour un avenir application clinique de cette approche de remplacement cellulaire, suspensions purifiéesdes cellules de choix doit être généré et placé à la position correcte pour une bonne intégration dans l'œil. Pour l'enrichissement des précurseurs de photorécepteur, le tri doit être basé sur des antigènes spécifiques de la surface cellulaire afin d'éviter une modification génétique rapporteur de cellules du donneur. Ici, nous montrons cellule associée tri magnétique (MACS) - enrichissement de transplantables tige photoréceptrices précurseurs isolées à partir de la rétine de souris néonatale reporteurs spécifiques à photorécepteur sur la base du marqueur CD73 à la surface cellulaire. L'incubation avec des anticorps anti-CD73, suivi par des micro-perles anticorps secondaires conjugués autorisés l'enrichissement de tige précurseurs photoréceptrices par MACS à environ 90%. Par rapport à la cytométrie en flux, MACS a l'avantage qu'il peut être facilement appliquée à des normes de BPF et que de grandes quantités de cellules peuvent être triés dans des périodes relativement courtes de temps. Injection de suspensions cellulaires enrichies dans l'espace sous-rétinien de souris de type sauvage adultes a entraîné une 3 fois plus élevée comparable au taux d'intégrationed à des suspensions de cellules non triées.

Introduction

La vision est l'un des sens premiers de l'homme. Dépréciation de ce sens et la cécité sont l'une des principales raisons de l'invalidité dans les pays industrialisés. La principale cause de perte de vision ou la cécité est une dégénérescence de la rétine, caractérisé en ce photorécepteur perte de cellules, comme cela peut être observé dans la dégénérescence maculaire, une rétinite pigmentaire, la dystrophie cône-tige, et d'autres conditions. À ce jour, une thérapie efficace pour restaurer la vision perdue n'est pas disponible. En 2006 et 2008, deux laboratoires différents rapportés, indépendamment les uns des autres, une transplantation réussie de cellules précurseurs de photorécepteurs de tige dans des souris de type sauvage adultes rétines 1,2. Ainsi, résultant de la possibilité de transplantation de cellules précurseurs des photorécepteurs dans la rétine également dégénéré, de remplacer les photorécepteurs dégénérés et restaurer la vision. En effet, il a été démontré récemment que ces cellules précurseurs de photorécepteur transplantées provoquent des critères morphologiques des photorécepteurs de type sauvage matures, tels que properly développé trois segments extérieurs, les terminaux synaptiques à proximité de cellules bipolaires endogènes et un corps de cellule ronde située dans la couche extérieure 2-4 nucléaire, ainsi que la capacité d'intégrer fonctionnellement à l'ensemble de circuits de neurones de l'hôte 7.5. L'un des grands principes de cette stratégie est l'utilisation de post-natale jour 4 (PN 4, pN0 est défini comme jour de naissance) jeunes rétines de souris, résultant dans un mélange de différents types de cellules pour la transplantation. Sur le fond d'une application thérapeutique future, ce mélange doit être purifié pour les cellules précurseurs des photorécepteurs. CD73 a été décrit comme étant le premier marqueur spécifique de la surface cellulaire pour les jeunes photorécepteurs dans la rétine de 8 à 10. Ici, nous démontrons une méthode de purification de cellules précurseurs de photorécepteur sur la base de ce marqueur de surface cellulaire et à l'utilisation de la cellule associée au tri magnétique (MACS) technique. MACS pourraient présenter des avantages par rapport aux techniques de tri cellulaire activé par fluorescence,en raison de tri rapide fois et le réglage plus facile à des conditions GMP. Nous pourrions démontrer un enrichissement ~ 90% et un taux d'intégration jusqu'à 3 fois plus élevée lors de la transplantation de la population enrichie de l'espace sous-rétinien dans les rétines adultes de type sauvage. Ainsi, l'enrichissement des cellules de photorécepteur précurseur à base de MACS et la transplantation sous-rétinienne, sont des techniques fiables et les plus prometteurs pour le développement d'une stratégie thérapeutique de régénération pour le traitement de la dégénérescence rétinienne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Utilisation et le soin éthiques de la déclaration des animaux:

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les lois de l'Union européenne et allemande (Tierschutzgesetz) et adhéré à la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research. Toutes les expériences animales ont été approuvés par le comité d'éthique animale de l'université technique de Dresde et la Landesdirektion Dresde (numéro d'agrément: 24D-9168.11-1/2008-33).

Une. Avant de partir de cellules de dissociation et de tri cellulaire

  1. Étiquette trois tubes de 15 ml de réaction avec: lavage (W), fraction positive (+) et la fraction négative (-).

2. Retina dissociation

  1. Décapiter les PN 4 chiots en utilisant une paire de ciseaux.
  2. Rincez la tête des chiots peu dans l'éthanol à 70% suivie d'un lavage en PBS.
  3. Transférer le siège de HBSS froid et énucléer l'œil (répétez cette étape pour toutes les têtes). Pour énucléer, ouvrir les paupières et fixer til les yeux avec des pinces courbes à la région du nerf optique. Ensuite, tirez l'œil soigneusement de l'orbite.
  4. Après énucléation tous les yeux, isoler la rétine: introduire un ciseau fermée dans le nerf optique et ouvrir les lames. Peal l'EPR / chorid sur. Retirer les lentilles et les vaisseaux sanguins à l'aide de pinces courbes.
  5. Transférer les rétines isolées dans un tube de réaction de 1,5 ml contenant la solution de papaïne (fourni par le kit de dissociation de la papaïne).
  6. Incuber les rétines dans la solution de papaïne pendant 30 à 60 min dans un bain d'eau ou agitateur (400 rpm) à 37 ° C.
    1. Alors que les rétines incuber dans la solution de papaïne, la pipette 1 ml de solution ovomucoïde à un tube de 15 ml de la réaction (de l'étiquette "1").
    2. Ajouter 60 ul de DNase I (10 mg / ml) + 60 ul de solution ovomucoïde (fournis par le kit) + 520 ul de EBSS à un tube de 15 ml de réaction (appellation "2").
  7. Après la papaïne incubation, transférer la solution de papaïne contenant les rétines partiellement digérés à rtube de eaction "2".
  8. En utilisant une pipette de feu polie, effectuer dissociation mécanique (10x haut et en bas).
  9. Introduire à la pipette la suspension de cellules individuelles de tube de réaction "1". Essayez de générer 2 couches par couches doucement la suspension de cellules au-dessus de la solution ovomucoide.
  10. Centrifuger pendant 5 minutes à 300 g (environ 1300 tours par minute).
  11. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 500 ul de tampon MACS.

3. Tri cellulaire utilisant des cellules associées tri magnétique (MACS)

  1. Ajouter X ul rat anticorps anti-CD73 pour les 500 ul de façon à obtenir une concentration finale de 10 pg / ml.
  2. Incuber 5 min sur la glace.
  3. Remplissez les 15 ml tube de réaction à 10 ml avec du tampon MACS et centrifuger pendant 5 min à une vitesse de 300 x g.
  4. Retirer le surnageant.
  5. Reprendre le culot dans 480 ul de tampon MACS et ajouter 120 ul de chèvre anti-rat microbilles de IgG.
  6. Incuber 15 min sur la glace; faire nagiter ot, secouer ou mélanger.
  7. Remplissez les 15 ml tube de réaction à 5 ml avec du tampon MACS et centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
  8. Comme le tube de réaction est été centrifugé:
    1. Régler une colonne LS dans le support magnétique.
    2. Placez le filtre de pré-séparation au-dessus de la colonne de la LS.
    3. Hydrater le filtre de pré-séparation et la colonne LS avec un tampon de 3 ml MACS et recueillir les MACS tampon dans le lavage (W) tube.
  9. Retirer le surnageant.
  10. Reprendre le culot dans 500 tampon MACS ul.
  11. Chargez la suspension cellulaire 500 pi au filtre, puis ajouter 1 ml de tampon MACS au filtre et recueillir la fraction négative dans la fraction négative (-) de tube de réaction.
  12. Ajouter ensuite 3 x 3 ml de tampon MACS à la colonne pour laver les cellules qui ne sont pas liés à la colonne
  13. Une fois ces 9 ml sont par la Colonne de la LS, enlever la colonne du support magnétique et l'installer sur le dessus de la fraction (+) réaction positiftube tion.
  14. Charger rapidement 5 ml de tampon MACS dans la colonne de LS et de mettre le piston dans la colonne de LS et appuyer dessus jusqu'à ce toute la mémoire tampon est dans la colonne.
  15. Centrifuger le tube de réaction contenant la fraction positive pendant 5 min à 300 x g.
  16. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 500 ul de tampon MACS et garder à 4 ° C.
  17. Compter le nombre total de cellules à l'aide d'un dispositif de comptage de cellule commune.
  18. Préparer une suspension de cellules de la fraction triés positive contenant 2 x 10 5 cellules / ul dans du tampon MACS et garder à 4 ° C

4. La transplantation de cellules MAC triés photorécepteur précurseurs dans la rétine de souris

  1. Assurez-vous d'avoir toutes les solutions suivantes prêts: 1 ml de PBS stérile ou HBSS, 10 pl DNAse I, 1-2 ml stérile déminéralisée H 2 O, des aliquotes des fractions de cellules en suspension à 4 ° C.
  2. Anesthésier la souris adulte (c'est à dire les 2-4 mois)avec une injection intrapéritonéale de chlorhydrate de médétomidine (0,01 mg/10 g de poids corporel), la kétamine (0,75 mg/10 g de poids corporel). Puis faire une injection sous-cutanée de la buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) pour soulager la douleur.
  3. Dilater les élèves avec une baisse de 2,5% Phenylephrin-Tropicamid 0,5%.
  4. Fixer la souris dans le support de la tête de la souris et placer sous le microscope stéréo.
  5. Appliquez une goutte de gel Visidic pour éviter le dessèchement de l'oeil.
  6. Faire un petit trou à la frontière entre la sclérotique et de la cornée (respectivement ora serrata) en utilisant un stérile 30 G ½ en aiguille.
  7. Découper une lamelle de couverture commune en petits morceaux (environ 5 mm x 5 mm) en utilisant un stylet en diamant, placer l'un de ces morceaux sur le dessus de la cornée, ce qui permet la visualisation directe de la rétine.
  8. Rincer la seringue microlitre préalablement stérilisé plusieurs fois avec de l'eau désionisée.
  9. Charger la seringue microlitre avec 1 pl de suspension cellulaire, aiguille directe tangentiellement à travers la conjonctiveet la sclère et placer sous contrôle de la vue dans la moitié nasale de la rétine.
  10. Percez délicatement un trou dans la rétine jusqu'à l'espace sous-rétinien, injecter la suspension de cellules dans l'espace sous-rétinien.
  11. Observez le détachement de la rétine bulleux, qui devrait être uniforme, couvrant environ ¼ de l'espace de la rétine sans saignement.
  12. Retirer doucement la seringue, les joints d'étanchéité des trous rétiniens automatiquement.
  13. Rincer la seringue microlitre à plusieurs reprises avec de l'eau désionisée.
  14. Relâchez la souris de support de tête.
  15. Réveillez-vous la souris par injection de chlorhydrate atipamozole pour l'inversion de l'effet de chlorhydrate de médétomidine.
  16. Placez la souris pour l'heure de réveil dans la chambre sombre et chaud (environ 25 ° C).
  17. Les 2 prochains jours après la transplantation, la buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) doit être administré par injection sous-cutanée dans la matinée et dans l'après-midi pour le soulagement de la douleur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Afin d'évaluer la capacité des photorécepteurs à bâtonnets à intégrer dans la rétine de la souris, une ligne de journaliste de la souris a été utilisé, dans lequel la GFP est entraîné par la rétine neurale leucine zipper (LNR, Nrl-GFP) promoteur 11. Nrl est le premier marqueur de photorécepteurs à bâtonnets à partir de son expression à E12.5 à l'âge adulte, ce qui permet un marquage spécifique des cellules photoréceptrices de la tige de donateurs.

NB 4 chiots Nrl-GFP ont été décapités et les yeux ont été énucléés. Les rétines ont ensuite été isolées et dissociées en utilisant le procédé décrit ci-dessus. La suspension cellulaire obtenue est ensuite trié en utilisant MACS base CD73-(figures 1 et 2). Après tri MAC, nous avons analysé l'enrichissement réalisé au cours de cette procédure.

Comme le montre la figure 3A, la suspension initiale de cellules (d'entrée) contenait 30,4% de cellules positives pour la GFP, c'est à dire. photorécepteurs à bâtonnets. À la suite de MAC-tri en fonction de CD73-,un enrichissement allant jusqu'à 86,9% dans la fraction CD73-positif (CD73 +) a été observé par cytométrie de flux. Dans la fraction CD73-négatives (CD73-) seulement 9,9% de toutes les cellules ont été détectées positivement à la GFP (Figure 3A). L'enrichissement de cellules positives Nrl-GFP suivantes MACS base CD73-est en outre visualisé après placage in vitro (figure 3B).

Après tri-MAC, les cellules du donneur dans la fraction CD73-positives ont été centrifugées et remises en suspension à une concentration finale de 200 000 cellules / ul. Cette suspension cellulaire a été en outre utilisé pour la transplantation dans l'espace sous-rétinien de la rétine de l'hôte de type sauvage (figure 4). Trois à quatre semaines après la transplantation, les rétines d'accueil ont été fixés, isolé et sectionnés. Plusieurs cellules donneuses intégrés dans la couche nucléaire externe des hôtes et ont acquis la morphologie des photorécepteurs matures avec localisation du corps de cellule dans la couche nucléaire externe et formatio n de sphérules synaptiques et des segments intérieurs (Figure 5). Photos détaillées ont été publiées avant par notre groupe 3,8 montrant un résultat comparable avec des cellules de la CAA-triés transplantés d'accueillir rétines par d'autres groupes 4,6,10. Conformément à toutes ces études, c'est que les cellules transplantées restent au site d'injection, défini par la rétine hôte détaché bulleuse, et ne migrent pas. Certains s'intégrer dans la rétine de l'hôte (par exemple de la couche nucléaire externe), et certains restent dans l'espace sous-rétinien 3. En outre, il a été montré que la distribution des cellules du donneur au niveau du site d'intégration dépend du type de modèle de souris utilisé 5. Aucun signe de rejet hôte / greffon aiguë ont été détectés dans les transplantations entre les souris C57BL/6J.

1.jpg "/>
Figure 1. Régime général de la transplantation sous-rétinienne de MACS purifiés précurseurs de photorécepteurs dans des cellules de PN 4 chiots Nrl-GFP sont isolés souris adulte rétine. Donateurs, suivis par MAC-tri et transplanté dans l'espace sous-rétinien de rétines d'accueil de la souris sur la base CD73. Cliquez ici pour voir agrandir la figure .

Figure 2
Figure 2. Enrichissement des photorécepteurs transplantables par MACS. La suspension cellulaire produite à partir de toutes les rétines PN4 recueilli est mis en incubation avec des anticorps anti-CD73 de rat primaire suivie d'un lavage et une incubation avec des anticorps anti-rat conjugués à des microbilles. Les anticorps non liés sont lavés. La suspension de cellules est passé Througha LS-colonne qui est connecté avec un support magnétique. Les cellules qui sont liées par des anticorps restent attachés à la colonne tandis que les cellules restantes sont élués et recueillis (fraction CD73-négatives). Enfin, le LS-colonne est retirée du support magnétique et les cellules restantes sont élues et recueilli (fraction CD73-positif). Cliquez ici pour voir le film complet .

Figure 3
Figure 3. Analyse des Nrl-GFP enrichissement de cellules positives suivante basée CD73-MAC-tri. (A) Avant le tri, la population initiale de cellules du donneur contenait 30,4% de cellules positives Nrl-GFP. À la suite de MAC-tri, un enrichissement des cellules positives pour la GFP n'a pu être détectée dans la fraction CD73 + (86,9%), tandis que le CD73-fraction ne contenait que de faibles quantités de cellules GFP + (9,9%). (B) Représentant l'image montrant le résultat de base CD73-MAC-tri des cellules PN4 Nrl-GFP. 1 million de cellules de chaque fraction ont été étalées sur des lamelles revêtues de laminine. Les cellules ont été fixées quatre heures après le placage avec 4% de PFA pendant 10 min. Les cellules ont été colorées avec du DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole, 1:20,000). Un enrichissement significatif de cellules GFP-positives dans la fraction CD73 + a été observée par rapport à la fraction d'entrée ou le CD73-fraction. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4
Figure 4. Injection sous-rétinienne. Schéma du processus de transplantation dans le Retin de souris adulteune. L'aiguille est insérée à travers un trou dans l'ora serrata, navigue à travers l'espace vitré en évitant de toucher la lentille et placé à la rétine sous contrôle visuel. En poussant douce, l'aiguille est perforée par la rétine et placé dans l'espace sous-rétinien. Finalement, la suspension cellulaire est injecté avec soin sous contrôle visuel par l'évaluation du processus de détachement.

Figure 5
Figure 5. L'intégration des cellules photoréceptrices transplantées. Représentant image représentant MACS base de CD73 intégrés triés cellules PN4 Nrl-GFP après la transplantation dans la rétine de souris adulte. Précurseurs de photorécepteurs greffés intégrer correctement dans la couche nucléaire externe (ONL) et génèrent maturité morphologie des photorécepteurs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Transplantation sous-rétinienne des cellules précurseurs de photorécepteurs représente un outil fiable pour réaliser l'intégration de ces cellules sensibles à la lumière dans la rétine d'accueil en nombre significatif de 1,2. Ceci peut permettre la mise en place d'une thérapie cellulaire pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine, à l'avenir 6. La population de donneurs de cellules isolées à partir de ce moment, PN 4 rétines, est un mélange de différents types de cellules, à partir de laquelle seules les cellules précurseurs de photorécepteur intègrent après injection sous-rétinienne. En utilisant la base CD73-MAC-tri, la proportion des photorécepteurs au sein de la suspension de cellules de donneur peut être augmentée à ≈ 90% qui permet un taux d'intégration d'environ 3 fois plus élevée dans les rétines de l'hôte de type sauvage par rapport à la population de cellules non triées 8. Par rapport à la cytométrie en flux, MACS a l'avantage d'une procédure de tri rapide et qu'elle peut être appliquée relativement facile de normes GMP. La purification des photorécepteurs transplantables est de sintérêt pécifique à la lumière des récents avantages pour la production in vitro de photorécepteurs à partir de cellules souches pluripotentes 12-14. Les cultures de cellules souches pluripotentes différenciées sont composées de types de cellules différentes rendant l'existence de procédures de tri spécifiques un prérequis essentiel pour leur utilisation future dans les thérapies de transplantation cellulaire.

Selon la procédure MACS-purification, plusieurs points sont à noter, assurant un flux de production sans perturbations majeures. Plus le nombre de rétines à trier, plus de temps est nécessaire pour la digestion. Après la digestion, lors de la procédure de tri, l'agrégation de cellules doit être évitée. Cela se produit de préférence avant l'addition de l'anticorps secondaire, et au cours de son incubation. Dans ce cas, l'ensemble doit être enlevé immédiatement avec une pipette. Au cours de l'élution du tampon MACS tout en recueillant la fraction MACS-négatifs, il est absolument nécessaire de ne pas ajouter plus de 3 ml à la colonne.La pression du tampon de la colonne sera trop élevée si plus de 3 ml de tampon est ajouté. Cela perturber la liaison de l'anticorps aux cellules et diminue l'efficacité du tri. Lors du retrait de la colonne du support magnétique pour commencer à recueillir la fraction MACS-positifs, cette étape doit être fait rapidement. Les 5 ml de tampon MACS doivent être ajoutés à la colonne le plus rapidement possible. En outre, la chute doit être mis et appuyez rapidement jusqu'à ce que toute la mémoire tampon est dans la colonne. Il n'est pas nécessaire de s'inquiéter de la pression appliquée. Le tampon MACS est isotonique et peut être modifiée. Il est possible d'utiliser un tampon FACS, le milieu de culture cellulaire, du PBS, EBSS, ou HBSS. La stérilité de la mémoire tampon peut être réalisé par filtration à travers une membrane filtrante de 0,4 um.

Après enrichissement par MACS, un succès de la transplantation de cellules du donneur à l'espace sous-rétinien peut être obtenu en gardant les points suivants à l'esprit. Etant donné que les cellules photoréceptrices semblent être très sensibles au traitement ex vivo,il n'est pas conseillé de les garder sur 4 ° C de plus que nécessaire. Procéder à la transplantation aussi vite que possible. Lors de l'insertion de l'aiguille d'injection dans le globe oculaire, il est important de ne pas toucher l'objectif que l'aiguille de métal relativement forte pourrait endommager la lentille résultante dans l'induction de l'uvéite induite lentille. La dernière étape sur le chemin vers l'espace sous-rétinien, la pénétration de la rétine, est cruciale. Comme il n'est pas observé visuellement si l'espace sous-rétinien est atteint, il est important de développer un sentiment de la pression poussant de droite et la résistance des tissus. Pour tester, si la tête d'aiguille est correctement placé, un petit volume pourrait être appliquée et le décollement de la rétine à la tête de l'aiguille doit être soigneusement observée. Si, un détachement bulleuse ronde sans saignement se forme, la position est correcte et le reste de la solution peut être appliquée avec soin. Lors de l'injection, l'aiguille doit rester dans sa position pour éviter davantage de dommages aux tissus. Le trou création de la rétineés par l'aiguille d'injection se sceller par elle-même si l'aiguille est rétractée lentement. L'ensemble de la procédure doit être fait dans le minimum de temps possible pour éviter un stress supplémentaire et les dommages à l'animal. Au cours de la transplantation, de la suspension cellulaire a tendance à s'agglutiner et de bloquer la seringue microlitre. Dans ce cas, une dilution de la suspension de cellules en utilisant du PBS stérile ou HBSS est suggéré. Une autre possibilité pour résoudre ce problème est d'ajouter 1 pi de DNAse I de la suspension cellulaire, à dissoudre amas d'ADN provenant de cellules mortes, qui ont tendance à coller ensemble des cellules vivantes.

Ce protocole est limité au tri magnétique des cellules. Par conséquent, les cellules peuvent être triés pour un seul marqueur par tri ronde. En comparaison avec la cytométrie de flux, où les cellules peuvent être triées en utilisant des marqueurs différents (y compris les propriétés physiologiques, ainsi que différents marqueurs de surface cellulaire) dans le même temps, il s'agit d'un inconvénient majeur de cette technique. Chaque fois que le tri des différents marqueurs dansune courte fenêtre de temps est nécessaire, la cytométrie en flux peut être la meilleure solution. En outre, pour le tri des propriétés fluorescentes de cellules, telles que la GFP exprimée par voie transgénique ou d'autres marqueurs de cellules de vie n'est pas possible avec cette technique. Il est actuellement limitée à l'utilisation d'anticorps de surface de cellule qui peut être conjugué à des billes magnétiques. Néanmoins, cette technique pourrait être étendu en fonction de l'équipement technique utilisé.

Depuis Miltenyi Biotec est actuellement le seul fournisseur de magnétiques des outils de tri cellulaire, il n'existe aucune alternative disponible à ce jour. Pour la dissociation des cellules, d'autres enzymes que la papaïne (à savoir la trypsine) pourraient être utilisés. Fait à noter, notre laboratoire a obtenu les meilleurs résultats avec la papaïne, puisque cela semble être l'enzyme de dissociation le plus doux dans nos mains. La fenêtre de temps de digestion à la papaïne (30-60 min) est variable. Dans ce laps de temps une digestion optimale a été atteint dans notre laboratoire. Plus ou moins longue durée d'incubation peut être nécessaire en fonction de la taille de l'échantillon, la qualité de l'échantillon unee enzyme utilisée. Test individuel est proposé.

Étant donné que seule étape MACS n'atteint pas des niveaux aussi élevés que la cytométrie de flux de pureté, une possibilité d'appliquer cette technique pourrait être tri négatif de cellules nocives indésirables et potentiels. Là, la fraction de cellules positives pour un marqueur de surface cellulaire donné, mais pas d'intérêt peut être réglé, en laissant la fraction isolée d'intérêt dans le flux à travers. Cela pourrait être fait à l'avance ou après une étape de tri positif et permet la poursuite de la discrimination de cellules en utilisant différents marqueurs de surface cellulaire, ainsi que l'élimination des cellules non souhaitées, comme des cellules de couche nourricière ou des cellules indifférenciées à partir de cultures de cellules souches pluripotentes, avec leur risque tumorigène potentiel . Par conséquent, MACS pourrait être adapté à la purification des photorécepteurs à partir de cultures de cellules souches embryonnaires ou de iPS dans des applications thérapeutiques futures possibles car elle représente un traitement doux, rapide et simple pour la purification de grandes quantités de cellules en culture. MACSpourrait être facilement appliquée à GMP conditions puisque les détails des étapes de tri, à savoir la mécanique des fluides, et les procédures sont réduites par rapport à la cytométrie en flux. Il est à noter, que MACS est déjà utilisée en routine dans des essais cliniques pour l'enrichissement de cellules du sang ou de moelle osseuse. Fait intéressant, MACS peut être appliquée sur les cellules, même en l'absence de marqueur approprié à la surface cellulaire est présent, génétiquement en introduisant un marqueur de surface pour rendre les cellules "compétent" pour la suite tri cellulaire magnétique étapes 15.

En résumé, MACS représente un outil fiable et rapide pour enrichir des cellules précurseurs de photorécepteur en utilisant des marqueurs de surface des cellules pour des études de transplantation. En outre, il s'agit d'un procédé facilement utilisable pour des applications cliniques futurs qui nécessitent des conditions GMP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgements

Nous remercions Anand Swaroop pour fournir souris Nrl-GFP, Jochen Haas pour le support technique, et Sindy Böhme et Emely Lessmann pour l'élevage.

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Centre de thérapies régénératives Dresde, le Programme de subventions, le SFB 655 semences CRTD, et la fondation ProRetina eV, la FOUILLES-BB Graduate Programme Dresde, et la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 supplied DNase I is not used in the method
Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 BD Pharmingen 550738 Stock concentration 0.5 mg/ml
Goat Anti-Rat IgG MicroBeads Miltenyi 130-048-501 Total volume of 2 ml
PBS Gibco 10010-015 Used to count the total number of cells
DNase I Sigma D5025-150KU
HBSS Gibco 14025050 Used for dissociation of the retinas
Trypan blue Sigma Fluka93595 Used to count the total number of cells
Vidisic Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor Pfizer 76579
Ketamine 10% Ratiopharm 7538843
Antisedan Pfizer 76590
Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% University Clinics Dresden Pharmacy
Preseparation Filters Miltenyi 130-041-407
LS Columns Miltenyi 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Fire polish glass Pasteur pipette Brand 74777 20 The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved.
MACS 15 ml tube rack Miltenyi 130-091-052
Cell count chamber Carl Roth T728.1
Sterile 15 ml tubes Greiner Bio-One 188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD can be used instead of Olympus SZX10
Olympus SZX10 Olympus SZX10 can be used instead of Leica M651 MSD
Olympus inverted stereo microscope CKX41 Olympus CKX41
Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance Thermo Scientific 51025411
1.5 ml Reaction tube Sarstedt 727706400
2 ml Reaction tube Sarstedt 72695
Eppendorf Centrifuge 5702 VWR (Eppendorf) 521-0733
Mouse head holder myNeurolab 471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in BD Pharmingen 304000
Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN Hamilton 065-7634-01 delivered without needles
Hamilton RN special needle 34 G Hamilton 065-207434 Blunt, 12 mm length
Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight Fine Science Tools 15003-08
Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie Fine Science Tools 11272-40
Diamond pen Tools-tech
15 mm x 15 mm Cover slips Sparks MIC3366

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
  2. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
  3. Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
  4. Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
  5. Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
  6. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. (2012).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
  8. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
  9. Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
  10. Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
  11. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
  12. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  14. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  15. Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats