Trapianto di cellule sottoretinico MACS purificata fotorecettore precursori nel topo adulto Retina

1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden
* These authors contributed equally
Published 2/22/2014
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Medicine

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Summary

Il trapianto cellulare rappresenta una strategia per il trattamento della degenerazione retinica caratterizzato dalla perdita dei fotorecettori. Qui si descrive un metodo per l'arricchimento dei fotorecettori trapiantabili e il loro innesto sottoretinico in topi adulti.

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Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J. Vis. Exp. (84), e50932, doi:10.3791/50932 (2014).

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Abstract

Compromissione della vista e cecità a causa della perdita delle cellule sensibili alla luce della retina, cioè fotorecettori, rappresenta la ragione principale per la disabilità nei paesi industrializzati. Sostituzione dei fotorecettori degenerati da trapianto di cellule rappresenta una possibile opzione di trattamento in applicazioni cliniche future. Infatti, recenti studi preclinici dimostrano che i fotorecettori immaturi, isolati dalla retina neonatale topo al giorno postnatale 4, hanno il potenziale di integrarsi nella retina di topo adulto dopo trapianto sottoretinico. Cellule del donatore generato una morfologia fotorecettore maturo compresi i segmenti interni ed esterni, un corpo cellulare rotonda che si trova al livello nucleare esterno, e terminali sinaptici in prossimità di cellule bipolari endogene. Infatti, studi recenti hanno dimostrato che i fotorecettori donatori funzionalmente integrarsi nei circuiti neurali dei topi ospitanti. Per una futura applicazione clinica di tale approccio sostituzione cellulare, sospensioni purificatedelle cellule di scelta dovranno essere prodotti e collocato nella posizione corretta per la corretta integrazione nell'occhio. Per l'arricchimento di precursori di fotorecettori, l'ordinamento dovrebbe essere basata su specifici antigeni di superficie cellulare per evitare la modifica giornalista genetica delle cellule del donatore. Qui vi mostriamo cellulare magnetico associato ordinamento (MACS) - arricchimento di trapiantabili precursori rod fotorecettori isolati dalla retina neonatale di topi giornalista specifico visive basate sul marker CD73 superficie cellulare. Incubazione con anticorpi anti-CD73 seguite da micro-perline anticorpi secondari coniugati consentiti l'arricchimento di asta precursori fotorecettrici da MACS a circa il 90%. In confronto a citometria a flusso, MACS ha il vantaggio che può essere applicata più facile da norme GMP e che importi elevati di cellule possono essere ordinati in periodi di tempo relativamente breve. Iniezione di sospensioni cellulari arricchiti nello spazio sottoretinico di adulti topi wild-type ha portato a 3 volte superiore comparabili tasso di integrazioneEd a sospensioni cellulari non ordinati.

Introduction

Vision è uno dei sensi principali di esseri umani. Perdite di valore di questo senso e cecità sono uno dei motivi principali per la disabilità nei paesi industrializzati. La causa predominante di disabilità visiva o cecità è la degenerazione della retina, caratterizzata da perdita di cellule fotorecettore, come si può osservare nella degenerazione maculare, retinite pigmentosa, cone-rod distrofia, e le altre condizioni. Ad oggi, una terapia efficace per ripristinare la visione perduta non è disponibile. Nel 2006 e nel 2008 due laboratori differenti segnalate, indipendenti gli uni dagli altri, un trapianto riuscito di cellule precursori fotorecettori asta in adulti topi wild-type retine 1,2. Così, derivanti possibilità di trapianto di cellule precursori dei fotorecettori anche in una retina degenerata, sostituire fotorecettori degenerati e ripristinare la visione. Infatti, è stato dimostrato di recente, che tali cellule fotorecettore precursori trapiantate suscitano criteri morfologici di fotorecettori maturi wild-type, come properly sviluppato segmenti esterni 3, terminali sinaptici in prossimità di cellule bipolari endogeni ed un corpo cuvetta cilindrica situata nello strato nucleare esterno 2-4, così come la capacità di integrare funzionalmente nei circuiti neurali ospitante 5-7. Uno dei principi fondamentali di questa strategia è l'uso di giorno post-natale 4 (PN 4, pN0 è definito come il giorno di nascita) giovani retine di topi, risultando in una miscela di diversi tipi di cellule per il trapianto. Sul fondo di una futura applicazione terapeutica, questa miscela deve essere purificato per cellule precursori dei fotorecettori. CD73 è stato descritto come il primo marcatore di superficie cellulare specifico per giovani fotorecettori nella retina 8-10. Qui, dimostriamo un metodo di purificazione dei fotorecettori precursore basato su questo marcatore superficie cellulare e con l'uso del cellulare magnetica associata smistamento (MACS) tecnica. MACS potrebbero avere vantaggi rispetto alle tecniche di separazione delle cellule fluorescenti attivati,a causa di tempi rapidi e la regolazione facile smistamento per condizioni di GMP. Abbiamo potuto dimostrare un arricchimento ~ 90% e un tasso di integrazione fino a 3 volte superiore quando il trapianto la popolazione arricchito allo spazio sottoretinico in adulti retine wild-type. Così, basato MACS arricchimento fotorecettori precursore e trapianto sottoretinico, sono tecniche affidabili e promettenti per lo sviluppo di una strategia terapeutica rigenerativa per il trattamento della degenerazione retinica.

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Protocol

Uso etico e cura degli animali dichiarazione:

Tutti gli esperimenti sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le leggi dell'Unione europea e tedesca (Tierschutzgesetz) e osservate la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico degli animali del TU di Dresda e il Landesdirektion Dresda (numero di approvazione: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Prima di iniziare dissociazione cellulare e ordinamento delle cellule

  1. Label tre provette da 15 ml di reazione con: Wash (W), frazione positivo (+) e la frazione negativo (-).

2. Retina Dissociazione

  1. Decapitare i PN 4 cuccioli con una forbice.
  2. Lavare la testina dei cuccioli poco in etanolo al 70% seguita da lavaggio in PBS.
  3. Trasferire la testa al freddo HBSS ed enucleare l'occhio (ripetere questo passaggio per tutte le teste). Per enucleare, aprire le palpebre e fissare tegli occhio con pinze curve in corrispondenza della zona nervo ottico. Quindi tirare l'occhio con attenzione fuori dall'orbita.
  4. Dopo enucleare tutti gli occhi, isolare la retina: introdurre una forbice chiusa nel nervo ottico e aprire le lame. Peal RPE / chorid fuori. Rimuovere le lenti e vasi sanguigni che utilizzano pinze curve.
  5. Trasferire le retine isolate in un tubo di reazione da 1,5 ml contenente la soluzione di papaina (fornito dal kit dissociazione papaina).
  6. Incubare le retine nella soluzione papaina per 30-60 min in un bagno d'acqua o shaker (400 rpm) a 37 ° C.
    1. Mentre retine incubare nella soluzione papaina, pipetta 1 ml di soluzione ovomucoid ad un tubo di reazione 15 ml (etichetta "1").
    2. Aggiungere 60 ml di DNasi I (10 mg / ml) + 60 ml di soluzione di ovomucoid (forniti dal kit) + 520 microlitri di EBSS ad un tubo di reazione 15 ml (etichetta "2").
  7. Dopo la papaina incubazione, trasferire la soluzione di papaina contenente le retine parzialmente digerite a rTubo eaction "2".
  8. Usando una pipetta di fuoco lucido, eseguire dissociazione meccanica (10x su e giù).
  9. Pipettare la sospensione singola cellula alla provetta di reazione "1". Provate a generare 2 strati stratificando delicatamente la sospensione cellulare in cima alla soluzione ovomucoid.
  10. Centrifugare per 5 minuti a 300 xg (circa 1300 rpm).
  11. Eliminare il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in 500 microlitri di tampone MACS.

3. Cella Ordinamento Uso magnetico cellulare associato Ordinamento (MACS)

  1. Aggiungere X microlitri ratto anticorpo anti-CD73 ai 500 microlitri al fine di ottenere una concentrazione finale di 10 pg / ml.
  2. Incubare 5 min in ghiaccio.
  3. Riempire i 15 ml tubo di reazione a 10 ml con tampone MACS e centrifugare per 5 minuti a una velocità di 300 x g.
  4. Rimuovere il surnatante.
  5. Risospendere il pellet in 480 MACS microlitri di buffer e aggiungere 120 ml di capra anti-topo IgG microsfere.
  6. Incubare 15 min in ghiaccio; fare nagitate ot, agitare o mescolare.
  7. Riempire i 15 ml tubo di reazione a 5 ml con tampone MACS e centrifugare per 5 min a 300 x g.
  8. Poiché il tubo di reazione è stata centrifugata:
    1. Regolare una colonna LS nel supporto magnetico.
    2. Mettere il filtro preseparazione in cima alla colonna LS.
    3. Idratare il filtro preseparazione e la Colonna LS con buffer di 3 ml MACS e raccogliere i MACS tampone nel lavaggio (W) del tubo.
  9. Rimuovere il surnatante.
  10. Risospendere il pellet in 500 microlitri di buffer MACS.
  11. Caricare la sospensione cellulare 500 microlitri al filtro, quindi aggiungere 1 ml MACS tampone al filtro e raccogliere la frazione negativo nella frazione negativo (-) tubo di reazione.
  12. Successivamente, aggiungere 3 x 3 ml di tampone MACS alla colonna di lavare via le cellule che non sono legati alla colonna
  13. Una volta che questi 9 ml sono attraverso la colonna LS, rimuovere la colonna dal supporto magnetico e installarlo sulla parte superiore della frazione (+) reazione positivatubo zione.
  14. Caricare rapidamente 5 ml di tampone MACS nella colonna LS e mettere il pistone nella Colonna LS e premere verso il basso fino a quando l'intero buffer è attraverso la colonna.
  15. Centrifugare la provetta contenente la frazione positiva per 5 minuti a 300 x g.
  16. Rimuovere il surnatante, risospendere in 500 ml di tampone MACS e conservare a 4 ° C.
  17. Contare la quantità totale di cellule utilizzando un dispositivo comune conteggio delle cellule.
  18. Preparare una sospensione cellulare dalla frazione filtrate positivo contenente 2 x 10 5 cellule / ml in tampone MACS e mantenere a 4 ° C

4. Il trapianto di MAC-filtrate cellule fotorecettrici Precursore nella retina di topo

  1. Assicurarsi di avere tutti i seguenti soluzioni pronte: 1 ml di PBS sterile o HBSS, 10 microlitri DNasi I, 1-2 ml sterile deionizzata H 2 O, aliquote delle frazioni di sospensione cella a 4 ° C.
  2. Anestetizzare il topo adulto (cioè 2-4 mesi)con una iniezione intraperitoneale di medetomidina cloridrato (0,01 mg/10 g di peso corporeo), ketamina (0,75 mg/10 g di peso corporeo). Poi fare una iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) per alleviare il dolore.
  3. Dilatare gli alunni con un calo del 2,5% Phenylephrin-Tropicamid 0,5%.
  4. Fissare il mouse in supporto della testina del mouse e mettere sotto il microscopio stereo.
  5. Applicare una goccia di gel Visidic contro l'essiccamento dell'occhio.
  6. Fai un piccolo foro al confine tra la sclera e la cornea (rispettivamente Ora serrata) utilizzando una sterile 30 G ½ in ago.
  7. Tagliare un vetrino di copertura comune in piccoli (circa 5 mm x 5 mm) pezzi utilizzando una penna di diamante, mettere uno di questi pezzi sulla parte superiore della cornea, che consente la visualizzazione diretta della retina.
  8. Lavare la siringa microlitro presterilized più volte con acqua deionizzata.
  9. Caricare la siringa microlitri di 1 ml di sospensione cellulare, l'ago diretto tangenzialmente attraverso la congiuntivae sclera e posto sotto controllo visivo nella metà nasale della retina.
  10. Punzone delicatamente un foro nella retina fino a raggiungere lo spazio sottoretinico, iniettare la sospensione cellulare nello spazio sottoretinico.
  11. Osservare il distacco bolloso della retina, che dovrebbe essere uniforme, che copre circa ¼ dello spazio retinico, senza alcun sanguinamento.
  12. Sfilare delicatamente la siringa, le guarnizioni dei fori retinici automaticamente.
  13. Lavare la siringa microlitro più volte con acqua deionizzata.
  14. Rilasciare il mouse da titolare testa.
  15. Svegliatevi topo mediante iniezione di cloridrato atipamozole per l'inversione dell'effetto medetomidina cloridrato.
  16. Posizionate il mouse per svegliarsi tempo in camera oscura calda (circa 25 ° C).
  17. I prossimi due giorni dopo il trapianto, buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) deve essere somministrato per via sottocutanea al mattino e al pomeriggio per alleviare il dolore.

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Representative Results

Per valutare la capacità di bastoncelli di integrarsi nella retina di topo, una linea giornalista topo è stato utilizzato, in cui GFP è guidato dalla retina neurale leucina zipper (NRL, NRL-GFP) promotore 11. NRL è il primo indicatore di bastoncelli partire la sua espressione a E12.5 tutta l'età adulta, permettendo una specifica etichettatura delle cellule fotorecettrici asta donatori.

PN 4 cuccioli Nrl-GFP sono stati decapitati e gli occhi sono stati enucleati. Retine sono state poi isolate e dissociate con il metodo sopra descritto. La sospensione cellulare risultante è stata poi ordinato mediante MACS basato CD73-(Figure 1 e 2). A seguito di ordinamento MAC, abbiamo analizzato l'arricchimento ottenuto durante questa procedura.

Come mostrato in Figura 3A, la sospensione cellulare iniziale (Input) conteneva 30,4% di cellule GFP-positive, cioè. bastoncelli. In seguito a base di CD73-MAC-ordinamento,un arricchimento fino al 86,9% nella frazione CD73-positive (CD73 +) è stata osservata mediante citometria di flusso. Nella frazione CD73-negative (CD73-) solo il 9,9% di tutte le cellule sono state identificate positive per GFP (Figura 3A). L'arricchimento di cellule positive Nrl-GFP seguenti MACS basato CD73-è inoltre visualizzato dopo la placcatura in vitro (Figura 3B).

Dopo MAC-ordinamento, le cellule donatrici della frazione CD73-positive sono stati centrifugati e risospese ad una concentrazione finale di 200.000 cellule / mL. Questa sospensione cellulare è stata ulteriormente utilizzato per un trapianto nello spazio sottoretinico di retine ospitanti wild-type (Figura 4). Da tre a quattro settimane dopo il trapianto, le retine di accoglienza sono stati fissati, isolati e sezionati. Diverse cellule donatrici integrati nello strato nucleare esterno degli host e acquisito la morfologia dei fotorecettori maturi con localizzazione del corpo cellulare nello strato nucleare esterno e formatio n di sferule sinaptiche e segmenti interni (Figura 5). Immagini dettagliate sono state pubblicate prima dal nostro gruppo 3,8 mostrando un risultato comparabile con le cellule-FAC ordinati trapiantate ad ospitare retine da altri gruppi 4,6,10. Costante in tutti questi studi è che le cellule trapiantate rimangono al sito di iniezione, definita dal bolloso retina ospite distaccata, e non migrano lontano. Alcuni integrarsi nella retina ospitante (cioè strato nucleare esterno), e alcuni rimangono nello spazio sottoretinico 3. Inoltre, è stato dimostrato, che la distribuzione delle cellule donatrici nel sito di integrazione dipende dal tipo di modello di topo utilizzato 5. Nessun segno di rigetto acuto host / trapianto sono stati rilevati nei trapianti tra topi C57BL/6J.

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Figura 1. Schema generale di trapianto sottoretinico di MACS purificati precursori dei fotorecettori in cellule di topo adulto retina. Donatori di PN 4 cuccioli Nrl-GFP sono isolati, seguiti da MAC-ordinamento e trapiantato nello spazio sottoretinico di retina ospite del mouse basati CD73-. Clicca qui per vedere grande figura .

Figura 2
Figura 2. Arricchimento dei fotorecettori transplantable da MACS. La sospensione cellulare generato da tutti raccolti retine PN4 viene incubato con anticorpi primari di ratto anti-CD73 seguite da lavaggio e incubazione con anticorpi anti-topo coniugate con microsfere. Gli anticorpi non legati vengono lavati via. La sospensione cellulare viene passato througah LS-colonna che è collegato con un supporto magnetico. Le cellule che sono vincolati da anticorpi rimangono attaccati alla colonna mentre le cellule rimanenti vengono eluiti e raccolti (frazione CD73-negativo). Infine, l'LS-colonna viene rimossa dal supporto magnetico e le cellule rimanenti vengono eluite e raccolte (frazione CD73-positivo). Clicca qui per vedere film pieno .

Figura 3
Figura 3. Analisi della Nrl-GFP arricchimento di cellule positive in seguito a base di CD73-MAC-ordinamento. (A) Prima di ordinamento, la popolazione iniziale delle cellule del donatore conteneva 30,4% di cellule positive Nrl-GFP. Dopo MAC-ordinamento, un arricchimento di cellule GFP-positive potrebbe essere rilevato nel CD73 + frazione (86,9%), mentre la CD73-frazione conteneva solo piccole quantità di cellule GFP + (9,9%). (B) l'immagine rappresentativa dimostra il risultato di base di CD73-MAC-ordinamento delle cellule PN4 Nrl-GFP. 1 milione di cellule provenienti da ogni frazione sono stati piastrati su vetrini laminina rivestite. Le cellule sono state fissate 4 ore dopo la placcatura con 4% PFA per 10 min. Le cellule sono state colorate con DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole, 1:20.000). Un arricchimento significativo di cellule GFP-positive nella frazione CD73 + è stata osservata rispetto alla frazione di ingresso o il CD73-frazione. clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4
Figura 4. Iniezione sottoretinico. Schema del processo di trapianto nel Retin topo adultoun. L'ago viene inserito attraverso un foro nel serrata, navigato attraverso lo spazio vitreale, evitando di toccare la lente e messi a retina sotto controllo visivo. Delicatamente spingendo, l'ago è perforato attraverso la retina e collocato nello spazio sottoretinico. Alla fine, la sospensione cellulare viene iniettato accuratamente sotto controllo visivo a valutare il processo di distacco.

Figura 5
Figura 5. Integrazione delle cellule fotorecettrici trapiantate. Immagine rappresentativa raffigurante MACS basato CD73 integrati filtrate cellule PN4 Nrl-GFP successivi al trapianto nella retina di topo adulto. Precursori di fotorecettori trapiantati si integrano correttamente nello strato nucleare esterno (ONL) e generano maturo fotorecettori morfologia.

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Discussion

Il trapianto di cellule precursori sottoretinico fotorecettori costituisce uno strumento affidabile per realizzare l'integrazione di queste cellule sensibili alla luce nella retina ospitante in numero significativo 1,2. Ciò potrebbe consentire la creazione di una terapia cellulare per il trattamento di malattie degenerative retiniche in futuro 6. Nella frazione donatore di cellule, attualmente isolate da PN 4 retine, è una miscela di diversi tipi di cellule, e che le sole cellule fotorecettrici precursori integrano dopo l'iniezione sottoretinico. Utilizzando basato CD73-MAC-ordinamento, la percentuale dei fotorecettori all'interno della sospensione di cellule donatore può essere aumentata fino a ≈ 90% che consente un tasso di integrazione di circa 3 volte superiore in retine di accoglienza wild-type rispetto alla popolazione di cellule indifferenziati 8. In confronto a citometria a flusso, MACS ha il vantaggio di una procedura veloce smistamento e che può essere applicato relativamente facile standard GMP. La purificazione dei fotorecettori transplantable è di sinteresse pecifici alla luce delle recenti vantaggi per la generazione in vitro di fotorecettori di cellule staminali pluripotenti 12-14. Colture di cellule staminali pluripotenti differenziate sono composti da diversi tipi di cellule che fanno la disponibilità di specifiche procedure di ordinamento una condizione essenziale per il loro uso futuro nelle terapie di trapianto cellulare.

Secondo la procedura MACS-purificazione, diversi punti sono degni di nota, garantendo un flusso di lavoro senza grandi disturbi. Maggiore è il numero di retine essere filtrate, è necessario più tempo per la loro digestione. Dopo digestione, durante la procedura di ordinamento, aggregazione delle cellule deve essere evitato. Ciò si verifica preferibilmente prima dell'aggiunta dell'anticorpo secondario e durante la sua incubazione. In questo caso, l'aggregato deve essere rimosso immediatamente con una pipetta. Durante l'eluizione di tampone MACS mentre la raccolta della frazione MACS-negativi, è assolutamente necessario non aggiungere più di 3 ml alla colonna.La pressione del buffer alla colonna sarà troppo alto se viene aggiunto tampone più di 3 ml. Questo disturba l'associazione dell'anticorpo alle cellule e abbassa ordinamento efficienza. Quando si rimuove la colonna dal supporto magnetico per avviare la raccolta della frazione MACS-positivi, questo passaggio deve essere fatto rapidamente. I 5 ml di tampone MACS dovrebbero essere aggiunti alla colonna più velocemente possibile. Inoltre, l'immersione dovrebbe essere messo e premuto rapidamente fino l'intero buffer è attraverso la colonna. Non è necessario preoccuparsi della pressione applicata. Il buffer MACS è isotonica e può essere variata. E 'possibile utilizzare tampone FACS, mezzo di coltura cellulare, PBS, EBSS o HBSS. Sterilità del buffer può essere ottenuto per filtrazione attraverso una membrana filtro 0,4 micron.

Dopo di arricchimento mediante MACS, un trapianto riuscito di cellule del donatore allo spazio sottoretinico può essere ottenuto mantenendo i seguenti punti. Poiché le cellule fotorecettrici sembrano essere molto sensibili al trattamento ex vivo,non è consigliabile tenerli il 4 ° C più del necessario. Procedere per il trapianto il più velocemente possibile. Quando si inserisce l'ago di iniezione nel bulbo oculare, è importante evitare di toccare la lente come l'ago metallico relativamente forte potrebbe danneggiare la lente con conseguente induzione di uveite lente-indotta. L'ultimo passo sulla strada per spazio sottoretinico, la penetrazione della retina, è cruciale. Non potendo osservato visivamente se viene raggiunto lo spazio sottoretinico è importante sviluppare una sensibilità per il diritto spinta pressione e resistenza del tessuto. Per verificare, se la testa ago è posizionato correttamente, un piccolo volume potrebbe essere applicato e il distacco della retina in testa ago deve essere osservato attentamente. Se un round, distacco bolloso senza sanguinamento sta formando, la posizione è corretta e il resto della soluzione può essere applicata con attenzione. Durante l'iniezione, l'ago deve restare nella posizione per evitare ulteriori danni al tessuto. Il foro cre retinicarati dal ago di iniezione sigillerà da solo se l'ago viene retratto lentamente. L'intera procedura deve essere eseguita nel minor tempo possibile per evitare ulteriori stress e danni agli animali. Durante il trapianto, la sospensione cellulare tende a raggrupparsi e bloccare la siringa microlitro. Se questo accade, una diluizione della sospensione cellulare utilizzando PBS sterile o HBSS è suggerito. Un'altra possibilità per superare questo problema è quello di aggiungere 1 ml di DNAsi I alla sospensione cellulare, per sciogliere grumi di DNA da cellule morte, che tendono ad incollare cellule viventi insieme.

Questo protocollo è limitata alla cernita magnetica delle cellule. Pertanto, le cellule potrebbero essere scelti per un solo marcatore per classificare rotondo. In confronto a citometria a flusso, in cui le cellule possono essere scelti utilizzando diversi marcatori (incluse le proprietà fisiologiche nonché diversi marcatori di superficie cellulare) Allo stesso tempo, questo è un grande svantaggio di questa tecnica. Ogni volta che l'ordinamento per diversi marcatori inè necessaria una finestra di tempo breve, citometria a flusso potrebbe essere la soluzione migliore. Inoltre, l'ordinamento di proprietà fluorescenti di cellule, come GFP transgenically esprime o altri marcatori cellulari vita non è possibile con questa tecnica. Attualmente è limitato all'uso di anticorpi di superficie cellulare che può essere coniugato con perline magnetiche. Tuttavia, questa tecnica può essere scalata base alla tecnica utilizzata.

Poiché Miltenyi Biotec è attualmente l'unico fornitore di strumenti di ordinamento delle cellule magnetiche, non c'è alternativa ad oggi disponibili. Per dissociazione cellulare, potrebbero essere utilizzati altri enzimi di papaina (cioè tripsina). Da notare, il nostro laboratorio ha ottenuto i migliori risultati con la papaina, dal momento che questo sembra essere l'enzima dissociazione più dolce nelle nostre mani. La finestra di tempo di digestione papaina (30-60 min) è variabile. In questa finestra temporale digestione ottimale è stata ottenuta nel nostro laboratorio. Tempo di incubazione più o meno lunghi potrebbe essere necessario a seconda della dimensione del campione, la qualità del campione unnd enzima utilizzato. Test individuale è suggerito.

Dato che a passo singolo MACS non raggiunge livelli di purezza alto come la citometria a flusso, un eventuale ulteriore applicazione di questa tecnica potrebbe essere cernita negativo di cellule dannose indesiderati e potenziali. Lì, la frazione di cellule positive per un determinato marcatore di superficie cellulare, ma non di interesse può essere risolto, lasciando la frazione di interesse isolata nel flusso attraverso. Questo potrebbe essere fatto in anticipo o dopo una fase di smistamento positivo e consente l'ulteriore discriminazione delle celle utilizzando diversi marcatori di superficie cellulare nonché la rimozione di cellule indesiderate, come le cellule feeder layer o cellule indifferenziate da colture di cellule staminali pluripotenti con il loro potenziale rischio tumorgenic . Pertanto, MACS potrebbe essere adatto per la purificazione dei fotorecettori da ES o IP colture cellulari in possibili applicazioni terapeutiche future quanto rappresenta un trattamento delicato, veloce e semplice per la purificazione di elevate quantità di cellule in coltura. MACSpotrebbe essere facilmente applicato a GMP-condizioni in quanto i dettagli della procedura di selezione, cioè la meccanica, fluidi e le procedure sono ridotti rispetto al citometria a flusso. È interessante notare, che MACS è già utilizzato di routine negli studi clinici per l'arricchimento di cellule da sangue o midollo osseo. È interessante notare che, MACS può essere anche applicato sulle cellule quando non adatto marcatore di superficie cellulare è presente, da geneticamente introducendo un marcatore di superficie per rendere le cellule "competente" per il successivo smistamento cellulare magnetica passi 15.

In sintesi, MACS rappresenta uno strumento affidabile e veloce per arricchire cellule precursori visive utilizzando marcatori di superficie cellulare per gli studi di trapianto. Inoltre, è un metodo facilmente impiegabili per future applicazioni cliniche che richiedono GMP-condizioni.

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Disclosures

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

Ci piace ringraziare Anand Swaroop per la fornitura di topi Nrl-GFP, Jochen Haas per il supporto tecnico, e Sindy Böhme e Emely Lessmann per la zootecnia.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Centro di terapie rigenerative Dresda, il Seme CRTD Grant Program, l'SFB 655, e la fondazione ProRetina eV, gli scavi-BB Graduate Program Dresda, e la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corporation LK003150 supplied DNase I is not used in the method
Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 BD Pharmingen 550738 Stock concentration 0.5 mg/ml
Goat Anti-Rat IgG MicroBeads Miltenyi 130-048-501 Total volume of 2 ml
PBS Gibco 10010-015 Used to count the total number of cells
DNase I Sigma D5025-150KU
HBSS Gibco 14025050 Used for dissociation of the retinas
Trypan blue Sigma Fluka93595 Used to count the total number of cells
Vidisic Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
Domitor Pfizer 76579
Ketamine 10% Ratiopharm 7538843
Antisedan Pfizer 76590
Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% University Clinics Dresden Pharmacy
Preseparation Filters Miltenyi 130-041-407
LS Columns Miltenyi 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi 130-090-976
Fire polish glass Pasteur pipette Brand 74777 20 The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved.
MACS 15 ml tube rack Miltenyi 130-091-052
Cell count chamber Carl Roth T728.1
Sterile 15 ml tubes Greiner Bio-One 188271
Leica M651 MSD Leica M651 MSD can be used instead of Olympus SZX10
Olympus SZX10 Olympus SZX10 can be used instead of Leica M651 MSD
Olympus inverted stereo microscope CKX41 Olympus CKX41
Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance Thermo Scientific 51025411
1.5 ml Reaction tube Sarstedt 727706400
2 ml Reaction tube Sarstedt 72695
Eppendorf Centrifuge 5702 VWR (Eppendorf) 521-0733
Mouse head holder myNeurolab 471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 in BD Pharmingen 304000
Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN Hamilton 065-7634-01 delivered without needles
Hamilton RN special needle 34 G Hamilton 065-207434 Blunt, 12 mm length
Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight Fine Science Tools 15003-08
Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie Fine Science Tools 11272-40
Diamond pen Tools-tech
15 mm x 15 mm Cover slips Sparks MIC3366

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
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