Isolasjon og Funksjonell karakterisering av menneskelig Ventrikulær Cardiomyocytes fra Fresh Kirurgiske Samples

1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nåværende kunnskap om cellulære grunnlag av hjertesykdommer stort sett er avhengig av studier på dyremodeller. Her beskriver vi og validere en ny metode for å oppnå enkle levedyktige cardiomyocytes fra små kirurgiske prøver av menneskelig ventrikkel myokard. Menneskelige ventrikulære myocytter kan benyttes til elektrofysiologiske studier og medikamenttesting.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Coppini, R., Ferrantini, C., Aiazzi, A., Mazzoni, L., Sartiani, L., Mugelli, A., Poggesi, C., Cerbai, E. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. J. Vis. Exp. (86), e51116, doi:10.3791/51116 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cardiomyocytes fra syke hjerter er utsatt for komplekse remodeling prosesser med endringer i cellestrukturen, eksitasjon kontraksjon kopling og membran ion strømninger. Disse endringene vil trolig være ansvarlig for den økte arytmogene risiko og kontraktile endringer som fører til systolisk og diastolisk dysfunksjon hos hjertepasienter. Men har mest mulig informasjon om de endringer av myocyte funksjon i hjertesykdommer kommer fra dyremodeller.

Her beskriver vi og validere en protokoll for å isolere levedyktige myocytes fra små kirurgiske prøver av ventrikkel myokard fra pasienter som gjennomgår hjertekirurgi operasjoner. Protokollen er beskrevet i detalj. Elektrofysiologiske og intracellulære kalsium målinger er rapportert å demonstrere gjennomførbarheten av et antall enkeltcellemålinger i humane ventrikulære cardiomyocytes oppnådd med denne metoden.

Protokollen rapporterte hanre kan være nyttig for fremtidige undersøkelser av cellulære og molekylære basis av funksjonelle forandringer av det menneskelige hjerte i nærvær av forskjellige hjertesykdommer. Videre kan denne fremgangsmåte anvendes for å identifisere nye terapeutiske mål på cellenivå, og for å teste effektiviteten av nye forbindelser på human cardiomyocytes, med direkte overføringsverdi.

Introduction

Disseksjon av de elektrofysiologiske egenskapene til hjertemuskelen har utviklet seg betydelig etter utvikling av teknikker for enkelt hjerte myocyte isolasjon. Nye fremskritt i forståelsen av hjerte eksitasjon kontraksjon kopling (EC-Coupling) har også blitt gjort mulig ved evnen til å isolere levedyktige enkelt cardiomyocytes som beholder alle de fysiologiske egenskapene til intakt vev. Patch klemme metoder blir rutinemessig brukt for å studere funksjonen og farmakologisk modulering av hjerte sarcolemmal ion strømninger. Opptak av intracellulære kalsium dynamikk med Ca 2 + sensitive fargestoffer er også jevnlig utført på enkelthjertemuskelceller fra en rekke friske og syke modeller, og gir viktige data om fysiologi av EF-Coupling samt på de patologiske endringer av intracellulær Ca 2 + homeostase fører til mekanisk svikt og økt arytmogene byrde i hjertesykdommer. Informasjon fra disse studiene er avgjørende for å forstå de elektrofysiologiske og mekaniske effekter av legemidler i klinisk setting. Det er imidlertid artsspesifikke forskjeller i transmembrane strømninger og i EF-Coupling proteiner som står for bestemte funksjoner i hjertets aksjonspotensial og hjerte mekanikk. Således, mens studier av myocytes isolert fra ikke-menneskelige pattedyr har belyst de biofysiske egenskaper og fysiologiske roller spesifikke transmembrane ionekanaler og EC-Coupling proteiner, de gir ikke nødvendigvis relevante modeller av menneskelig hjertemuskelceller. Isolering av levedyktige myocytes fra menneskelige myokard er derfor viktig å fullt ut forstå patofysiologien av hjertesykdommer og validere nye terapeutiske tilnærminger.

Humant atrielle vev er lett tilgjengelig som atriale vedheng blir ofte kasseres under kirurgiske prosedyrer. Innledende kvantitative studier av voksne menneskelige hjerteaksjonspotensialer og ionisk currents ansatt enzymatisk isolerte atrial celler 1-4. Opptak av aksjonspotensialer eller strøm fra isolerte voksent menneske ventrikulære celler har blitt videre rapportert 3,5-10. De fleste av disse undersøkelsene har brukt celler oppnådd fra eksplanterte hjerter og utnyttes enten kollagenase perfusjon av koronar segment eller eksponering av relativt store mengder av utskåret vev til kollagenase for å oppnå isolerte celler. Disse studiene tillatt en detaljert karakterisering av et antall transmembrane ion strømmer fra menneskelige ventrikkel kardiomyocytter fra sunt hjerte og fra pasienter med terminal hjertesvikt. Opptak av L-type Ca 2 + strøm (I CA-L) 5-7, forbigående utover kalium strøm (jeg) 8, innover liker kalium strøm (Jeg κ1) 8, de ulike komponentene av forsinket likeretter kalium strøm (Jeg κ ) 9 er rapportert. Fremskritt og raffinering avisoleringsprosedyre 10, tillates en klar karakterisering av ionisk basis av den økte arytmogene potensial i terminal hjertesvikt, som omfatter aksjonspotensial-forlengelse 11, forsinket etter depolariseringer 12 og økt morsom strøm 13 som fører til depolarisering diastolisk og premature slag.

Voksen hjertemuskelceller er normalt isolert fra små dyr ved retrograd perfusjon av hele hjertet med ulike enzymblandinger, en teknikk som gir høy avkastning av Ca 2 +-tolerante celler 14. Isolering av hjertemuskelceller fra fragmenter av vev er iboende mindre vellykket trolig på grunn av den begrensede tilgangen av enzymer til individuelle myocytes sammenlignet med det som oppnås ved perfusjon av koronararteriene. På grunn av den svært begrensede tilgjengeligheten av ubrukte donor hjerter, den eneste praktiske måten å få normale menneskelige ventrikulære celler på en jevnlig basis er ved enzymatisk digestion av de ofte svært små vev fragmenter skåret under elektive kirurgiske prosedyrer. Bare human sykdom modell som har blitt grundig karakterisert på cellenivå er terminal hjertesvikt, på grunn av tilgjengelighet til transplanterte hjerter. Imidlertid oppstår terminal hjertesvikt i et mindretall av pasientene og ofte innebærer en felles vei av alvorlig ombygging av hjerteinfarkt celler, noe som er relativt uavhengig av den underliggende årsaken 15. Evnen til å vurdere funksjonen av enkelt kardiomyocytter fra pasienter på et tidligere ikke-sviktende stadium av sykdommen er viktig for å forstå de spesifikke patofysiologien til forskjellige arvede eller ervervede forhold. Hypertrofisk kardiomyopati (HCM) er et talende eksempel. HCM er en vanlig (1/500 individer) arvelig hjerte tilstand karakterisert ved hjertestans hypertrofi, økt arytmogene risiko og kontraktile forandringer på grunn av utstrømningen tarmkanalen obstruksjon og diastolisk dysfunksjon 16. Cardiomyocytes fra HCM hjerter undergo en kompleks remodeling prosesser med endringer i cellestruktur (hypertrofi, myofibrillære uorden) og EF-Coupling 17. Imidlertid har de fleste av informasjon myocyte dysfunksjon i HCM kommer fra transgene dyremodeller. Siden bare et mindretall av HCM pasienter utvikler seg mot terminal hjertesvikt og krever hjertetransplantert, HCM hjerter er svært sjelden tilgjengelig for celleisolasjon med standard metoder. Men minst 30% av HCM pasienter utvikle obstruktive symptomer på grunn av massive septal hypertrofi endring utstrømningen tarmkanalen blodstrømmen under systole (HCM) 18. Den mest effektive tilgjengelige terapeutisk alternativ for lindring av obstruksjon i HCM er kirurgisk septal myectomy: i løpet av denne kirurgiske prosedyren, er en variabel størrelse del av øvre septum fjernet av trans aortic tilnærming. Denne delen av hypertrophied septum er derfor tilgjengelig for celleisolasjon fra den friske vev.

En fremgangsmåte for isolering av humant ventricular myocytes fra enkle, små transvenøse endomyokardbiopsi eksemplarer er tidligere utviklet og utgitt 19. Vi gjennomførte en metode for å isolere enkelt septal myocytes fra ventrikulære myokard prøver fra pasienter som gjennomgår hjertekirurgi, inkludert pasienter med HCM gjennomgår septal myectomy og pasienter som gjennomgår ventil erstatning prosedyrer. I tillegg til en detaljert beskrivelse av isolasjonsprotokoll, representativ elektrofysiologisk og Ca 2 + fluorescens målingene er presentert, som viser levedyktigheten til de isolerte humane ventrikulære myocytter, og gjennomførbarheten av patch clamp-og intracellulære Ca 2 +-studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle protokoller på menneskelig vev ble godkjent av etisk komité av Careggi Universitet-Hospital (2006/0024713, fornyet mai 2009). Hver pasient ga skriftlig informert samtykke.

En. Solutions og utstyr Forberedelse

Løsninger er beskrevet i tabell 1.. Et forenklet flytskjema for cellen isolasjonsprosedyren er funnet i figur 1.

Oppløsning CP DB KB TB PS EB1 EB2
Reagens (MM) KH 2 PO 4 50
MgSO 4 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
adenosin 5
glukose 140 10 20 10 10 10
mannitol 100
taurin 10 20 5 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl 2 </ Td> 1.2 5
KH 2 PO 4 0.6 30 0.6 0.6
Na 2 HPO 4 0.6 0.6 0.6
NaHCO3 12 12 12
KHCO 3 10 10 10
Na-pyruvat 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5 </ Td>
ravsyre 5
EGTA 0,5
K 2-ATP 2
pyrodruesyre 5
kreatin 5
KMES 115
Enzymer (U / ml) Kollaqenase Type V 250 </ Td> 250
Protease type XXIV 4
pH 7.4 KOH 7,3 NaOH 7.1 KOH 7,35 NaOH 7.2 KOH 7,3 NaOH 7,3 NaOH

. Tabell 1 Solutions som brukes for prøvetaking, celleisolasjon og funksjonell karakterisering av myocytes CP = cardioplegic løsning.; DB = dissosiasjon buffer; KB = Kraft-Bruhe løsning; TB = Tyrode buffer; PS = pipette løsning; EB1 = enzym buffer 1; EB2 = enzym buffer to.

  1. Forbered cardioplegic (CP) løsning. CP-løsning kan lagres ved 4 ° C i opptil 1 uke.
  2. Forbered Ca 2 +-free dissosiasjon buffer (DB). Denne løsningen bør brukes i løpet av dagen.
  3. Forbered Kraft-Bruhe (KB) løsning. KB-løsning kan oppbevares ved 4 ° C i opp til en week.
  4. Forbered Ca 2 +-free Tyrode buffer (TB). Denne løsningen bør brukes i løpet av dagen.
  5. Filtrere alle løsninger ved hjelp av sprøytefiltre før bruk.
  6. Klargjør fordøyelse enheten (figur 2), en skrape beholder laget av to motstående børster av silikonelastomer, hvorav det ene roteres av en elektrisk motor. Fordøyelsen enheten er spesiallaget. Detaljer på fordøyelsen enheten er i figur 8; bilder av enheten er i figurene 2 C og 2D. Vask vevet kammer med 70% etanol og vann.

2. Innsamling og behandling av hjerteinfarkt Samples

  1. Hell 40 ml av cardiplegic (CP) løsning i en 50 ml tube og lagre den i is for prøve transport fra operasjonsstuen til celleisolasjon lab.
  2. Samle ventrikulære myokardielle prøven fra den operative rommet umiddelbart etter eksisjon, vaske den med iskaldCP-løsning og lagre den i røret. Bruk endokardiale prøver skåret ut fra den øvre inter ventrikkel septum under åpen hjertekirurgi, vekting> 100 mg.
  3. Overfører raskt prøven til laboratoriet området; starte prøven behandling innen 10 min fra prøven excision.
  4. Mens du holder prøven i iskald CP buffer, fjerne endokardial fibrotiske lag med gode saks under en stereo nøye; etterpå, kutt hjerteinfarkt vev til små biter (2-3 mm lange). Avhengig vevsprøve størrelse, klippe et samlet beløp på ventrikkel myokard mellom 100 mg og 1 g for hver isolasjon.
  5. Ved ferdigstillelse av vev hakking, overføre myokardielle biter inn i fordøyelsen enhet, med ren iskald CP løsning. Unngå å fylle hele volumet mellom de to silisiumbørstene (3-4 ml) med myokardiale biter, ved hjelp av ikke mer enn 1 g av total vev.

Tre. Vask og fordøyelse av Hjerteinfarkt Biter

  1. Aktereh biter blir overført til den skrapkammeret til nedbrytningsenheten, endre CP buffer i kammeret med kaldt Ca 2 +-fri buffer dissosiasjon (DB).
  2. Plasser fordøyelse enheten i et termostatisk bad, for at kammeret skal være i kontakt med det oppvarmede vann i badekaret (figur 1). Still-bad til 37,5 ° C og slå den på, for å sakte heve temperaturen på vevet kammeret. Slå på motoren til nedbrytningsenheten, innstilling av rotasjonshastigheten til en omdreining / sekund.
  3. Utfør tre vaskesykluser med DB, å endre oppløsningen i kammeret med rent DB hver 8 min. DB er varmet (37 ° C) og oksygen mettet før å komme i kontakt med de hjerteinfarkt biter.
  4. Forbered enzym buffer 1 (EB1) ved tilsetning av 250 U / ml Collagenase Type V og 4 U / ml Protease type XXIV til DB-løsning. Forbered enzym buffer 2 (EB2) ved tilsetning av 250 U / ml Collagenase Type V DB til løsningen. Varm opp (37 ° C) og oxygenate EB1 og EB2.
  5. Utfør to 12 min sykluser av fordøyelse i den roterende fordøyelsen apparat med 100% oksygenert EB1 (ved 37 ° C). Ved hver syklus, bruker ~ 3 ml EB1. Fjern løsningen med pipette aspirasjon og kast den etter hver syklus.
  6. Forbered seks 15 ml-rør for cellesamling og ~ 80 ml kald (4 ° C) KB-løsning for eluering bufferne.
  7. Utfør en første 15 min fordøyelse syklus med 3 ml 100% oksygenert EB2 ved 37 ° C. Etter fordøyelse syklus, samle oppløsningen inneholdende de første dissosierte muskelceller i et 15 ml rør og fortynnet cellesuspensjonen med 12 ml kald KB-løsning. Oppbevar røret flatt i romtemperatur.
  8. Fortynn den gjenværende EB2 løsning med en like stor mengde av DB for å halvere konsentrasjonen av kollagenase V for de følgende fordøyelsen sykluser.
  9. Utføre andre 5 12 min fordøyelse sykluser med 3 ml EB2 ved 37 ° C; etter at hver av dem samle av myocyte holdig buffer i et 15 ml konisk rør ogfortynne det med 12 ml KB løsning. Oppbevar 6 celle inneholdende rør ved romtemperatur i 30 min.

4. Cell resuspensjon og Ca 2 + readaptation

  1. Til 1 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) til 20 ml Ca2 +-fri Tyrode-buffer (TB). Filtrer løsningen.
  2. Sentrifuger seks myocyte inneholder koniske rør på 100 xg i 5 min å tvinge myocytes å bosette. Fjern supernatant og resuspender cellene i hvert rør med en variabel mengde (1-3 ml, avhengig utbytte) av BSA innehold TB ved RT.
  3. Gradvis økning av Ca 2 +-konsentrasjonen i cellen inneholdende buffer ved å tilsette små porsjoner av 100 mmol / l CaCl 2 løsning. I de første og andre trinn av Ca 2 +-konsentrasjon er hevet opp til 50 pmol / l og 100 pmol / L, henholdsvis. De følgende Ca 2 + addisjon trinn utføres hver 5 min, og konsentrasjonen hevet med 100 pmol / L ved hvert trinn to en sluttkonsentrasjon på 0,9 mmol / L.
  4. Utrede utbyttet av isoleringsprosedyren. Overfør 0,5 ml myocyte holdig oppløsning på glasset bunnkammeret i et mikroskop. Evaluere 15 mikroskop felt på 10x objektiv forstørrelse og beregne hvor stor andel av sunne myocytes (f.eks stavformede celler med tydelige striper og ingen vesentlige slutninger, Figur 2). Den forventede avkastningen er rundt 20%.

5. Funksjonell Evaluering av Isolert Cardiomyocytes.

Følgende protokoll er et eksempel på menneskelig cardiomyocyte funksjonell vurdering inkludert samtidige opptak av aksjonspotensialer og intracellulære Ca 2 + flukser.

  1. Forbered pipette løsning (PS) for patch clamp eksperimenter i perforert patch konfigurasjon. Løsningen kan bli lagret ved -20 ° C i opp til 3 måneder.
  2. Til 1,8 mmol / L CaCl 2 til Ca2 +-fri Tyrode-buffer (TB). Use denne løsningen for superfusjons av kardiomyocytter under patch clamp / fluorescens eksperimenter.
  3. Overføring 1 ml av cellesuspensjonen til et 1,5 ml rør og tilsett 10 pmol / L Fluoforte og 10 pl Powerload konsentrat. Inkuber i 30 minutter ved RT. Deretter setter røret i vertikal stilling og forlater cellen til å sedimentere i 5 min; resuspender cellene i Ca 2 + inneholder TB.
  4. Overfør 0,25 ml av cellesuspensjonen til en liten (0,5 ml), temperaturstyrt mikroskop montert opptak av kammeret, superfuseres av tyngdekraften med en oppvarmet microperfusor system ved en strømningshastighet på 0,3 ml / min (temperatur: 37 ± 0,5 ° C).
  5. Ved hjelp av en mikropipette avtrekker, forberede patch clamp pipetter med en spiss diameter på 3 til 5 mikrometer og en motstand 3 til 4,5 M når den er fylt med PS.
  6. Legg amfotericin B til en gruppe med PS (250 mikrogram / ml) og bruke den til å fylle elektrodene.
  7. Velg en stang formet celle med klare striper, blottet for inneslutninger, form den giga segl og vente 5 til 10 min, før tilgang motstanden synker under 20 MΩ.
  8. Framprovosere aksjonspotensialer i strømtang-modus ved hjelp av korte pulser (<3 msek) ved ulike frekvenser av stimulering (0,2 Hz, 0,5 Hz og 1 Hz, 1 min på hver frekvens). Under innspillingen fasen, slå på lyse felt belysning på 492 ± 3 nm og oppdage Fluoforte fluorescens ved 505-520 nm. Erverve fluorescens og membranpotensialet signaler ved hjelp Digidata 1440A og pClamp 10,0 programvare. Gjenta innspillingen sekvens flere ganger om nødvendig; imidlertid holde den totale registreringstid under 15 min for hver celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden beskrevet ovenfor ble anvendt for å karakterisere de funksjonelle forandringer av kardiomyocytter isolert fra septum av pasienter med hypertrofisk kardiomyopati (HCM) som gjennomgikk myectomy drift, sammenlignet med ikke-sviktende uten hypertrofiske kirurgiske pasienter 21. Resultatene i dette avsnitt er utledet fra det arbeidet 21, og er her vist som et eksempel på hvordan denne teknikken kan brukes til å karakterisere endringer av myokardial cellefunksjon hos hjertesykdomstilstander.

Et representativt kirurgisk prøve fra en pasient med HCM er vist i figur 2A. Kirurgiske prøvene var svært variabel i form av størrelse og tykkelse av endokardiale fiber striper. Mengden av hjerteinfarkt vev som vi brukte for hver isolasjon prosedyre fra HCM prøvene var rundt 1g. I stedet, er mengden av vev som brukes for kontrollprøvene var mindre (100 til 500 mg.), På grunn av Lower vev tilgjengelighet. Utbyttet var signifikant høyere når kontrollprøver ble behandlet med hensyn på HCM, sannsynligvis fordi den relative mengden av levedyktige hjerteinfarkt celler i vevet er redusert i HCM myokardium og Endomyokardial fibrose økes 22.. Fra disse observasjon vi konkluderte med at den nødvendige mengde vev for å oppnå levedyktige celler kan være variabel, avhengig av fravær eller tilstedeværelse av myokardial sykdom.

Prøver ble kuttet i små biter, som vist i figur 2B. Deretter ble biter overført til kammeret av fordøyelsesenhets (figur 2C), og brukt for enkeltcelleisolasjon som beskrevet ovenfor (figur 2D). Representative mikrofotografier av en cellesuspensjon erholdt ved hjelp av den beskrevne celleisolasjon fremgangsmåte fra et septum prøven er vist i figurene 3A og 3B; forstørrede bilder av enkelt ventrikkel cardiomyocytes er avbildet i figur 3C-3F. Cardiomyocytes fra HCM prøver ble brukt for samtidige opptak av aksjonspotensialer og intracellulære Ca 2 + variasjoner som beskrevet i protokollen delen. Representative samtidige spor som viser membranspenning (over) og intracellulær Ca 2 + (nedenfor) under stimulering ved tre forskjellige frekvenser er vist i figur 4: Disse spor ble registrert fra en enkelt cardiomyocyte isolert HCM fra en prøve.

Resultater av patch clamp studier viste at varigheten av virkningspotensialet (APD) tatt opp på forskjellige frekvenser av stimuleringen ble markert forlenget i kardiomyocytter fra pasienter med HCM (HCM kardiomyocytter) sammenlignet med kontroller (figur 5A og 5B). Å fastslå vedlikehold av fysiologiske responser i isolerte myocytes, vi testet effekten av isoproterenol, brukes ved 10 - 7 M (figur 5C): β-adrenergisk stimulering produsert forventet AP forkorting i kontroll myocytes. Ettersom langvarig APD fører til økt risiko for tidlig etter depolarisations (Eads) 23, forekomsten av EAD, detektert som spontane depolarisations i platåfasen av AP, ble målt. I HCM cardiomyocytes, EAD var signifikant mer hyppig sammenlignet med kontroller (figur 5D). Representant spor som viser flere EAD er vist i figur 5E

For å teste om lengre APD og ion dagens avvik kan påvirke eksitasjon-kontraksjon koblingsmekanismene i HCM cardiomyocytes, ble egenskapene til intracellulære Ca 2 + variasjoner vurderes under stimulering. Amplituden av Ca 2 +-transienter fremkalt i strøm-klemme betingelser var like i HCM sammenlignet med kontroll kardiomyocytter (figur 6A). Motsatt, kinetikken av Ca 2 + forbigående, var signifikant lenger i HCM (Figur6B). I tillegg intracellulær diastolisk Ca 2 +-konsentrasjon var markert høyere i HCM sammenlignet med kontroll kardiomyocytter (figur 6C) og økte mer fremtredende ved økning i frekvens stimulering.

Spesielt, cardiomyocytes isolert med denne metoden fra menneskelige ventrikulære prøvene har også blitt ansatt for andre applikasjoner, inkludert spenningsklem innspillinger av spesifikke transmembrane strømmer (figur 7A), intracellulær Ca 2 + og / eller celle forkorte opptak under elektrisk felt stimulering (figur 7B) og vurdering av den fine struktur av sarcolemma ved hjelp av konfokal mikroskopi og membran-bundet fluorescerende markører (figur 7C).

Figur 1 Figur 1. Flytskjema for celleisolasjon prosedyre.

Fig. 2
Figur 2. Behandling av ventrikulære prøver for celleisolasjon. (A) Representative bilde som viser en prøve av ventrikulære myokardium fra en pasient med HCM som gjennomgikk septal myectomy drift. Kalibrering bar = 5 mm. (B) Biter av ventrikulær vev skåret fra en ventrikulær kirurgiske prøven, som skal benyttes til celleisolasjon. Kalibrering bar = 5mm. (C) bilder fra fordøyelsesenhets. Anordningen omfatter et kammer fordøyelse med to silisium børster: den overlegne børsten er i stand til å rotere når de beveges av en motor (D) Bildet viser nedbrytningsenheten i det termostatstyrt bad ved enzymatisk fordøyelse av ventrikulært vev.. p>

Figur 3
Figur 3. Isolerte menneskelig ventrikkel cardiomyocytes. (AB) Panelet viser photomicrographs av to mikroskop felt (10x objektiv) viser representative cardiomyocyte suspensjoner. Av notatet, ca 30% av cellene er stang formet og viser tydelige striper. Kalibrering bar = 100 mikrometer. (CE) Representative bilder av tre menneskelige cardiomyocytes isolert fra en prøve av et HCM pasient (40x objektiv). Kalibrering bar = 20μm. (F) Bilde som viser et menneske ventrikkel cardiomyocytes berørt av tuppen av plasteret pipetten for opptak. Kalibrering bar = 20μm.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/51116/51116fig4.jpg "/>
Figur 4. Samtidig opptak av membranpotensial og intracellulær kalsium.. Representative spor som viser membranpotensialet (ovenfor) og intracellulært kalsium (nedenfor) registrert fra en enkelt myocyte isolert HCM fra en prøve. Den myocyte stimuleres via patch pipetten på 0,2 Hz, 0,5 Hz og 1 Hz.

Figur 5
Figur 5. Endringer av aksjonspotensialer i ventrikkel cardiomyocytes fra HCM prøver. (A) Representant lagret aksjonspotensialer fremkalte på 0,2 Hz, 0,5 Hz og 1 Hz fra en kontroll myocyte (venstre, grå spor) og en HCM myocyte (høyre, svarte spor ). (B) Gjennomsnitt varigheten av aksjonspotensialet ved 90% repolarisasjon (APD90%) i HCM (n = 81) ogkontroll cardiomyocytes (n = 29) på de tre pacing-frekvens som er testet. (C) Forekomst av EAD i kardiomyocytter fra HCM pasienter og kontrollprøver. (D) Superimposed aksjonspotensialer på 0.5Hz fra en kontroll myocyte i fravær (kontinuerlig spor) og i nærvær av 10 -7 M isoproterenol. (E) Representative spor som viser membranpotensialet i en cardiomyocyte fra en HCM pasient som viser flere spontane depolariseringer som opptrer i platåfasen (tidlig etter depolarisering, EAD), som er merket med piler. Stimuli er preget av korte linjer under sporingen. ** = P <0,01 uparet t-test. Alle paneler i figuren er modifisert med tillatelse fra Coppini et al. 2012 21.

Figur 6
Figur6. Endringer av kalsium transienter i ventrikkel cardiomyocytes fra HCM prøver. (A) Representant lagret kalsium transienter fremkalte under stimulering på 0,2 Hz via lappen pipetten i en kontroll myocyte (grå) og en HCM celle (svart). Spesielt, ikke amplitude av Ca 2 + transienter ikke skiller mellom de to celler (B) kinetikk av Ca 2 + transienter i HCM (n = 42) og kontroll (n = 24) kardiomyocytter:. Tid fra stimulans til topp transient (TP ), tid fra topp til 50% råte (T50%) og tid fra topp til 90% nedbrytning av forbigående (T90%) er vist. (C) Representative lange spor som viser intracellulær Ca 2 + i løpet av stimulering på tre forskjellige frekvenser i HCM og kontroll myocytes, fremhever økt diastolisk Ca 2 + ved høye pacefrekvenser i HCM myocyte. (D) Gjennomsnittlig diastolisk Ca 2 + i HCM (n = 42) og kontroll (n = 24) cardiomyocytes på tre forskjellige pacing rates. ** = P <0,01 uparede t-test. Alle paneler i figuren er modifisert med tillatelse fra Coppini et al. 2012 21.

Figur 7
.. Figur 7 Andre eksperimentelle applikasjoner med humane ventrikulære myocytes (A) Venstre: representant lagret spor som viser L-type Ca 2 + strøm registrert under spenning klemme på ulike membran spenninger med en spesifikk protokoll (se 21 for detaljer). Høyre: vanlig L-type Ca 2 + strøm peak tetthet fra 18 celler isolert fra HCM prøver på ulike membran. Spenninger. (B) Intracellulær Ca 2 + spore opp fra en ventrikkel myocyte under elektrisk felt stimulering på 1 Hz. (C) Confocal bilde av en ventrikulær cardiomyocyte fra en HCM prøve farget med et fluorescerende membran bundet fargestoff (Di-3-ANEPPDHQ). Av notatet, er tettheten av ttubules lav, noe som tyder på morfologiske membran ombygging i HCM.

Figur 8
Figur 8. Fordøyelsen enhet. (AB) Komponenter av fordøyelsesenhets. En variabel hastighet roterende motor er koblet til en første plast-arm, som er forbundet med en ny en. Det andre plast arm er avtagbar og er koblet til den øvre børste. Børster er laget med silikon elastomer. En PTFE negative mold, med 100 hull fordelt ~ 1,5 mm ble brukt til å støpe børster fra flytende silikon. Det indre rom av formen er 1,9 cm i diameter, og er 6 mm tykk, som produserer børster med samme størrelse. Hullene er plassert på en side av støpeformen er laget for å produsere 8 mm lange bust når børsteneer støpt og tatt ut av støpeformen. Etter at den flytende silikon settes inn i støpeformen, er i det minste 48 timer er nødvendig for fullstendig herding. Børster er montert inne i et glassrør (indre diameter = 2 cm, tykkelse 2 mm) og det sylindriske kammeret som dannes av de to børster og glassvegger er hermetisk avtettet ved hjelp av to O-ringer. Børster trenger å bli skjøvet til hverandre; den nederste er limt på en plast-base, mens den øvre er limt fast til plast ende av motorarmen, og dermed er i stand til å rotere. (C) Forstørret visninger av den øvre børste. Til opplysning, må børste for å bli limt til enden av motorarmen for at den til å rotere (D) Komponentene i kammeret er vist i sin endelige stilling. Mellomrommet mellom de to børstene (selve kammer) er ~ 2 cm brede og 7-8 mm høyt; denne plassen passer lett 3-4 ml buffer, annet enn opp til 1 g av hjerteinfarkt vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrevet og validert en metode for å isolere levedyktige myocytes fra kirurgiske prøver av menneskelig ventrikkel myokard. Starter fra tidligere beskrevet protokoller som hadde blitt brukt til isolerte celler fra atrial kirurgiske prøver, teknikken for å tillate utskilling av enkeltlevedyktige myocytes fra sykelig ventrikkel myokard ble utviklet og finjustert. Tidlige rapporter viste at isolering av enkelt cardiomyocytes fra biter av atrial og ventrikulær vev selektivt svekket repolarizing kaliumstrøm, noe som resulterer i endrede elektrofysiologiske egenskaper og reaksjoner på fysiologiske stimuli 8,24, mens levering av enzymet inneholder buffer via koronar perfusjon ikke svekke forsinket liker strømninger i isolere celler 25. Dessverre kan isolering av humane ventrikulære myocytter fra kirurgiske prøver av ventrikulære myokardium ikke utføres ved koronar perfusjon fordi integriteten koronare greneneer tapt, er i strid med eksplanterte hjerter. Cardiomyocytes isolert fra myokardielle biter ved hjelp av vår metode viser en klar tilpasning av varigheten av aksjonspotensialet i respons til endringer av pacing frekvens eller å β adrenerge stimulering. For at slike tiltak skal inntreffe, er integriteten til forsinket likeretter kaliumkanaler som kreves 26-28, noe som tyder på det totale sikkerheten for disse kanalene er ikke svekket av vår isolasjonsmetoden. I tillegg celler isolert med våre fremgangsmåter viser ikke bare vanlige elektrofysiologiske responser (figurene 3 og 4), men også vise kalsium transienter av den forventede form og varighet (figurene 3 og 5) og regelmessig sarcomeric organisasjon (figur 2) og forkortnings-egenskaper (ikke vist), noe som tyder på at den totale strukturelle integritet av disse celler blir bevart ved denne isoleringsprosedyre. Den viktigste utvikling av denne fremgangsmåte i forhold til tidligereteknikker er gitt av den nykonstruerte fordøyelse enhet, som leverer skånsom mekanisk omrøring av vev-biter, slik at enkeltcelleseparasjon uten overdreven skade. Videre har bruken av fordøyelsen enheten tillater oss å anvende en lavere konsentrasjon av enzymer i cellen isolert buffer; Særlig bruker vi en mye lavere konsentrasjon av selektive protease i sammenligning med tidligere rapporterte metoder 24. Anordningen er spesiallaget i vårt laboratorium: bygnings skjematisk er vist i figur 8.

Den enkle designen og strukturen gjør det svært enkelt å gjenskape for et vellykket resultat av denne protokollen. Legenden Figur 8 beskriver også de prosedyrer som kreves for å produsere de silikon børster og bygge skraping kammeret. På grunn av fordelene med fordøyelsen enhet, kan oppnås et relativt høyt antall av levedyktige celler fra en forholdsvis lav mengde av ventrikulær vev (så lav som 100 mg).En tidligere utgitt metode 19 ble vist å gi en kalsium tolerante myocytes fra små biopsier (selv <20 mg). Imidlertid rapporterte myocyte utbyttet var meget lavt og forfatterne viste ikke hvorvidt celler isolert med denne metoden var mulig for karakterisering av intracellulært kalsium sykling og kontraktil funksjon. Denne teknikken er potensielt aktuelt for mange kirurgiske pasienter, ettersom små deler av septum blir ofte fjernet under prosedyrer ventil erstatning (f.eks. Aortaklaffen erstatning). Imidlertid er det avgjørende for å oppnå en vellykket isolasjon en rask initiering av fremgangsmåten etter prøvetaking fra operasjonssalen. Derfor er det nødvendig for celle laboratorium for å være i umiddelbar nærhet til hjertekirurgi klinikk, i For at denne teknikk skal være fruktbar. I tillegg, er en passende enzymaktivitet også svært viktig for en vellykket isolasjon. Siden den selektive proteaseaktivitet of hver kollagenase parti er vanligvis ikke helt testet, er hvert parti sannsynlig å utføre på en annen måte under celleisolasjon. Det er derfor viktig å finjustere den endelige konsentrasjonen av collagenase for å oppnå de beste resultatene. Vi foreslår å observere cellesuspensjonen under mikroskop ved hver syklus, for å være sikker på at levedyktige celler begynner å vises på syklusen 3 for tidlig opptreden av celler antyder dreven enzymaktivitet og ber mot reduksjon av enzymkonsentrasjonen.; Utseendet av celler etter syklus 3 antyder tilstrekkelig enzymaktivitet. I vår erfaring, er dette den mest effektive indikator på riktig enzym konsentrasjon.

Vi har med hell brukt denne metoden til å skaffe enkelt cardiomyocytes fra den inter-ventrikkel septum av HCM pasienter med venstre ventrikkel utstrømningen tarmkanalen obstruksjon gjennomgår kirurgisk septal myectomy, samt fra ikke-sviktende ikke-hypertrofiske kirurgiske pasienter 21. Resultater fra dette papiretviser at myocytes isolert med denne metoden kan benyttes for komplett elektrofysiologisk evaluering med patch clamp teknikker samtidig vurdere EF-kopling unormalt, ved å registrere den intracellulære kalsium dynamikk med fluorescerende fargestoffer. Opptaksfremgangsmåten beskrevet her er beskrevet tillater oss å samle flere fysiologiske celleparametere med et enkelt opptak fra hver celle, og dermed produsere en stor mengde av data med et begrenset antall celler og prøver. Takket være disse fordelene, har denne metoden blitt brukt for å karakterisere de spesifikke funksjonelle avvik av ventrikulære cardiomyocytes fra HCM pasienter, sammenlignet med ikke-hypertrofiske pasienter 21. Abnormiteter ion strømmer og aksjonspotensial varighet, samt kinetiske anomalier od intracellulær Ca 2 + sykling ble klart identifisert ved hjelp av denne teknikken, med høy reproduserbarhet. I tillegg har vi vist at behandling med en selektiv inhibitor av Na + sent vs. placebo hos pasienter med HCM 29, som for tiden pågår.

Menneskelig hjerte prøven tilgjengelighet er relativt beskjeden, selv i spesialiserte sentre, og dette kan begrense et stort bruksområde for denne teknikken. Likevel er kvaliteten på informasjonen som kan oppnås direkte fra pasientprøver på sykdomsrelaterte endringer i cardiomyocyte funksjon kan sammenlignes med det som er oppnåelig fra dyremodeller av HCM og andre hjertesykdommer. Med de store forskjeller mellomfysiologi av menneskelige og murine hjertemuskelceller, kan data fra funksjonell evaluering av menneskelige myocytes være svært verdifull. Som konklusjon, tror vi at fremtidige anvendelser av denne teknikken kan bidra vesentlig til kunnskap om hjertesykdommer, siden vår protokoll gir mulighet til å utføre et komplett sett av funksjonelle vurderinger direkte på celler fra pasientprøver, med umiddelbar overføringsverdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av EU (STREP Prosjekt 241577 "stort hjerte," 7th European Framework Program, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), TV-aksjonen GGP07133 (CP) og Gilead Sciences (AM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O) Sigma-Aldrich M1880
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3) Sigma-Aldrich 237205
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
Sodium hydroxide(NaOH) Sigma-Aldrich S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate Sigma-Aldrich 49601
Pyruvic acid Sigma-Aldrich 107360
3-Hydroxybutyric acid Sigma-Aldrich 166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) Sigma-Aldrich A8937
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Succinic Acid Sigma-Aldrich S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E0396
Albumin from bovine serum Sigma-Aldrich A0281
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V Sigma-Aldrich C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV Sigma-Aldrich P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115
Calcium chloride 0.1 M solution Sigma-Aldrich 53704
Potassium methanesulfonate Sigma-Aldrich 83000
FluoForte Reagent Enzo Life Sciences ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X Life Technologies P10020
Perfusion Fast-Step System Warner Instruments VC-77SP
Amphotericin B solubilized Sigma-Aldrich A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular Devices
Digidata 1440A Molecular Devices
pClamp10.0  Molecular Devices
Digestion Device CUSTOM CUSTOM The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes Dow Corning SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device Crouzet Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting N.A. N.A. The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
  3. Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
  4. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
  5. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
  6. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  7. Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
  8. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
  9. Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
  10. Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
  11. Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
  12. Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
  13. Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
  14. Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (2013).
  15. Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
  16. Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
  17. Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
  18. Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
  19. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  20. Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
  21. Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
  22. Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
  23. Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
  24. Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
  25. Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
  26. Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
  27. Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
  28. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
  29. Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics