Einrichten einer
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

Medicine
 

Summary

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

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Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J. Vis. Exp. (88), e51278, doi:10.3791/51278 (2014).

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Abstract

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​spezifisch reguliert molekularen und zellulären Fluss zwischen Blut und Nervengewebe. Unser Ziel war die Entwicklung und Charakterisierung eines hoch reproduzierbare syngenen Ratten in vitro-Modell der BHS mit Co-Kulturen von primären Ratten-Gehirn-Endothelzellen (RBEC) und Astrozyten an Rezeptoren in Transzytose durch die endotheliale Zellschicht beteiligt studieren. Astrozyten wurden durch mechanische Präparation folgenden Trypsinverdau isoliert und für die spätere Co-Kultur eingefroren. RBEC wurden von fünf Wochen alten Ratte Kortex isoliert. Die Gehirne wurden von Hirnhaut und der weißen Substanz gereinigt und folgende enzymatische Verdauung mechanisch dissoziiert. Danach wurde das Gewebe-Homogenat in Rinderserumalbumin zentrifugiert, um Bruchstücke von Gefäßnervengewebe zu trennen. Die Gefäßfragmente erfuhr eine zweite enzymatische Verdauung freien Endothelzellen aus ihren extrazellulären Matrix. Die restlichen kontaminierenden Zellen wie Perizyten wurden feitere durch Ausplattieren der Mikrogefäßfragmente in Puromycin-haltigem Medium eliminiert. Sie wurden dann auf Filter für Co-Kultur mit Astrozyten am Boden der Vertiefungen gezüchtet agiert. RBEC ausgedrückt hohe Tight Junction (TJ) Proteine ​​wie Occludin, Claudin-5 und ZO-1 mit einem typischen Lokalisation an den Zellgrenzen hinweg. Die transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) von Hirn endothelialen Monoschichten, was die Dichtheit der TJs erreicht 300 Ohm · cm 2 im Durchschnitt. Die Endothelzellen Permeabilitätskoeffizienten (Pe) für Lucifer Yellow (LY) war in hohem Maße reproduzierbar mit einem Durchschnitt von 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Gehirn-Endothelzellen in Monoschichten organisiert ausgedrückt Effluxtransporters P-Glykoprotein (P-gp), zeigte einen polarisierten Transport von Rhodamin 123, einem Liganden für P-gp und zeigten spezifische Transport von Transferrin-Cy3 und DiILDL durch die endotheliale Zellschicht. Abschließend bieten wir ein Protokoll für die Einrichtung eines in-vitro-BBB-Modell, das in hohem Maße reproduzierbar durch die Methoden der Qualitätssicherung ist, und das ist für die Forschung auf BBB Transporter und Rezeptoren.

Introduction

Viele Medikamente entwickelt, um das Zentrale Nervensystem (ZNS) zu behandeln Erkrankungen sind nicht imstande, die Hirnparenchym in therapeutisch relevanten Konzentrationen zu erreichen. Die BBB schützt Gehirn Nervengewebe, die durch Schwankungen der Plasma-Zusammensetzung, das aus Krankheitserregern, und unterhält Homöostase des Hirnparenchym durch die Einschränkung nicht-spezifischen Ionenfluss, Peptide, Proteine ​​und sogar Zellen in und aus dem Gehirn ein.

BBB Eigenschaften durch intime Nähe und Übersprechen zwischen den spezialisierte Klasse Hirnkapillarendothelzellen und benachbarte Elemente der Neuro Glia-Kreiseinheit (NGVU) wie Neuronen induziert und aufrechterhalten wird, Gliazellen (Astrozyten genauer Endfüßchen) und Perizyten umhüllt in der Basalmembran, die hauptsächlich aus Kollagen Typ IV, Fibronectin, Laminin und Proteoglykane 2,3 besteht. Perizyten decken etwa 22 - 32% des Endothels an der Kapillare Ebene und spielen eine wichtigeRolle bei der Regulation der Proliferation Endothel, Angiogenese-und Entzündungsprozessen. Endothelzellen bilden eine kontinuierliche Bahn für die innere Oberfläche der Kapillaren. Sie werden von TJs, das eine bandartige Struktur an der apikalen Bereich bilden und dazu beitragen, dass Polarisierungszelle verbunden. Astrozyten regulieren BBB Eigenschaften und sind Quellen von wichtigen Regulationsfaktoren wie TGF-β, GDNF, bFGF und IL-6. Astrozyten in GFAP mit unvollständiger Funktionalität mangelhaft sind nicht in der Lage, um BBB-Eigenschaften 4 zu regeln. Neuronen nicht direkt strukturell in der Bildung der BBB beteiligt, sondern auch regulieren wichtige Aspekte der Proteinexpression und BBB Funktionen 5.

Um die Struktur, Physiologie und Pathologie des BBB weiter untersuchen, wurden in vitro-Modelle der Blut-Hirn als Forschungswerkzeuge entwickelt. Gehirn-Endothelzellen wurden aus verschiedenen Spezies extrahiert wurden, in vitro-Modelle zu implementieren BBB basierendauf niedrigen Gang Primärkulturen aus Rinder 6,7, Schweine 8,9, 10,11,12 Ratte, Maus 13 und auch menschliche 14,15. Diese Modelle sind bekannt, die in vivo BBB nachahmen insbesondere wenn co-kultiviert mit Glia-Zellen aus Ratten-oder Maus-und / oder Perizyten 16,12, und / oder neuronalen Vorläuferzellen stamm 17 Astrozyten und / oder Neuronen 18. Die "im Labor"-Modelle sind oft von Nagetieren hergestellt, weil sie in vitro / in vivo-Experimenten und-Vergleiche und / oder der Untersuchung von Hirnendothelzellen aus transgenen Modellen 19 erzeugt.

Neu in vitro BBB-Modelle entwickelt wurden auch entwickelt, um vorherzusagen Aufnahme in das Gehirn von möglichen ZNS-Wirkstoffkandidaten vor der in-vivo-Tests 15,20,21,3,6,22,11,23. In vitro BBB-Modelle sind in der Regel verwendet, um zu vergleichen der Transport von Medikamenten mit: i) bekannt Eindringen in das ZNS oder mit low Durchlässigkeit über die BBB und keine zentralen Wirkungen, und ii) die scheinbare Pe der gleichen Medikamente in Tiermodellen der gleichen Spezies gemessen. Die Drogen, die leicht passieren die BBB sind meist lipophilen und überqueren die Gehirn endothelialen Zellmembranen durch Lipid-vermittelte freie Diffusion (Koffein, Carbamazepin, etc.). Die negativ transportiert Medikamente wie Digoxin, Verapamil oder Cyclosporin A aktiv durch Hirnendothelzellen Effluxtransporter wie P-gp extrudiert. Viele der neu entwickelten therapeutischen Moleküle sind jedoch Biopharmazeutika, wie rekombinante Proteine, monoklonale Antikörper oder siRNAs. Die meisten von ihnen die BBB nicht kreuzen durch: i) Fehlen spezifische Transporter, und ii) die dicht gepackten Schicht von Endothelzellen, die hochmolekulare Moleküle aus unterziehen parazellulären Durchgang zu verhindern. Mit dieser Grenzen, "Trojanische Pferd" Strategien wurden unter Verwendung von Vektoren (Antikörper, Peptide) gegen bekannte Rezeptoren an der BBB, beteiligt i implementiertn-Rezeptor-vermittelten Transport oder Transzytose (RMT), wie die Transferrin (Tf)-Rezeptors (TfR), der Insulin-Rezeptor (IR) oder Mitglieder der LDL-Rezeptor (LDLR)-Rezeptorfamilie verwandt (LDLR, LRP1). Solche Rezeptoren wurden auf isolierte Gehirn Kapillaren und in der BBB wurden in vivo 24,25 gefunden. Transkriptionsprofile für diese Rezeptoren, insbesondere diejenigen der Familie LDLR wurden analysiert und verglichen zwischen Endothelzellen des Gehirns und Gehirn-Endothelzellen kokultiviert mit Astrozyten im Gehirn oder Kapillaren unmittelbar nach ihrer Extraktion aus Gehirn 26. Pardridge 24 geöffnet, das Feld mit dem OX-26 Antikörper gegen den Transferrinrezeptor (TfR), gefolgt von Antikörper gegen den Insulinrezeptor und den Insulin-Wachstumsfaktor-Rezeptor 27,28. Mit diesen Antikörper basierte Vektoren, hat ArmaGen Technologies einen BBB molekularen Trojaner-Plattform-Technologie über die BBB 29 entwickelt, um Medikamente zu liefern, einschließlich Proteinen. DieLiteratur ist reich an Daten, die LRP1-Expression in Endothelzellen des Gehirns und seiner Rolle als leistungsfähiges endozytischen / Scavenger-Rezeptor. Western-Blot-Analyse ergab, dass LRP1 wird in Fraktionen in Hirnkapillaren angereichert und im Rattenhirn-Kapillarendothelzellen 30 ausgedrückt. Unternehmen wie Angiochem Ziel LRP1 mit von Aprotinin abgeleitetes Peptid-Vektoren, die effiziente Wirkstoff Zustrom über die BBB 31 zu fördern. Allerdings ist auch in LRP1 aktiven Transport von Aß und seine Auslauf / Abstand von Hirnparenchym, um den Blut 32 beteiligt. Solche Daten beinhalten LRP1 in einem bidirektionalen Transport über die BBB in Abhängigkeit von seiner Liganden. biOasis entwickelt die Transcend Technik unter Verwendung eines Proteins Melanotransferrin für den Transport von biologischen wie lysosomalen Enzymen und Antikörpern durch die BHS 33 während VECT-HORUS entwickelt Peptidvektoren, die LDLR 34 zielen. Es werden Daten darauf hindeutet, dass die LRP und LDL-Rezeptor kann zum Unterschied zu transportierenerent Moleküle wie lysosomale Enzyme 35,36 oder Nanopartikel-Komplexen über die BBB 37.

Unsere Interessengebiet ist Arzneimittelabgabe an das ZNS mit Vektormolekülen und vektorisiert Drogenkandidaten für die Behandlung von ZNS-Erkrankungen. Insbesondere weist Arzneimittelabgabe über die BBB in den Kontext der Neuroentzündung, ein Prozess, in dessen Umfang variieren kann berücksichtigt werden, aber das ist wahrscheinlich für alle ZNS-Läsionen und Erkrankungen wie Enzephalitis, multipler Sklerose, Alzheimer-Krankheit usw. Neuroinflammation ist mit BBB-Entzündung und möglicherweise mit Veränderungen in Physiologie und Durchlässigkeit BBB bedenkt, dass parazellulären und transzellulären Transport in pathologischen Bedingungen 38,39,40,41,42,43 verstärkt werden verbunden. Zum Beispiel TNF-α, TWEAK und andere Cytokine modulieren Entzündung und Experimenten mit in vitro BBB Modelle haben gezeigt, dass sie den parazellulären Eigenschaften th zu veränderne endotheliale Zellschicht 38,39,40 und TNF-α führt auch zu einem Anstieg der transzellulären Transport von LDL 41, Holotransferrin 42 und 43 Lactoferrin.

Unser Ziel war die Entwicklung und Charakterisierung ein optimiertes und hoch reproduzierbare Ratte syngenen BBB-Modell mit Co-Kulturen von primären Gehirn Endothelzellen und Astrozyten. Wir haben 5 Wochen alt und neonatalen Wistar-Ratten für Gehirn-Endothelzellen-Produktion und Astrozyten-Produktion auf. Eine Herausforderung war es, ein Protokoll, das die Produktion von "Wochen reproduzierbar" BBB-Modelle zu etablieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde jeder Schritt der Produktion Protokoll an festen Tagen in der Woche durchgeführt, ausgehend vom Gehirn Mikrogefäß Produktion am Mittwoch der ersten Woche. Dissektionen wurden fast jede Woche in den letzten 3 Jahren durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit der Kulturen weiter zu verbessern, wurde ein Qualitätssicherungssystem etabliert. Alle Reagents und Chemikalien wurden in einer Datenbank (Datum der Eintragung, Lager, Verfalldatum, etc.) verwiesen.

Das Modell wurde nach einer Reihe von Kriterien, wie Endothelzellen Organisation und Reinheit aus, TEER, LY Durchlässigkeit, Reaktion auf pro-inflammatorische Mittel, qualitative und quantitative Ausdruck der TJ-Proteine, die Funktionalität von Efflux-Transporter wie P-gp, und Rezeptoren in Transzytose durch die endotheliale Zellschicht, wie die TfR oder LDL-Rezeptor beteiligt.

Protocol

1. Herstellung von Ratten Astrozyten

Für jedes Präparat verwenden 10 Neugeborenen Wistar-Ratten beiderlei Geschlechts.

  1. Opfere die Ratten durch Schneidköpfe mit einer Schere und sofort übertragen sie in einem trockenen Petrischale unter einer Sterilbank. Entfernen Sie die Gehirn aus dem Schädel, ohne das Kleinhirn und sofort übertragen sie in eine Petrischale mit kaltem Dissektion Puffer: HBSS ergänzt mit 1% Rinderserumalbumin (niedrige Endotoxin-BSA), Penicillin 100 Einheiten / ml und Streptomycin 100 ug / ml.
  2. Schneiden Sie die Gehirne in der Hälfte, die zwei Gehirnhälften zu trennen und sie in eine saubere Petrischale mit Dissektion Puffer auf Eis. Schneiden Sie den Sehnerv und entfernen Sie die Hirnhaut unter einem Stereomikroskop.
  3. Ausführlich in 50 ml kaltem Dissektion Puffer waschen Rindenstücke.
  4. Legen Sie die kortikale Stücke aus drei Gehirne in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen und distanzieren sich ausdrücklich von Auf-und Abpipettieren einem Staatsstreichle Mal mit einer 10 ml Einmalpipette mit blauer Spitze ausgestattet in 6 ml 0,05% Trypsin - 0,02% EDTA für 5 min bei 37 ° C.
  5. Hinzufügen von 24 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS und die Antibiotika Penicillin 100 Einheiten / ml Streptomycin und 100 &mgr; g / ml, eine Medien genannt glialen Zellmedien (GCM) und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei RT. FBS Chargen wurden ausgewählt und für das Wachstum und Überleben von Astrozyten cutures validiert.
  6. Das Pellet, das die dissoziierten Zellen in 10 ml GCM und Platte in eine 75 cm 2-T-Kolben (T75). Ändern Sie das Medium am nächsten Tag, um die Zelltrümmer und DNA zu entfernen. Ersetzen Sie den Kulturmedien zweimal pro Woche.
  7. Nach 1 Woche Proliferation, schütteln die Gliazellen mit einem Orbitalschüttler bei 60 Upm während 24 Stunden bei 37 ° C in GCM. Wenn die T75 nicht in einem Inkubator mit 5% CO 2/95% Luft bei 37 ° C befeuchteten Atmosphäre platziert werden, ergänzen das Medium mit 5 mM HEPES. Waschen Sie die Zellen zweimal remove das nicht haftende Mikrogliazellen.
  8. Drei Wochen nach der Aussaat, wasche die Zellen zweimal mit DPBS ohne Calcium und Magnesium. In 3 ml warmem Trypsin-EDTA 0,05% 0,02%, bei 37 ° C und warten, bis die Zellschicht verteilt ist (in der Regel 5 min). Hemmen Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 10 ml GCM, übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen und-Zentrifuge bei 120 g für 8 min.
  9. Resuspendieren Sie das Pellet in Astrozyten 90% FBS - 10% DMSO, übertragen sie in Kryoröhrchen (2 x 10 6 Zellen pro Kryoröhrchen) und lagern in flüssigem Stickstoff.

2. Isolierung von Rattenhirn-Mikrogefäße

Unsere experimentellen Verfahren werden von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Marseille zugelassen und entsprechen den nationalen und europäischen Bestimmungen (EU-Richtlinie Nr. 86/609). Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und reduzieren die Anzahl der verwendeten Tiere.

  1. Für jede Zubereitung und für eine experimenter, verwenden Sie 3 5 Wochen alten Wistar-Ratten.
  2. Montag der ersten Woche, bereiten zwei T75-Flaschen durch Beschichtung mit Kollagen Typ IV und Fibronektin, sowohl bei 1 ug / cm 2 in sterilen Kultur Wasser (10 ml pro T75). Erlauben, bei 37 ° C bis microvessel Aussaat haften.
  3. Mittwochmorgen von der ersten Woche einschläfern die Ratten unter einer zunehmenden Fluss von CO 2 zu Schläfrigkeit führen, Verlust von Körperhaltung und Atemunterbrechung, dann durch einen Genickbruch folgte. Sprühen die Köpfe mit 70% Ethanol. Schneiden Sie die Köpfe mit einer Schere und übertragen Sie sie in eine trockene Petrischale unter einer Sterilbank.
  4. Entfernen Sie die Gehirn aus dem Schädel, ohne das Kleinhirn und die Sehnerven, übertragen sie dann in eine Petrischale auf Eis gekühlt und mit kaltem Dissektion Puffer gefüllt (HBSS ergänzt mit 1% BSA, Penicillin 100 Einheiten / ml und Streptomycin 100 ug / ml) .
  5. Schneiden Sie die Gehirne in Hälfte 2, um die Gehirnhälften und separate Mittelhirn aus für trennenebrain. Übertragen Sie die Vorderhirn in eine saubere Petrischale auf Eis mit Dissektion Puffer.
  6. Nehmen Sie ein paar Halbkugeln in eine neue Petrischale mit kaltem Dissektion Puffer, um vorsichtig die Hirnhäute von den Vorderhirn unter einem Stereomikroskop mit N ° 5 gebogenen Pinzette. Dann reinigen Sie das Innere des Gehirns, um die Bettdecke von Myelin zu entfernen und eine Schale aus Kortex. Diese Schritte sollten nicht mehr als 2 Stunden für die Gewebeerhaltung und Überleben der Zelle.
  7. Distanzieren die Rinde von 3 Gehirne in 6 ml kaltem Dissektion Puffer in einem 7 ml Dounce Homogenisator um 10 nach oben und unten Schläge mit jeweils 2 Stößel von verschiedenen Freigaben, um 71, gefolgt von 20 um.
  8. Teilen die Suspension, um das Äquivalent von 1 Kortex in 1 ml einer 50 ml-Falcon-Röhrchen und Zentrifugieren bei 1.000 xg für 5 Minuten bei RT zu erhalten. Überstand verwerfen.
  9. Verdauen die Suspension aus 1 Kortex mit 1 ml einer Enzymlösung, die eine Mischung aus Collage / Dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), DNase Typ I (35 ug / ml - 20 K-Einheiten / ml) und Gentamicin (50 ug / ml) in einem Schüttler für 30 min bei 37 ° C.
  10. Mischen Sie die 1 ml von 1 Kortex verdauen mit 10 ml 25% BSA / HBSS 1X und separate durch dichteabhängige Zentrifugation bei 3.600 g für 15 min bei RT. Die obere Scheibe (Myelin und Hirnparenchym) und der Überstand vorsichtig in ein sauberes 50 ml Falcon-Röhrchen übertragen und wiederholen Sie den Zentrifugieren. Halten Sie das resultierende Pellet, das die Gehirnmikrogefäßen bei 4 ° C.
  11. Vorsichtig verwerfen die obere Scheibe und den Überstand. Resuspendieren beide resultierenden Pellets, die die Gehirnmikrogefäßen mit 1 ml kaltem HBSS 1X und übertragen in einen sauberen 50-ml-Falcon-Röhrchen.
  12. Waschen der Mikrogefäße durch Zugabe von 20 ml kaltem HBSS 1X und Zentrifuge bei 1000 × g für 5 min. Überstand verwerfen.
  13. Weitere verdauen die Mikrogefäße von 1 Kortex mit 1 ml des gleichen Enzymlösung, wie in Schritt 2.9 während 1 h bei 37 ° C in einem SH beschriebenAker.
  14. Dann mischen Sie die verdaut Mikrogefäßen aus jeder der drei Kortex in eine Röhre und weiter in zwei 50 ml Falcon-Röhrchen zu trennen, um Mikrogefäße aus dem Gegenwert von einem und einem halben (1,5) pro Röhrchen extrahiert Kortex erhalten. 30 ml kaltem Dissektion Puffer und Zentrifugieren bei 1.000 xg für 5 Minuten bei RT.
  15. Resuspendieren der Mikrogefäß Pellet in 10 ml DMEM/F12 mit 20% Rinderplättchenarmes Plasma abgeleiteten Serum, basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 2 ng / ml), Heparin (100 ug / ml), Gentamicin (50 ug / ml) ergänzt, und HEPES (2,5 mM), genannt endothelialen Zellmedien (ECM) mit Puromycin ergänzt war, bei 4 ug / ml.
  16. Nehmen Sie die 2 beschichtet T75-Flaschen aus dem Brutschrank, saugen das überschüssige Beschichtung und Platte die Mikrogefäße aus jedem Röhrchen in einer T75-Flasche (Mikrogefäßen von 1,5 Kortex pro T75-Flasche entnommen).

3. Reinigung und Proliferation von RBEC Primocultures

  1. Reinigung: Mittwoch bis Freitag, fügen puromycin bei 4 ug / ml zum Kulturmedium. Ändern Sie das Medium am Donnerstag. Am Freitag, waschen Sie die Zellen und fügen Puromycin bei 2 pg / ml bis Montag.
  2. Proliferation: Am Montag der zweiten Woche, waschen Sie die Zellen, und fügen Sie Insulin, Transferrin und Natriumselenit Ergänzung zu den Kulturmedien, bis die Kulturen bis zu 90% Konfluenz am Mittwoch der zweiten Woche.

. 4 Differenzierung: Einrichten der In-vitro-Modell BBB

  1. Montag der zweiten Woche, Filter (Polyethylen, 12 Brunnen, Porengröße 1,0 um) vorzubereiten durch Beschichtung mit einer Mischung aus Kollagen Typ IV und Fibronektin sowohl auf 0.5μg/cm 2 in sterilen Kultur Wasser (500 ul der Mischung in der oberen Kammer und 1,5 ml sterile Kultur Wasser in der unteren Kammer). Erlauben, bei 37 ° C bis RBEC Aussaat haften.
  2. Montag der zweiten Woche, fünf Tage vor der Gründung der Co-Kultur-tauen Sie die Astrozyten aus Kryoröhrchen bei 37 ° C und Transferin einem 15 ml Falcon mit 10 ml GCM. Zentrifugieren der Suspension bei 120 · g für 8 min bei RT.
  3. Resuspendieren des Pellets in Astrozyten GCM und Platte bei einer Dichte von 30 x 10 3 Zellen pro cm 2 in 12-Well-Platten.
  4. Mittwoch der zweiten Woche, kurz vor Dissoziation RBEC mit Trypsin, waschen zweimal die Pre-beschichtete Filter mit DMEM/F12-Medium. Pre-füllen die Kammern mit ECM: 1,5 ml in der unteren Kammer und 0,5 ml im oberen Fach.
  5. Mittwoch der zweiten Woche, waschen doppelt so RBEC mit DPBS ohne Calcium und Magnesium. 4 ml warmem Trypsin 0,05% - 0,02% EDTA-Lösung bei 37 ° C pro T75-Flasche während 30 Sekunden genau. Dann entfernen Sie 3,5 ml Trypsin-Lösung und beobachten unter dem Mikroskop. Wenn die Zellschicht beginnt, sich von der Matrix zu trennen, damit sie durch leichtes Antippen der Kante des T75-Kolben, bis alle Zellen schwimmen.
  6. In 9 ml ECM pro T75-Flasche und Überführung in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen. Sehr sanft distanzieren die ZelleSuspension durch Auf-und Abpipettieren 4 mal mit einer 10 ml Pipette mit einer gelben Spitze ausgestattet (vermeiden Sie die Produktion von Luftblasen in der Lösung). Zählen der Zellen in der Suspension (etwa 3 x 10 6 cells/T75) und unmittelbar auf der Platte vorbeschichtet und Fertig Filter mit hoher Dichte (160 x 10 3 Zellen / Filter somit etwa 18 filters/T75) (Abbildung 8 ). Am folgenden Tag (Donnerstag), ändern zweimal das Medium der oberen Kammer, um die Zelltrümmer zu entfernen.
  7. Donnerstag der zweiten Woche, dem Tag vor der Gründung der Co-Kultur, ersetzen Sie die Astrozyten Kulturmedien von 1,5 ml Differenzierungsmedien (ECM mit Hydrocortison bei 500 nM), die mit 1/3 konditionierten Medium von der basalen Fach ergänzt werden einer früheren Co-Kultur (3 Tage des Kontakts zwischen Endothelzellen und Astrozyten).
  8. Freitag der zweiten Woche als Tag 0 der Differenzierung definiert; ersetzen Sie den Kulturmedien aus dem Filter containing der RBEC Differenzierung mit Medien. Übertragen Sie die RBEC Filter in die Vertiefungen, die die Astrozyten. Unter diesen Bedingungen in vitro-Modelle unterscheiden und Express-Übergang-verwandten Proteinen innerhalb von 3 Tagen.
  9. Die Modelle halten ihre optimale Differenzierung während der drei Tage, zwischen Montag und Mittwoch der dritten Woche.

Representative Results

Produktion Protokoll
(A) Reinigung von Endothelzellen von den Mikrogefäßen, (b) Proliferation, und (c) Differenzierung Filter (12-Well-Platten aus Polyethylen mit einer Porosität von: Das Protokoll kann in 3 Phasen entsprechend große Veränderungen in Kulturmedien Zusammensetzung aufgeteilt 1 um) in Co-Kultur mit Astrozyten. Die verschiedenen Schritte des Herstellungsprotokoll wurden zu bestimmten Tagen der Woche, um die Reproduzierbarkeit der primären Zellkulturen (Abbildung 1) zu erhöhen zugewiesen. Am Mittwoch der ersten Woche, also 9 Tage vor der Gründung der Co-Kultursystem wurden die Mikrogefäßen isoliert (Abbildung 2A). Endothelzellen zu reinigen, wurden die Kulturen in Anwesenheit von abnehmenden Konzentrationen von Puromycin für 5 Tage gehalten. Die meisten kontaminierenden Zellen (hauptsächlich Perizyten) eliminiert und das Wachstum von Endothelzellen langsamer ohne Änderung ihres Phänotyps. Spindel-shaped Zellen wachsen aus der Kapillare Fragmente aus Rattenhirn grauen Substanz (2B) isoliert. Am Montag der zweiten Woche wurden die Ratten-Astrozyten auf der Unterseite der Platten mit 12 Vertiefungen plattiert. Mittwoch, RBEC wurden der Lumenraum der Filter aufgenommen. Hochdichte Aussaat bei 160 x 10 3 Zellen / cm 2 (Fig. 2C) trägt, um Lücken in der Peripherie des Filters (Fig. 2D) zu vermeiden, und erzeugt eine homogene Differenzierung der endothelialen Zellschicht. Die Zellen zeigen den typischen langgestreckten spindelförmige Morphologie, richten sich in Längsrichtung und bilden eine gleichmäßige Monoschicht. Donnerstag, Astrozyten Kulturmedium wurde für die Differenzierungsmedium mit dem bisherigen Co-Kultur-Medien (2E) Anlage geändert. Freitag, RBEC auf Filter wurden in Kulturmedium, enthaltend 500 nM Hydrocortison gezüchtet und die Filter wurden auf 12-Well-Platten mit den Astrozyten übertragen. Auf der dritten Woche Experimente were zwischen Montag und Mittwoch durchgeführt.

RBEC Charakterisierung und Bestimmung der Elemente von Einzelschicht Durchlässigkeit
Die RBEC wurden durch Immunfärbung von Endothelzellen und BBB Marker sowie durch Messungen des TEER, Permeabilität LY und Funktionalität Effluxtransporter wie P-gp ist.

RBEC von Puromycin Reinigungsverfahren erhalten (Abbildung 1 und 2) stieg in nicht überlappenden Endlosmonoschichten, die Wachstumshemmung bei Konfluenz zeigten und angezeigt fest angelagert, spindelförmig, spindelförmige Morphologie. RBEC Kulturen ausgedrückt typische Marker für Endothelzellen, sie zeigten eine positive Immunfärbung für Thrombozyten endothelial cell adhesion molecule (3A; CD31/PECAM) und die Expression von von-Willebrand-Faktor (Fig. 3B). Ohne Puromycin-Behandlung werden RBECs schnell von Perizyten von Desmin immunos erkannt fallenTaining (3C). Gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) von Astrozyten (Figur 3D) ausgedrückt ist eine wichtige Differenzierungsmarker von Astrozyten. Mit hoher Passagenzahl, Astrozyten verlieren ihre Fähigkeit, die Differenzierung der Endothelzellen zu induzieren. Aus diesem Grund wurden die Astrozyten-Kulturen für ihre Zeit des Kultur standardisiert und nur einem Durchgang unterzogen.

Kultivierung RBEC mit Medien mit Hydrocortison ergänzt, gefolgt von Co-Kultur mit Astrozyten und mit konditioniertem Medium aus dem unteren Fach des früheren Co-Kulturen führte zu einem starken Induktion von interendothelialen TJs im Vergleich zu allein RBEC kultiviert. Die Zellen exprimiert claudin-5, ZO-1 und Occludin-Proteine, die an der Zell-Zell-Übergänge lokalisiert wurden, wie durch Immunfluoreszenz (4B-D) gezeigt, und durch Western-Blot-Analyse für ZO-1 und Occludin-Proteine ​​(Fig. 4E ergab ). Die morphologische Verteilung bei cell-Zell-Kontakte in einer reißverschlussartigen Konfiguration zeigt (a) die Dichtheit der Monoschicht, (b) die Herkunft der zerebralen Endothelzellen und (c) ist charakteristisch für hochdifferenzierten zerebralen Endothelzellen. Parazelluläre Permeabilität der endothelialen Schicht wurde durch Messen des TEER und die Rate der Zustrom von LY (457 Da) von der oberen zu der unteren Kammer des Filters überwacht. TEER wurde mit einem ENDOHM-12 für 12-mm-Kulturbecher zu einer EVOM voltohmmeter verbunden gemessen. Die TEER von Gehirn endothelialen Monoschichten, die die Dichtheit erreicht TJs 300 Ohm · cm 2 im Durchschnitt (Filter von 12-Well-Platten, Daten nicht gezeigt). Die Pe für LY (Pe (LY), als Integritätskontrolle der Sperre und mit getesteten Verbindungen co-inkubiert verwendet) erreichte einen Durchschnitt von 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min (4F) über einen Zeitraum von 1 Jahr.

Um eine Entzündung der RBEC induzieren wir die pro-inflammatorische Cytokin TNF-α bei 5 ng / ml für 24 h und anschließend die entzündliche Reaktion durch Messen CCL2 (MCP-1)-Sekretion durch RBEC in der oberen Kammer des Kultursystems, die von 120 ng / ml (nicht verdoppelten handelten Kontrolle) auf 250 ng / ml (Fig. 5A). TNF-α-Behandlung bei 5 ng / ml oder 50 ng / ml für 24 Stunden geöffnet, auch die BHS durch Pe (LY) Messung (5B) offenbart.

P-gp in differenzierten RBEC durch Immunzytochemie (Fig. 6A) visualisiert. P-gp Lokalisierung bekannt ist stark polarisiert ist und im wesentlichen in der apikalen Membran der Endothelzellen 44 ausgedrückt, während die Glutamat-Transporter-1 (GLT-1) wird hauptsächlich in der basolateralen Fraktion 45 gefunden. Um das Ausmaß der Polarisierung der kultivierten RBEC bewerten, wurden apikalen und basolateralen Plasmamembran-Proteine ​​von Zubereitungen mit Saccharose-Dichtegradienten getrennt Gradienten 46. Western-Blot-Analyse wardurchgeführt, um Expression von P-gp und GLT-1 in Plasma, apikale und basale Membranpräparationen zu beurteilen. Mikrogefäßen frisch aus Rattenhirn extrahiert wurden als positive Kontrollen am nächsten zu der in vivo-Verteilung dieser Proteine ​​(6B) verwendet. In beiden Mikrogefäßen und differenzierte RBEC Membranzubereitungen, wurde P-gp als eine Bande von 170 kDa exprimiert, hauptsächlich in der F1 apikalen Membranfraktion (6B, C) ​​lokalisiert. GLT-1-Expression wurde in der Tat in der F3 basalen Membranfraktion von Mikrogefäßen als eine Bande von 65-70 kDa exprimiert, aber nicht in der Kultur RBEC detektiert.

In parallelen Experimenten wurde die funktionelle Aktivität von P-gp in der endothelialen Zellschicht mit Rhodamin 123 (R123) als Liganden getestet. Die abluminalen bis (A B) Efflux von R123 luminalen war 1,7 mal höher als in der entgegengesetzten Richtung (Fig. 6D). Um P-gp-Engagement zu beweisen, haben wir spezifische P-gp-Inhibitoren, verapamil (25 uM, 30 min Vorinkubation) und Cyclosporin A (1 uM, 30 min Vorinkubation). Mit Verapamil und Cyclosporin-Behandlung wurde R123-Akkumulation in RBEC 1,6 fach und 2-fach erhöht, verglichen mit unbehandelten Kontroll (6E).

Rezeptoren in Rezeptor-vermittelten Transzytose (RMT) Mechanismen beteiligt
Das Modell wurde für die Expression von verschiedenen Rezeptoren möglicherweise in Transzytose Mechanismen auf BBB, wie die LRP1, LDLR oder TfR (7A) beteiligt ist.

Funktionelle Transportstudien wurden mit den Liganden für TfR und LDLR durchgeführt. Leben RBEC wurden mit Ratten-Transferrin mit Cy3 (Tf-Cy3) für 180 min bei 37 ° C (7B, C) ​​inkubiert,. Quantifizierung der Tf-Cy3 Aufnahme und der Transport in der Ratte in vitro BBB Modell zeigte, dass die Steigung der Kurven etwas über 2.400 picomol verringerts (7B), was darauf hindeutet, dass die Bindung / Aufnahme war Sättigungs. Darüber hinaus wurde die Sättigung der Bindung / Aufnahme mit der Anhäufung von Tf in der unteren Kammer korreliert. Um diese Beobachtung zu bestätigen, wurde Tf-Cy3 bei 1200 Picomol (aufsteigende Teil der Kurve) mit einem Überschuss an nicht-fluoreszierende Tf bei 4.800 Picomol (Plateau / Sättigung) (7C) inkubiert. Diese Experimente zeigten eine Abnahme von Tf-Cy3 Akkumulation in der unteren Kammer und eine Sättigungsmechanismus typischen Ligand-Rezeptor-Interaktion in unserem in vitro Modell BBB bestätigt.

Ähnlich wurde LDLR-Funktionalität durch die Aufnahme und den Transport von seinem Liganden DiILDL durch die endotheliale Zellschicht (7D, E) demonstriert. Live RBEC wurden mit DiILDL für 30 min bei 37 ° C inkubiert, Die Bindung / Aufnahme wurde nicht mit der Akkumulation von DiILDL in der unteren Kammer (7D) korreliert. Quantifizierung der diilDL Transport zeigten, dass die Steigung der Kurven verringert darüber hinaus 2 ug, was darauf hindeutet, dass der Verkehr war und zeigt Sättigungs in unserem Modell Rezeptor bezogen. Natriumazid 0,05% 15 min vor DiILDL Inkubation (Fig. 7E) zugegeben. Das Fehlen von Toxizität von Natriumazid Inkubation bei 0,05% wurde von Pe (LY) Messung (Daten nicht gezeigt) beurteilt. Diese Experimente zeigten, verringert DiILDL Ansammlung in der unteren Kammer. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse RMT für DiILDL in unserem in vitro BBB-Modell.

Weitere In-vitro-Modelle basierend auf BBB Endothelzellen aus Rattenrückenmark oder Gehirn-Maus
Enzymatische Verdauung mit einer Mischung aus Collage / Dispase ist einer der wichtigsten Parameter, die in Bezug auf die Zelllebensfähigkeit und die Produktionsausbeute der zerebralen Mikrogefäßen zu steuern. Die Konzentration des Enzyms und wichtiger das Verhältnis zwischen der Menge des Enzyms in Bezug auf Gewebe, nEEDs genau zwischen Ratten-Gehirn, Rückenmark der Ratte und Maus Gehirn kalibriert werden. Mikrogefäßaussaatdichte und Anzahl der Endothelzellen zu 90% Konfluenz (9 Tage nach der Aussaat Mikrogefäß) erreichen verbunden waren und sind wichtige Parameter, um das Zellwachstum zu verbessern, die Zahl der Bevölkerung verdoppelt und die Qualität der Modelle zu begrenzen. Ratten-Rückenmark-Mikrogefäße wurden mit dem gleichen Protokoll wie die hierin für Rattenhirn-Mikrogefße beschrieben, hergestellt (hinsichtlich der Gewebemenge, 2 Rückenmark, die ungefähr 1 Gehirn), um die gleiche Menge an Zellen pro T75-Kolben in der gleichen Zeitskala zu erhalten . Hirnhäute von 5 Wochen alten Mäusen C57Bl6 Gehirn waren schwer zu beseitigen, weil sie die Rinde haften. Eine kurze Behandlung des Gehirns mit Dispase wird, um die Entfernung der Hirnhaut zu erleichtern. Die wichtigen Parameter, die für die Herstellung von reproduzierbaren endothelialen Zellmonoschichten aus Rattenhirn, Rattenrückenmark und Gehirn der Maus beitragen, werden markiert und in zusammenAbbildung 8.

Figur 1
Abbildung 1. Fluss Übersicht über die wichtigsten Schritte der In-vitro-Modell BBB Vorbereitung. Die verschiedenen Schritte des Herstellungsprotokoll wurden zu bestimmten Tagen der Woche, um die Reproduzierbarkeit der primären endothelialen Zellkulturen erhöhen zugewiesen. Das Protokoll beginnt am Mittwoch der ersten Woche mit Mikrogefäß Produktion von 5 Wochen alten Wistar-Ratten.

Figur 2
2. Phasenkontrast-Mikrophotographien von RBEC, Astrozyten und dem Co-Kultursystem. (A) 5 Wochen alte Wistar-Ratte Mikrogefäßfragmenten bei der Ausplattieren.(B) drei Tage alten Kulturen RBEC für 2 Tage mit dem P-gp-Substrat Puromycin bei 4 ug / ml behandelt. (C) Reines konfluenten endothelialen Monoschichten an Tag 1 nach der Beschichtung auf den Millipore-Filter einer 12-Well-Platte mit Kollagen Typ beschichtet IV und Fibronektin. (D) Die Homogenität der Zellmonoschicht an der Peripherie des Filtereinsatzes. (E) Konfluente Astrozyten Kultur am Tag der Errichtung der Co-Kultur, die dadurch Waben Morphologie. (F) Schema, das die Co-Kultur System mit Lokalisierung der Mikrophotographien in C, D und E.

Fig. 3
3. Charakterisierung RBEC Kulturen durch Immunfluoreszenzmikroskopie. (A) Gehirn-Endothelzellen exprimieren Endothelzellen ThrombozytenAdhäsionsmolekül PECAM/CD31 am Zellrahmen, (B) von-Willebrand-Faktor (vWF) ist ein relativ punktförmige Färbung, heller und in einigen Zellen aggregierten mehr als andere, und in der perinukleären Zone konzentriert. (C) ohne Puromycin-Behandlung RBEC Kulturen werden Perizyten mit einer positiven Immunfärbung für Desmin (grün) erkannt und haben charakteristische kleine runde Kerne. (D) Astrozyten exprimieren saure Gliafaserprotein (GFAP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 4
4. Immuncytochemische Charakterisierung der Ratte in vitro BBB Modell und der parazellulären PermeabilitätLY durch die endotheliale Monolayer. Die Zellschicht wurde mit (A) Vimentin immun einen konfluenten Monolayer Gehirn Endothelzellen mit nicht-überlappenden Morphologie und typische spindelförmige Zellen mit Endothel-Morphologie und die Expression von tight junction-Proteine ​​zeigen (B) Claudin-5 , (C) ZO-1 und (D) Occludin, auch durch Western-Blot für ZO-1 und Occludin Proteine ​​(E) nachgewiesen. (F) Monolayer Engegefühl in der 12-Well BBB-Modell wurde durch die Messung der Transport von Lucifer Yellow bewertet (LY-CH, Dilithiumsalz), ein kleines hydrophiles Molekül (Molekulargewicht 457 Da) bekannt, durch die BBB beibehalten werden. Kurz gesagt, LY in der oberen Kammer des Kultursystems in Kontakt mit zerebraler Endothelzellen für 60 min bei 37 ° C inkubiert, Nach dieser Zeit wurde das Medium von der unteren Kammer gesammelt und die Fluoreszenz wurde durch fluorimetrische Analyse mit einem spectrofluorimet quantifizierter mit einer Anregung bei 430 nm und Emission bei 535 nm. Die Ergebnisse sind in der Durchlässigkeit oder Pe in 10 -3 cm / min ausgedrückt. Die Barriere gilt als durchlässig oder offen, wenn der Pe LY ist vor 0.6x10 -3 cm / min. Während jedes 1 hr Experiment wurde die durchschnittliche bereinigten Volumens gegen die Zeit und die durch lineare Regressionsanalyse abgeschätzt Steigung aufgetragen. Die Steigung der Kurve für Steuerfreiheit Filter mit Kollagen Typ IV-Fibronektin-Beschichtung wurde PSf bezeichnet und die Steigung der Clearance-Kurve für Filter mit Gehirn endothelialen Zellmonoschichten wurde PSt bezeichnet. : Die PS-Wert für die endothelialen Monoschicht (PSE) wurde berechnet aus Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Gleichung 1

Die PSE-Werte wurden durch die Fläche des Abschnitts geteiltschiedenen Membran (1,1 cm 2 für Millipore-Filter von 12-Well-Platten), und das Ergebnis war die Durchlässigkeitskoeffizient (Pe) mit einem Mittelwert von 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Die Ergebnisse werden mit einer vertikalen Streudiagramm-Darstellung für n = 90 Tests (Mittelwert von n = 3 bis n = 6 Monoschichten pro Test) vorgestellt.

Figur 5
5. In vitro BBB Modellantwort auf die Behandlung mit den pro-inflammatorischen TNF-α Mittel. Das Kulturmedium aus dem Kultursystem wurde kurz vor TNF-α-Behandlung bei 5 ng / ml in der oberen Kammer 6 h, 12 h ausgetauscht und 24 Stunden. CCL2 Mitteilung von RBEC wurde in die obere Kammer von ELISA-Test im Vergleich zu nicht behandelten Kontroll quantifiziert. Beachten Sie, dass MCP-1-Spiegel zu erhöhen leicht, als eine Funktion der ZeitAuch in den nicht-behandelten Vertiefungen. Integrität der Endothelzellenbarriere durch endotheliale Pe für LY Pe (LY) gemessen zeigte einen Anstieg der Durchlässigkeit durch die Monoschicht 24 h Behandlung mit TNF-α bei 5 ng / ml oder 50 ng / ml im Bereich von 0,62 ± 0,02 x 10 - 3 cm / min und 0,7 ± 0,01 x 10 -3 cm / min, verglichen zur Kontrolle 0,33 ± 0,03 x 10 -3 cm / min (Student t-Test, p <0,05).

Fig. 6
6. Funktionalität des P-gp Effluxtransporters und RBEC Polarisation. Expression des Effluxtransporters P-gp in Hirnendothelzellen co-kultiviert mit Astrozyten durch Immunzytochemie (A) und Western Blot (B & C). Zellmembran-Proteine ​​wurden mit einem zellulären Protein Fraktionierung gewonnention Kit. Plasma-Membranen wurden durch hypotone Lyse und Differential Zentrifugierungen erhalten, um Organellen und Kerne entfernen. Trennung der apikalen und basolateralen Proteine ​​aus Plasmamembranen wurden durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation erhalten. P-gp wurde vor allem in den apikalen Fraktion (F1) lokalisiert, während Glutamat-Transporter-1 (GLT-1) wurde vor allem in der basolateralen Fraktion (F3) lokalisiert. Gereinigte Mikrogefäßen vor dem Plattieren wurden als Kontrolle für die in vivo-Lokalisierung dieser Proteine ​​verwendet. Aktivität von P-gp wurde durch Messen der Transport Polarität R123, einem P-gp-Liganden bestimmt. Der Fluß von 1 &mgr; M R123 wurde für 1 h bei 37 ° C in der luminalen zu abluminalen (A bis B) und in der entgegengesetzten abluminalen zu luminale (B A) Richtung gemessen. Der gleiche Versuch wurde ohne RBEC realisiert passive Diffusion über die eingesetzten Filter bewerten und die Daten wurden in Bezug auf diesen Wert für Pe (R123) Berechnung normalisiert (siehe 5 (R123) (A bis B) ausgedrückt. Verapamil (25 uM, 30 min Vorinkubation) und Cyclosporin A (1 uM, 30 min Vorinkubation) wurden als Referenz P-gp-Inhibitoren eingesetzt. R123-Akkumulation in RBEC wurde nach 2 h mit oder ohne Vorinkubation mit den P-gp-Inhibitoren (Student-t-Test, p <0,05) gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 7
Abbildung 7. Charakterisierung von Rezeptoren in Tra-Rezeptor vermittelt beteiligtnscytosis (RMT). (A) Die differenzierte RBEC Monoschicht wurde mit Antikörpern gegen die Dichte bezogen Lipoprotein-Rezeptor-1 niedrig (LRP1) und Low Density Lipoprotein-Rezeptor (LDLR) immungefärbt. Die konfokale Bild RBEC sondiert für die Aufnahme von DiILDL, einem fluoreszierenden Liganden des LDLR und für die Aufnahme von Ratten-Transferrin-Cy3, einem fluoreszierenden Liganden des TfR zeigen punktförmige Färbung auf der Zelloberfläche, mit einigen Clusterbildung in der perinukleären Region. (B) Ratte Tf-Cy3 wurde auf die obere Kammer, die das differenzierte RBEC Monoschicht bei 75 zugegeben, 150, 300, 600, 1.200, 2.400 und 4.800 pmol / Insert für 180 min bei 37 ° C (200 &mgr; l in der oberen Kammer und 1200 &mgr; in das untere Abteil). Nach dieser Zeit wurde Cy3-Fluoreszenz in dem Zelllysat (200 &mgr; l PBS 0,1% Triton X100) und in der unteren Kammer durch fluorimetrische Analyse mit einem Spektrofluorometer mit einer Anregung bei 550 nm und Emission bei 570 n quantifiziertMeter Fluoreszenz-Einheiten wurden in Picomol mit einem linearen Arbeitsbereich. (C) Für die Sättigungsexperimente transformiert wurde Ratten-Tf-Cy3 zu der oberen Kammer, die das differenzierte RBEC Monoschicht bei 1200 Picomol / Insert für 180 min bei 37 ° C mit oder ohne 15 hinzugefügt min Vorinkubation mit 4,800 Picomol / Einsatz von nicht-fluoreszierenden Tf. Der Transport in der unteren Kammer wurde wie in (B) (Student t-Test, p <0,05) quantifiziert. (D) DiILDL wurde zu der oberen Kammer, die das differenzierte RBEC Monoschicht mit 1, 2, 4 und 8 ug / Insert Filter hinzugefügt für 30 min bei 37 ° C (200 ul in die obere Kammer und 1200 &mgr; in der unteren Kammer). Nach dieser Zeit wurde Dil-Fluoreszenz in dem Zell-Lysat (200 &mgr; l PBS, 0,1% Triton X100) und in der unteren Kammer durch fluorimetrische Analyse mit einem Spektrofluorometer mit einer Anregung bei 554 nm und Emission bei 571 nm quantifiziert. LeuchtFluoreszenzeinheiten wurden in ug mit einem linearen Arbeitsbereich transformiert. (E) zum Transport Blockierungsexperimente, Natriumazid 0,05% 15 min vor der Inkubation DiILDL bei 2 ug / Insert für 30 min bei 37 ° C zuge Der Transport in der unteren Kammer wurde wie in (D) (Student-t-Test, p <0,05) quantifiziert. Das Fehlen von Toxizität von Natriumazid Inkubation bei 0,05% wurde von Pe (LY)-Messung (Daten nicht gezeigt) bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 8
Abbildung 8. In vitro BBB-Modelle aus Rattenrückenmark Endothelzellen oder aus Maushirn. Tabelle hochleuchtet wichtige Parameter für die Mikrogefäßextraktion aus Rattenhirn, Rattenrückenmark und Gehirn der Maus. Mikroskopische Aufnahmen zeigen, Immunfärbung für ZO1 und Occludin in endothelialen Zellmonoschichten aus Rattenhirn, Rattenrückenmark und Gehirn der Maus vorbereitet.

Discussion

Wir beschreiben die Umsetzung eines Wochen reproduzierbare Protokoll für die Isolierung und Beschichtung von Mikrogefäßen des Gehirns, nach der Reinigung und der Kultur der RBEC und weiteren Aufbau von Co-Kulturen mit primären Ratten-Astrozyten, ein in vitro-Modell mit BBB BBB charakteristischen Eigenschaften zu erzeugen.

Erfolgreich Gründung in-vitro-Kulturen BBB standardisiert erfordert optimale Bedingungen in den mehreren aufeinander folgenden Schritte des Prozesses. Das Modell wurde (a) optimiert, um die niedrigsten parazellulären Permeabilität, die der "Heilige Gral" der in-vitro-Modelle BBB bleibt, und (b) für Auslauf und RMT Mechanismen validiert erhalten.

Produktion, Reinigung und Proliferation von RBEC

Die größte Herausforderung bei der Kultivierung RBEC ist, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Kulturen zu erreichen. Standardisierung des Protokolls erfordert hochwertige Werkzeuge für disAbschnitt, hochwertige Reagenzien und Respekt Reagenz Ablaufdaten. Der Versuchsleiter muss in der Mikro-Dissektion unter Stereomikroskop für die schnelle Entfernung der Hirnhäute und große Schiffe aus der Kortexoberfläche qualifizierte werden. Sobald das Gehirn isoliert und mechanisch dissoziiert, ist eine der großen Herausforderungen, die optimale enzymatische Verdauung der frisch isolierten Gehirnmikrogefäßen. Die Art und Qualität der verwendeten Enzyme ist kritisch. Eine Mischung aus Collage Typ I und II und Dispase in hoher Konzentration mit geringer Variabilität zwischen den Chargen verwendet. Wichtig sind auch die Dauer der enzymatischen Verdauung und das Verhältnis zwischen Enzymkonzentration / Gewebegewicht / Volumen der Verdauung. Die beste Ausbeute von Gehirnmikrogefäß-Produktion wurde mit dem Äquivalent von 1 Kortex des Gehirns in 1 ml Collage erhalten / Dispase bei 60 ug / ml während der beiden Aufschlüsse 30 Minuten und 1 Stunde mischen sind.

Ebenfalls kritisch ist die Beseitigung von verunreinigenden Zells (Astrozyten und vor allem Perizyten). Diese Zellen vermehren sich bei höheren Rate als Endothelzellen und nicht tight junctions zu etablieren mit dem letzteren, wodurch die Einrichtung einer homogenen Zellschicht mit guten parazellulären Restriktions. In Anbetracht, dass Gehirn-Endothelzellen exprimieren deutlich höhere Efflux-Pumpen, insbesondere P-gp im Vergleich zu den anderen Zelltypen in Mikrogefäßen gefunden, tolerieren sie besser die ansonsten toxischen Konzentrationen von P-gp-Ligand Drogen, während nicht-Endothelzellen werden eliminiert. Puromycin-Behandlung bei 4 ug / ml für die ersten zwei Tage wurde durch zwei weitere Tage bei 2 ug / ml, gefolgt gute Endothelzellen Reinheit zu erhalten. Diese Auswahl kann auch Endothelzellen begünstigen im Vergleich zu denen von Venen, Pre-Kapillare Arteriolen oder größere Mikrogefäße und führen zu strengeren Monoschichten. Darüber hinaus ist die Verwendung von armes Plasma abgeleiteten Rinderserum eine Notwendigkeit Reinkulturen von Endothelzellen 47,48 erhalten. Das Plasma-derIved Serum fehlt Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), die mitogen für Fibroblasten ist für glatte Muskelzellen und Perizyten daher.

Wir haben beobachtet, dass die Behandlung von Kunststoff und Filter mit einer Mischung aus Kollagen Typ IV von Mäusen und menschlichem Fibronectin ergibt einen erheblichen Vorteil, mit einem 2-fachen Anstieg der Proliferation Ausbeute im Vergleich mit der traditionellen empfohlen Kollagen Typ I aus Rattenschwanz. Wichtige Hinweise für die Zellproliferation von der extrazellulären Matrix wie beispielsweise Integrin-und Wachstumsfaktor (bFGF) Aktivierung 49 vorgesehen. Pufferkonzentration und pH-Wert der Kulturmedien beschrieben worden sind, positiv auf die parazelluläre Dichtigkeit 50 auswirken, und wir beobachteten eine bessere Reproduzierbarkeit der Kulturen mit dem Zusatz von HEPES-Puffer mit 5 mM.

Differenzierung von RBEC: Co-Kultur-Establishment auf Filter einfügen

Nach Gehirn-Endothelzellen haben been gereinigt und wurden 6 Tage lang vermehrt, können sie auf Filtern plattiert werden. Zellbeschichtung mit hoher Dichte ist entscheidend, um eine perfekte Monoschicht zu erhalten. Ein Aussaatdichte von 160x10 3 Zellen pro 12-Well-Platte Filter notwendig und ausreichend war, um eine Monolayer 24 Stunden nach der Aussaat zu erhalten. Allerdings ist Isolierung von primären Gehirn Endothelzellen aus ihrer Umgebung ein Paradox in den Bau einer BBB-in vitro-Modell, wie es ist bekannt, dass primäre Zellen und insbesondere Gehirn Endothelzellen, sind stark von ihrer Umgebung reguliert und induktive Faktoren hergestellt die verschiedenen umliegenden Zelltypen. Gehirn-Endothelzellen allein kultiviert schnell dedifferenzieren und verlieren einige spezifische Hirn endotheliale Marker. Somit sollte primären endothelialen Zellen bei niedrigen Passage (P1) zumindest teilweise verwendet werden und neu verbunden, mit ihrer Umgebung durch Co-Kultur mit Astrozyten oder Medium durch Astrozyten 47,51 konditioniert. Dies giltgilt für Astrozyten-Differenzierung als Gehirn-Endothelzellen und Astrozyten sind in Zwei-Wege-Induktion beteiligt. Kultivierung RBEC mit Astrozyten führte zu starken Induktion von interendothelialen TJ 52,23. Die molekularen Mechanismen der Re-Induktion weitgehend unbekannt, und Forschung ist im Gange in mehreren Laboratorien auf bestimmte modulierenden Faktoren von Astrozyten sezerniert wird, die eine optimale endothelialen Zelldifferenzierung 53,54 fördern könnten. Faktoren, die von Endothelzellen des Gehirns einschließlich Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) sezerniert wurde gezeigt, dass Astrozyten 55,56 Differenzierung zu induzieren. Bevor Co-Kultur-Gründung, wurden Astrozyten, die Differenzierung Medium, das die Glucocorticoid-Rezeptor-Agonist Hydrocortison ausgesetzt und Co-Kultur-konditionierten Medium. Hydrocortison ist bekannt, dass die Dichtheit der Endothelzellen des Gehirns zu verbessern und wird in BBB-Modelle vor allem aus Ratte und Maus 57 58,59 endothelialen Zellen verwendet. Das konditionierte mediUm ist von der unteren Kammer der Endothelzelle / Astrozyten Co-Kultursystem nach 3 Tagen gesammelt und zur späteren Verwendung eingefroren. Der Einsatz von Co-Kultur-konditionierten Mediums reduziert die Zeit der endotheliale Zelldifferenzierung zu 3 Tage mit optimalen parazellulären Permeabilität für 2 Tage und auch eine verbesserte Reproduzierbarkeit zwischen den Kulturen.

Insgesamt ist das Protokoll beschreiben wir ergibt eine reproduzierbare TEER über 300 Ohm · cm 2 und eine durchschnittliche parazellulären Permeabilität Koeffizienten Pe (LY) von 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, ähnlich zu den besten Primärzellbasis BBB Modelle 22, 12. Das Protokoll wird beschrieben in der vorliegenden Manuskript mit dem vorgeschlagenen Modulation von Mikrogefäß enzymatische Verdauung kann erweitert werden, um Zellen aus Rattenrückenmark 60 und von Mäusen Hirnendothelzellen.

Molekulare und funktionelle Charakterisierung

AußerdemTJ Induktion, Astrozyten auch zur Expression von Effluxtransporter wie P-gp in Hirnendothelzellen 61 beitragen. Wir zeigen in der Tat Ausdruck der Effluxtransporter P-gp in der BBB-Modell und wir zeigen die Polarität der P-gp Effluxpumpe Lokalisierung mit biochemischen Methoden und P-gp-Aktivität unter Verwendung eines funktionellen Assays. GLT-1-Expression wurde in den basalen Membranfraktion von Mikrogefäßen festgestellt, jedoch nicht in kultivierten RBEC detektiert. Wir vermuten, dass GLT-1 wurde in unserer RBEC Kultur im Vergleich zu in vivo-Bedingungen und damit nicht durch Western-Blot-Analyse nachweisbar geregelt. Überschüssige Glutamat neurotoxisch und in vivo ist GLT-1 gegen Glutamat-Efflux aus den basalen Fach (Parenchym) zu der apikalen Kammer (Durchblutung) verantwortlich. In Astrozytenkulturen bleibt GLT-1-Expression sehr gering und wird durch Zugabe von Glutamat im Medium 62,63 induziert.

Wir conf auchirm der Ausdruck der Zustrom Transporter an der apikalen Membran, wie LRP1, LDLR und TfR. Die Funktionalität der TfR und LDLR wurde mit Bindung und Transportexperimente von Tf-Cy3 und DiLDL von der luminalen auf die abluminalen Seite der Monoschicht wie zuvor mit einem Rind in vitro BBB Modell 64 gezeigt demonstriert. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die Lipid Anforderung von Astrozyten erhöht die Expression von LDL-Rezeptor auf Endothelzellen Hirn 65,66 weitere Bestätigung der physiologischen Sprechen zwischen Astrozyten und Endothelzellen des Gehirns, einschließlich in vitro. Wir haben uns entschieden, Transport mit Fluoreszenzfarbstoffen wie veranschau wie Cy3 und Dil bedenkt, dass spektrofluorimetrischen Analyse ist in den meisten Labors zur Verfügung, und kann sich als nützlich erweisen, um in vitro BBB-Modelle zu validieren. Quantifizierung der Fluoreszenz ist jedoch weit weniger empfindlich als die Radioaktivität und erfordert eine Erhöhung der Anzahl von Experimenten, um signifikante Daten zu erhalten.Idealerweise Tf und LDL sind in der Regel radioaktiv markierten (Jod-125) für eine solche Bindung / Aufnahme und den Transport Experimenten.

Wir zeigen auch, dass die differenzierte Endothelzellen Monoschicht mit der vorgeschlagenen Protokoll erhalten reagiert auf Entzündungen, die durch TNF-α induziert, wie von CCL2 Mitteilung und BBB Öffnung enthüllt. CCL2 (MCP-1) und seinem Rezeptor CCR2 in ZNS-Erkrankungen wie Multiple Sklerose, experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) 67, ZNS-Trauma und 68 werden als Mediatoren der Leukozyten-Migration in das ZNS unter Bedingungen neuroinflammatorische 69,70 bekannt beteiligt. Mit dem Protokoll getestet, können wir nicht feststellen, auf einer polarisierten Sekretion von CCL2 weil BBB-Öffnung ermöglicht die CCL2-Konzentration zwischen den beiden oberen (apikal) und unteren (basal) Fächer ausgleichen lassen. Folglich wir deutlich unterschätzt die Menge des durch die CCL2 RBEC im apikalen Kammer bei 24 Stunden (5A) hergestellt.

> Gesamtübersicht und Grenzen der In-vitro-Modelle BBB: I n Vivo gegenüber In-vitro-und Nager gegen Menschen Vergleiche

Viel versprechende ZNS-Medikamente, die wirksam bei der BBB-Passage in vitro nachgewiesen scheiterte in klinischen Studien wegen fehlender Vorhersehbarkeit von in-vitro-Modelle BBB oft auf Zellen anderer Spezies als Mensch isoliert basiert. Nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen sind die in-vitro-Modelle BBB wahrscheinlich mehr Vorhersage, wenn es um das Studium mechanistische Aspekte von Protein-Netzwerken, Signaltransduktion, Transporter und Rezeptoren kommt. Jeder Mechanismus, Weg oder das Ziel in vitro untersucht werden muss, um seine Regulierung durch komplementäre Umweltreize (andere Zelltypen, Chemikalien, Proteine) mit der gleichen Tierspezies ist und in-situ-Untersuchungen kombiniert werdenUnd, wenn möglich, mit Mikrogefäßen und Endothelzellen aus Menschen isoliert, mit den Einschränkungen und Vorsicht hervorgerufen unten.

In-vitro-BBB-Modelle müssen als autonome Systeme, Regelung von Körper isoliert gesehen werden kann, aber immer noch mit großen in-vivo-Eigenschaften und das Potenzial für Regulierung durch Umweltreize dotiert. Kein "ideales" in vitro BBB Modell wurde noch vorgeschlagen 71,72,73 weil die endotheliale Zellmonoschichten fehlen einige wichtige Bestandteile des Neuro Glia Gefäßeinheit (NGVU) und von Blut und Körperregulierung isoliert. Das Fehlen von Perizyten 74,16 oder 17,18 Neuronen oder die verschiedenen Bestandteile der extrazellulären Matrix für die Kunststoffbeschichtung oder dem Kulturmedium und das Serum für das Zellwachstum in den häufigsten und "einfachste gemacht" in vitro BBB Modelle basierend auf Endothelzellen verwendet Zellen mit Astrozyten differenziert kann die Proteinexpression i modulierenn Vergleich mit der in vivo Situation 75. Diese Modelle können viele Transporter in vivo angezeigt zu äußern, aber nicht alle. In einigen Fällen wurden die ersten Transportparameter in isolierten Mikrogefäßen (am nächsten zu der in vivo-Situation) überprüft, und studierte dann in Zellkultursystemen 76,61.

Molekularbiologischen Forschung hat es der Charakterisierung von Gen-und Proteinexpression in isolierten Mikrogefäßen und niedrigen Gang Endothelzellkulturen aus der gleichen Art, und zwischen den verschiedenen Arten, meist aus Kleintiere wie Nagetiere (Mäuse und Ratten) oder vom Rind und Schwein Vergleich zu Menschen 77,78,75,15. Transkriptomischen Vergleich zwischen in vivo-und in vitro-Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen zeigten zahlreiche Gentranskripten, die differentiell exprimiert wurden und die am häufigsten in vitro signifikant herunterreguliert. Transcripts Zustrom Transportern wie TfR und pr Codierungoteins in Vesikeltransport beteiligt sind vor allem in kultivierten Endothelzellen des Gehirns herunterreguliert, was auf eine allgemeine Abnahme der Endozytose und Vesikeltransport in solchen Zellen. Kultur Manipulation in Bezug auf Reinheit (Puromycin-Behandlung) und die Behandlung mit Hydrocortison kann dazu beitragen, ein "in-vivo-ähnlichen" Genexpressionsprofil 77 wiederherzustellen. Transkriptom-Studien ergaben auch wichtige Unterschiede zwischen Arten, die weiter erschweren Prognosen auf Arzneimittelaufnahme bei Menschen auf der Grundlage Nagetier in vitro BBB-Modelle 75. In-vitro-Modelle, die BBB-Co-Kultur von humanen Endothelzellen und Astrozyten wurden 15 beschrieben. Obwohl relevant sind diese Modelle schwieriger zu implementieren regelmäßig, wie sie dass geregelte Zugang zur postmortalen menschlichen Gewebe und es gibt Heterogenität der Qualität / Eigenschaften der menschlichen Gehirn-Endothelzellen, je nach Alter, Krankheiten und möglicherweise medizinische treatment von Spendern. Anstrengungen unternommen, um neue in-vitro-Modellen, die eine bessere Reproduktion der physiologischen, anatomischen und funktionellen Eigenschaften der in vivo BBB entwickeln. Co-Kulturen, die drei-Zelltypen sind sehr restriktiv und schwierig erscheint, routinemäßig zu implementieren. Bis heute sind die komplexesten in vitro BBB-Modelle sind die dynamischen in-vitro-Modelle (DIV-BBB), die gefäßartige Organisation mit Astrozyten gehören und beinhalten eine Strömung von Medium, das den Blutfluss 75,79,80,81,82 nachahmt, 83,84,85. Wenn zerebralen Endothelzellen zu einer Strom ausgesetzt ist, aktiviert die erzeugte Scherspannung mechanotransducers an der Zelloberfläche, die die Expression verschiedener Gene in Endothelzellen Physiologie wie Zellteilung, Differenzierung, Migration und Apoptose beteiligt 80 zu modulieren. In vivo Scherbeanspruchung durch den Blutstrom erzeugt wird, ist für mitotische Festnahme an der Zellkontakt, der die Einrichtung ermöglicht ein verantwortungsendothelialen Zellschicht der Blutgefäße 80. Genom-und Proteom-Analyse des normalen menschlichen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen zeigte die Auswirkungen der Schubspannung in Endothelzellen BBB Physiologie 84. Scherbeanspruchung ist für das Überleben der Zelle, einen höheren Grad der endothelialen Zelladhäsion, Effluxpumpe Induktion und bessere Polarisation Transporter 75, der Regulierung des Glukosestoffwechsel 75,86, Oxidation durch CYP450 Enzyme 75 und die Regulierung der parazelluläre Permeabilität durch Erhöhung der Expression von Genen, die für die interzelluläre junctional Elemente wie Occludin und ZO-1 87,75,80 und damit hohe TEER rund 1.500 - 2.000 Ohm · cm 2, in der Nähe von in vivo bekannten Parameter 79,80

In der Biotechnologie-und Pharmaindustrie, Routine-Screening von Drogen oder sogar Hochdurchsatz-Screening (HTS) und die Bemühungen um Tierversuche zu reduzieren, führtefür die Entwicklung der verschiedenen Zelllinien in Ersatz der Primärkultur von zerebralen Endothelzellen, die schwieriger zu routineAufbau verbleiben verwendet werden. In den meisten Fällen wurden Primärkulturen von zerebralen Endothelzellen mit einer immortalisierenden Gen (SV40 oder Polyoma large T-Antigen und Adenovirus-E1A) entweder durch Transfektion von Plasmid-DNA oder durch eine Infektion mit retroviralen Vektoren transduziert 88,89,75,. Mehrere endothelialen Zelllinien von zerebralen Ursprungs wie die RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs oder rBCEC4 Rattenzelllinien 88,75, der b.End3 Mauszelllinie 90,75, die PBMEC/C1 entwickelt - 2 Schweine-Zelllinie 87,75, und die hCMEC/D3 menschlichen Zelllinie 89,75. Andere Modelle, die sich auf Zellen des nicht-zerebralen Ursprungs wie der Madin-Darby-Hundenieren (MDCK)-Zelllinien oder Caco2 12,75 berechnet. Unter den verschiedenen menschlichen Groß endothelialen Zelllinien hat das hCMEC/D3 weit zitieren wordend verbessert und als ein Modell der BBB seit seiner Gründung im Jahr 2005 91,92. Wie bei Primärkulturen, Zelllinien vorhanden Vorteile und Grenzen. Sie sind leichter zu handhaben als Primärkulturen haben eine erweiterte Lebensdauer, sind gut gekennzeichnet und lassen Reproduzierbarkeit zwischen Großversuche. Allerdings können Zelllinien, Gewebe-spezifische Funktionen verlieren, verlieren Umweltregulierung und erwerben ein Molekular Phänotyp ganz andere Zellen in vivo 75, 89. Insbesondere Monoschichten aus Zelllinien vorhanden Dichtheit reduziert, niedrige TEER und Show-Transporter Profilvariation 75,89 erzeugt. Somit Tierversuchen oder Studien in Primärzellen sind oft trotz ihrer zusätzlichen Komplexität bevorzugt.

Acknowledgments

Finanzielle Unterstützung für VECT-HORUS wird aus dem Fonds Einzigartige Interministériel (FUI / MEDUL Projekt) und VECT-HORUS und dem UMR7259 Labor von der Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC und PREVENTAD Verbundprojekte) anerkannt . Die UMR7259 Labor bestätigt auch finanzielle Unterstützung von der CNRS und von Aix-Marseille Université.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA fraction V low endotoxin PAA K45-011-500g 4 °C 
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122 -20 °C
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-054 -20 °C
DMEM high glucose Invitrogen 61965-026 4 °C 
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098 -20 °C / 1 year
T75 flasks Becton Dickinson Falcon 353135
HEPES buffer (1 M) Invitrogen 15630-056 4 °C / 1 year
Collagen type IV mouse (10 x 1 mg) Becton Dickinson 356233 -20 °C / 1 month
Fibronectin humain plasma (5 mg) Becton Dickinson 356008 -20 °C / 1 month
Vannas spring scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 91500-09
Scissors, straight (9 cm) Fine Science Tools 14568-09
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) Fine Science Tools 11251-35
Graefe Forceps, tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11050-10
Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm Fine Science Tools 11051-10
Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg) Roche Diagnostics 05 401 054 001 -20 °C / 3 months
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) Sigma Aldrich DN25-100 mg -20 °C / 1 year
Gentamicin (10 mg/ml) Invitrogen 15710-049 4 °C / 1 year
DMEM/F12 Invitrogen 31331-028 4 °C 
Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml) Clinisciences BT-214-100 -20 °C / 1 year
bFGF (10 µg) Invitrogen 13256-029 -20 °C / 6 months
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I Sigma Aldrich H3149-100KU 4 °C / 1 year
Puromycin Sigma Aldrich P8833-10 mg -20 °C / 6 months
ITSX Invitrogen 51500-056 4 °C / 1 year
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates Millipore PIRP15R48 Porosity: 1 µm
Surface: 1.1 cm2
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888-1 g -20 °C / 1 year
Mouse anti-CD31 / PECAM  Chemicon MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Von Willebrand Chemicon AB7356 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Desmine Chemicon MAB3430 1/200 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Vimentine Invitrogen, Zymed 08-0052 clone V9, (58 µg/ml)  1/50 - fixation PFA 4%
Mouse anti-Claudin-5 Invitrogen, Zymed 35-2500, (500 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-ZO-1 Invitrogen, Zymed 61-7300 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Rabbit anti-Occludine  Invitrogen, Zymed 71-1500 (250 µg/ml) 1/200 - fixation PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies Invitrogen 1/800
Lucifer Yellow CH, dilithium salt Sigma Aldrich L0259 -20 °C
TNF-alpha human PeproTech 300-01A -20 °C
Rat MCP-1 ELISA Kit PeproTech 900-K59 4 °C / -20 °C
Mouse anti-P-glycoprotein Covance, Eurogentec SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) 1/400 - fixation PFA 4%
1/200 (western blot)
Rabbit anti-GLT-1 Abcam ab41621 1/1,000 (western blot)
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702 4 °C
Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich V4629 4 °C
Cyclosporine A Sigma Aldrich 30024 4 °C
Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat American Diagnostica 3501 (100 µg/ml) 1/5 - fixation PFA 4%
Mouse anti-LDLR R&D systems AF2255 (200 µg/ml) 1/50 - fixation PFA 4%
Rat transferrin-Cy3 Gentaur JOR160050 4 °C
DiILDL Invitrogen L-3482 4 °C

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References

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