L'utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

L’objectif global de l’expérience suivante est de détecter la modulation des récepteurs couplés aux protéines G par les canaux potassiques, en utilisant des biocapteurs optiques de résonance sans marquage et de gradation de longueur d’onde pour réaliser cette non réséquée, les cellules HEK 2 93 et les cellules HEK 2 93 exprimant de manière stable le mou du canal potassique activé par le sodium de rat B sont placées sur une plaque de biocapteur optique de 384 puits et laissées incuber pendant la nuit. Ensuite, une mesure de base de la masse près de la membrane plasmique est effectuée et des agonistes des récepteurs endogènes couplés aux protéines G ou PCR G sont ajoutés. Comme dernière étape, la variation du signal résultant de l’activation des RCPG est mesurée et la modulation du canal potassique de cette réponse est calculée.

À terme, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines des neurosciences et de la signalisation cellulaire en mesurant quantitativement les mécanismes de signalisation entre les récepteurs couplés aux protéines G et les canaux potassiques. Les principaux avantages de l’utilisation de cette technique par rapport aux méthodes existantes pour examiner les interactions entre les canaux et les protéines, par exemple, les tests de CO et de précipitation, sont que le test peut être effectué à l’aide de cellules vivantes. Il ne nécessite pas l’utilisation de marqueurs exogènes, qui pourraient modifier la structure de la protéine en interaction.

Et enfin, au sein des cellules vivantes, vous pouvez réellement suivre les interactions en temps réel. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la signalisation entre les RCPG et les canaux potassiques. Il peut également être utilisé pour étudier les réponses cellulaires résultant des changements induits par les ligands dans l’adhésion cellulaire et la propagation de la toxicité, de la prolifération, de la migration et de tout changement dans la proximité de la membrane plasmique avec le biocapteur optique.

La technique a également le potentiel d’être utilisée dans la découverte de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies causées par des canaux ioniques ou des anomalies des récepteurs, telles que de nombreuses canalopathies, car elle peut être utilisée comme méthode à haut débit pour tester les effets des agents pharmacologiques sur les protéines de canal. Interactions protéiques. Nous avons eu l’idée d’utiliser cette méthode lorsque nous avons réalisé qu’il était nécessaire de développer un test qui pourrait examiner les interactions entre les protéines de canal dans les cellules vivantes.

Début 384. Revêtement de la plaque du biocapteur optique en hydratant une plaque de dioxyde de titane avec 20 microlitres par puits de culture de tissu stérile, qualité de l’eau pendant 15 minutes. Ensuite, utilisez une pipette à 16 canaux pour laver la plaque une fois avec 50 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate ou de PBS par puits.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’une solution de travail de fibronectine préparée dans chaque puits avant d’incuber pendant deux heures à température ambiante pour créer la matrice extracellulaire ou ECM après l’incubation. Lavez la plaque une fois avec 50 microlitres de PBS par. Ajoutez ensuite 40 microlitres d’une solution de travail d’ovalbumine préparée à chacun.

Bien incuber la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour bloquer la plaque après la liaison de l’ovalbumine. Lavez la plaque trois fois avec 50 microlitres de PBS par puits. Les plaques revêtues d’ECM peuvent être stockées à quatre degrés Celsius pendant quatre heures ou quatre.

Retirer le milieu de croissance des cellules HEK 2 93 non réséquées et des cellules HEK 2 93 exprimant de manière stable le mou B qui a été cultivé comme décrit dans le protocole textuel. Ajoutez ensuite des tripsin pour déloger les cellules de la plaque. Collectez les cellules dans une centrifugeuse à 1000 fois la gravité pendant une minute.

Retirez le milieu tripsin et remettez les cellules en suspension dans le milieu de croissance. À l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé, déterminez la concentration des cellules afin de minimiser les effets de l’évaporation pendant l’incubation, diluez les cellules pour obtenir le nombre souhaité de cellules par puits. Dans un volume de 50 microlitres de milieu de croissance pour ces expériences, 1000 cellules par puits.

Ont été plaqués sur le biocapteur après avoir pipeté 50 microlitres de cellules diluées à chacune, bien permettre aux cellules assises d’incuber pendant la nuit dans un milieu de croissance à 37 degrés Celsius, 5 % CO2. Pour préparer le dosage de la mesure de la longueur d’onde de résonance ou du biocapteur optique RWG. Retirer le milieu de croissance des cellules après l’incubation.

Lavez les cellules une fois avec la solution saline équilibrée de Hank, puis ajoutez 25 microlitres de la solution à chacune. Placez la plaque du biocapteur sur le scanner de liaison et laissez les cellules s’équilibrer à température ambiante pendant une à deux heures. Pendant ce temps, préparez une plaque composée distincte à partir de laquelle les ligands d’intérêt seront ajoutés à la plaque du biocapteur pendant le test.

Pour ces tests, 25 microlitres de solution contenant du composé ont été ajoutés à chaque puits sur la plaque du biocapteur pour un volume total de 50 microlitres. Pour effectuer le test du biocapteur optique RWG, prenez une mesure de référence avec le système de scanner pour les puits, A un à P 12, qui représentent la moitié des 384. La plaque de puits utilise une résolution maximale de 3,75 microns par pixel pour les 1,5 millimètres centraux de chaque puits à l’aide du logiciel de balayage de liaison, ce balayage de base prendra environ 30 minutes.

Ajoutez ensuite 25 microlitres de solutions composées dans chaque puits pour les puits, un à P 12. Ensuite, prenez une mesure de référence des puits A 13 à P 24. En suivant la ligne de base de ces puits, ajoutez 25 microlitres de solutions composées dans chacun des puits, A 13 à P 24.

Comme dernière étape, prenez une mesure post-édition composée pour les puits, A un à P 12 et répétez l’opération pour les puits a 13 à P 24. Pour analyser les données de test, ouvrez les données de test de liaison pour la mesure de référence dans Windows, puis cliquez sur le bouton de l’éditeur de grille pour activer la sélection de cellule. Le logiciel calculera les mesures d’intérêt définies par l’utilisateur, ouvrira les plugins, qui incluent le localisateur de cellules et la ligne de base ou les paramètres de fonction dans le localisateur de cellules afin que les cellules se distinguent de l’arrière-plan du biocapteur.

Exportez le fichier de mappage de cellule, qui contient les données du localisateur de cellules pour la mesure de référence. Répétez ces étapes pour les données de post-ajout composé. Ouvrez ensuite la ligne de base ou le plugin et importez la carte de cellules à partir de la mesure de base.

Le logiciel calculera le décalage de la valeur de la longueur d’onde maximale ou PWV entre les données d’arrière-plan et les données post-composées. Sélectionnez la moyenne de la cellule delta pour la sortie du décalage moyen de la PWV pour les cellules. Les données peuvent ensuite être exportées vers Microsoft Excel pour une analyse plus approfondie.

Slack b transfecté de manière stable, HEK 2 93. Cellules et contrôle non réséqués HEK 2 93 cellules étaient assises à 1000 cellules par puits sur 384. Eh bien, les plaques de biocapteur RWG revêtues d’ECM, les cartes de gradient de densité de masse ont été générées avant et 30 minutes après l’édition composée avec le balayage de liaison.

Les zones logicielles indiquées en rouge représentent les pixels identifiés comme appartenant aux cellules et les lignes jaunes distinguent les cellules du fond de la plaque grise. Le logiciel de vue de liaison a été utilisé pour déterminer le décalage de la VOP lors de l’édition d’agonistes du RCPG en soustrayant la VOP après l’édition composée de la VVS de base. Ceci est illustré par un dégradé de couleurs où le rouge représente un décalage positif de la valeur de la longueur d’onde maximale et le bleu représente aucun changement.

Le récepteur muscarinique endogène M1 contre le carbahol a été appliqué à la fois aux cellules témoins HEK 2 93 non réséquées et aux cellules HEK 2 93 exprimant de manière stable le mou B et a entraîné une augmentation positive de la valeur de la longueur d’onde maximale par rapport aux cellules témoins. Les cellules transfectées B lâches ont eu une augmentation plus importante de la valeur de la longueur d’onde maximale. S-F-L-L-R NH deux, sel d’acétate trifluoro et peptide activateur du récepteur de la thrombine terminale pentapeptide qui présente une activité agoniste contre le récepteur endogène activé par la protéase GPCR 1 a également montré des réponses différentielles dans les cellules transfectées B non réséquées et lâches.

Ces résultats montrent que la présence du canal B Slack augmente significativement le décalage de la VOP qui se produit lors de l’activation de la PCR G endogène dans les cellules K, et démontrent la faisabilité de l’utilisation de ce test pour étudier les interactions entre les canaux protéiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer et d’effectuer un test de biocapteur optique sans marquage. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée sur une période de deux jours si les cellules et les réactifs ont été préparés avec soin lors de la tentative de cette procédure.

Il est important de se rappeler que les paramètres de dosage, tels que le nombre de cellules à installer, le temps d’incubation des ligands, etc., doivent être optimisés pour différentes lignées cellulaires. Une fois que vous avez effectué cette procédure, vous pouvez utiliser d’autres méthodes telles que R et AI pour essayer de déterminer quelles protéines particulières sont nécessaires pour le changement observé dans le signal. N’oubliez pas que travailler avec des cultures de cellules humaines peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le travail avec une cagoule de biosécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.