L'utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

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Bioengineering

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Summary

Techniques de biocapteurs optiques peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique dans les cellules vivantes et permettre un suivi de la réponse cellulaire dans les deux cellules et les populations de cellules individuelles. Ce protocole décrit la détection de la modulation des canaux potassiques par G récepteurs couplés aux protéines dans des cellules intactes en utilisant cette approche.

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Fleming, M. R., Shamah, S. M., Kaczmarek, L. K. Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (84), e51307, doi:10.3791/51307 (2014).

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Abstract

Les canaux ioniques contrôler les propriétés électriques des neurones et d'autres types de cellules pouvant être excitées sélectivement par des ions permettant de couler à travers la membrane plasmique 1. Pour réguler l'excitabilité neuronale, les propriétés biophysiques des canaux ioniques sont modifiées par les protéines et molécules de signalisation, qui se lient souvent les chaînes elles-mêmes pour former un complexe hétéromère de canal 2,3. Des dosages traditionnels examinant l'interaction entre les canaux et les protéines régulatrices exogènes exigent des étiquettes qui peuvent éventuellement modifier le comportement de la protéine et de diminuer l'importance physiologique de la cible, tout en fournissant peu d'informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. Des biocapteurs optiques, tels que le système X-CORPS Biosciences BIND Scanner, utilisent une technologie sans étiquette roman, résonance longueur d'onde de réseau (GTR) de biocapteurs optiques pour détecter les changements dans la lumière réfléchie de résonance près du biocapteur. Cet essai permet la détection de l'importance relativechanger dans la masse à l'intérieur de la partie inférieure des cellules vivantes adhérentes à la surface du biocapteur résultant de ligands changements induits dans l'adhérence cellulaire et d'étalement, de la toxicité, de la prolifération, et les changements dans les interactions protéine-protéine à proximité de la membrane plasmique. Biocapteurs optiques GTR ont été utilisées pour détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique des cellules suite à l'activation de G récepteurs couplés aux protéines (RCPG), les tyrosine kinases de récepteur, et d'autres récepteurs de la surface cellulaire. Les changements induits dans les interactions ligand-protéine canal ionique peuvent également être étudiés dans cet essai. Dans cet article, nous allons décrire la procédure expérimentale utilisée pour détecter la modulation de la Slack-B potassium activée au sodium (Na) K canaux par les RCPG.

Introduction

D'examen des cellules vivantes dans leur contexte physiologiquement pertinent est essentielle pour comprendre les fonctions biologiques des cibles cellulaires. Cependant, des dosages examinant l'interaction entre les canaux et les protéines cytoplasmiques de régulation, tels que des essais de co-immunoprécipitation, fournissent généralement peu d'informations sur le déroulement dans le temps des interactions dans les cellules vivantes. La majorité des essais à base de cellules en cours de mesurer un événement cellulaire spécifique, tel que la translocation d'une protéine d'intérêt marqué de manière fluorescente. Ces tests nécessitent des modifications des protéines d'intérêt, qui peuvent potentiellement altérer le comportement de la protéine et de diminuer la pertinence physiologique de la cible. Des dosages à base de cellules non invasive, qui ne nécessitent pas la manipulation du système, fournissent une mesure en continu de l'activité cellulaire et permettant l'étude des cellules dans leur état ​​le plus physiologiquement pertinent 4.

Des biocapteurs optiques sont conçues pour produireun changement mesurable dans une caractéristique de la lumière qui est couplée à la surface du capteur. Biocapteurs optiques qui utilisent des ondes évanescentes, qui comprennent la résonance de plasmon de surface (SPR) et de la longueur d'onde de résonance de réseau (GTR) techniques, ont été principalement utilisés pour détecter les affinités et la cinétique des molécules se liant à leurs récepteurs biologiques immobilisés sur la surface du capteur. Plus récemment, disponibles dans le commerce biocapteurs GTR ont été développés pour permettre la détection de la variation relative de masse à l'intérieur de la partie de fond de cellules adhérentes à la surface du capteur à haute résolution spatiale (jusqu'à 3,75 um / pixel) 5. Ces biocapteurs peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique de cellules vivantes qui résultent de la stimulation, telles que l'adhérence cellulaire et d'étalement, de la toxicité, de la prolifération et de voies de signalisation induites par une variété de récepteurs de surface cellulaire, y compris des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 6 . Biocapteurs GTR détecter le chan rapportge dans l'indice de réfraction en fonction de la variation relative de masse à l'intérieur de 150 nm du biocapteur 7. Lorsque les cellules sont étalées au biocapteur, cette variation de l'indice de réfraction reflète la variation de la masse à proximité de la membrane plasmique de la cellule résultant d'un changement dans l'adhésion cellulaire au biocapteur. Ce protocole va discuter de la détection des interactions protéine-canal à l'aide de biocapteurs GTR.

GTR systèmes d'acquisition de données sont constituées de plusieurs composants. Parce que le X-CORPS Biosciences BIND scanner a été utilisé pour ces expériences, nous désignerons les composants de ce système particulier, qui se compose d'un lecteur de plaque, les biocapteurs associés, logiciel d'acquisition BIND de numérisation, et le logiciel BIND Voir d'analyse 8. Les biocapteurs à cristaux photoniques, appelées ci-après en tant que biocapteurs optiques, sont constitués d'un agencement périodique d'un matériau diélectrique et en deux ou trois dimensions qui empêchent la propagation de la lumière au spécifiquelongueurs d'onde et les directions. Des structures à cristaux photoniques sont basés sur un phénomène appelé anomalie de Wood. D'abord découvert par Wood en 1902, ces anomalies sont les effets observés dans le spectre de la lumière réfléchie par des réseaux de diffraction optiques où les variations rapides de l'intensité de certains ordres de diffraction se produisent dans certaines bandes de fréquences étroites. En 1962, Hessel et Oliner présenté une nouvelle théorie des anomalies de bois dans laquelle période finie réseau génère une longueur d'onde de résonance permanente 9. Dans les biocapteurs optiques décrits ici, les anomalies de bois sont utilisés pour produire un biocapteur GTR que lorsqu'elles sont stimulées par la lumière blanche ne reflète que très étroite bande de longueurs d'onde (typiquement entre 850 à 855 nm).

Biocapteurs individuels se composent d'une matière plastique à faible indice de réfraction avec une structure de surface périodique qui est revêtue d'une mince couche de matériau diélectrique de dioxyde de titane de réfraction élevé (TiO 2). Lorsque les Biosensou est éclairée par une large source de lumière de longueur d'onde, le réseau optique de cristaux photoniques reflète une gamme étroite de longueurs d'onde de la lumière qui est mesurée par un spectrophotomètre dans le scanner de BIND. L'intensité maximale des longueurs d'onde réfléchies (Longueur d'onde crête valeur, ou VOP) est alors calculée à partir du signal. Le VOP de déplacements lumineux lors d'un changement de l'indice de réfraction à la suite d'une augmentation ou une diminution de la masse à l'intérieur de la proximité (~ 150 nm) de la surface du biocapteur. Des biocapteurs optiques sont intégrés dans une société de la norme des sciences biomoléculaires (SBS) de 384 puits de microplaques pour les analyses utilisées dans ces expériences.

biocapteurs RWV sont utilisés pour détecter des changements lors de l'addition des signaux exogènes dans des cellules vivantes 10. Les cellules sont cultivées directement sur la surface d'un biocapteur GTR et la variation de l'indice de réfraction locale est surveillée lors du traitement avec des stimuli spécifiques. Le sens de variation de la masse au biocapteur peut êtredéterminé, car une augmentation de l'indice local de réfraction à partir de résultats d'une augmentation de la masse près du biocapteur et est mesurée par une augmentation de la VOP. Inversement, une diminution de la masse entraîne une diminution de la VOP. Le changement dans la VOP détecté peut résulter de nombreux événements cellulaires, y compris les changements dans l'adhésion cellulaire, la protéine de recrutement / release, endocytose et exocytose, le recyclage, l'apoptose, et du cytosquelette réarrangement. Par exemple, le dosage peut être détecter les changements dans les interactions protéine-canal entre les canaux potassiques et d'autres composants cytoplasmiques ou du cytosquelette. L'état de cause, cependant, doit avoir lieu dans la zone de détection ~ 150 nm proche du biocapteur, et dans le cas d'une cellule attachée, à proximité de la membrane plasmique. Acquisition de réponses cellulaires est effectuée avec le logiciel d'analyse BIND et une représentation d'image de chacun des 384 puits de la plaque SBS est généré. Ce système a une résolution de jusqu'à 3,75 um / pixel, ce qui permet la détection d'événements dans des cellules individuelles, etpeut être utilisé soit avec des lignées cellulaires (par exemple, des cellules HEK293 ou CHO) ou avec plus physiologiquement pertinente des cellules primaires. analyse d'image avec BIND Voir logiciel permet la détection des réponses cellulaires à la fois individuelle et des populations de cellules. Comme les biocapteurs sont incorporés dans la norme SBS 384 puits des microplaques, le système est facilement adaptable à un criblage à haut débit (HTS).

-Longueur d'onde de résonance des biocapteurs optiques de réseau ont déjà été utilisées pour détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique des cellules suite à l'activation du GPCR 11. Notre laboratoire a cloné deux canaux potassiques (K Na) activé sodium, Slack-B et Slick 12. L'activité des deux canaux B et Slack-luisant a été montré pour être très fortement influencé par une activation directe de la protéine kinase C (PKC) 13. L'activation de la protéine Ga de q récepteurs couplés, tels que le récepteur muscarinique M1 et la glutamate métabotropiques mGluR1 receptor, régule puissamment l'activité des canaux grâce à l'activation de la PKC. Ces canaux K Na contribuent à l'adaptation neuronale pendant la stimulation soutenue et régulent la précision de la synchronisation des potentiels d'action 14. Chaînes lâches sont connus pour interagir avec une variété de molécules de signalisation cytoplasmiques, y compris FMRP, la protéine Fragile X Mental Retardation 15,16. Des mutations dans le résultat Slack dans plusieurs crises partielles Migration de la petite enfance (MMPSI), une forme précoce de l'épilepsie qui se traduit par un retard de développement sévère 17.

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Protocol

Une. Culture cellulaire (Adapté de Fleming et Kaczmarek 18)

  1. cellules de la culture dans les médias appropriés pour plus de 2 mais moins de 10 passages avant de l'utiliser dans cet essai. Non transfectées cellules HEK-293 et ​​des cellules HEK-293 exprimant de manière stable rat protéine Slack-B sont cultivés dans du milieu d'une moitié de Dulbecco Modified Eagle et une moitié milieu L-15 de Leibovitz supplémenté avec 10% de sérum inactivé à la chaleur de veau foetal et des antibiotiques. 500 pg / ml de généticine (G418) est ajouté à des cellules HEK-293 exprimant de manière stable Slack-B pour sélectionner pour l'expression du canal Slack. cellules Passage à 70-90% de confluence par dissociation des plats avec une solution de trypsine-EDTA 0,25%.

2. La matrice extracellulaire (ECM) Revêtement du TiO 2 384 puits biocapteur optique Plaque avec la fibronectine et l'ovalbumine

  1. Préparation du mélange d'ECM et la fibronectine solution de blocage de l'ovalbumine
    1. Préparer une solution de travail de fibronectdans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 5 pg / ml de fibronectine dans 20,0 ml de PBS. De 1,0 mg / ml concentration de bouillon, ajouter 100 pi à 20,0 ml de PBS pour une dilution de 200 fois. La solution de travail de la fibronectine peut être aliquote et stocké à -20 ° C après la préparation.
    2. Préparer une solution mère de 5% d'ovalbumine inactivé par la chaleur de l'eau stérile. Diluer l'ovalbumine dans l'eau de qualité pour culture tissulaire stérile pour une solution à 5% et à la chaleur pour inactiver les 30 min à 60 ° C. Refroidir la solution à la température ambiante et filtre stérile de la solution. Aliquoter la solution d'ovalbumine à 5% et conserver à 4 ° C.
    3. Préparer une solution de travail de 2% d'ovalbumine par dilution de la solution mère de 5% dans du PBS. Par exemple, ajouter 12,0 ml de solution d'ovalbumine du stock de 5% à 18,0 ml de PBS pour un volume final de 30,0 ml.
  2. 384 puits couche de plaque de biocapteur optique
    1. Hydrater la plaque TiO 2 avec 20,0 ul / puitsde l'eau stérile de qualité pour culture de tissus pendant 15 min. Les étapes suivantes doivent être effectuées avec une pipette 16 canaux.
    2. Laver 1x plaque avec 50,0 ul de PBS par puits.
    3. Ajouter 20,0 ul de la solution de travail de la fibronectine à chaque puits et incuber pendant 2 heures à la température ambiante pour créer l'ECM.
    4. Laver 1x plaque avec 50,0 ul de PBS par puits.
    5. Ajouter 40,0 ul de la solution de travail de l'ovalbumine à chaque puits et incuber pendant une nuit à 4 ° C pour bloquer la plaque.
    6. Laver la plaque 3x avec 50,0 ul de PBS par puits. des plaques revêtues d'ECM peuvent être stockés à 4 ° C pendant jusqu'à 48 heures.

3. Ensemencement des cellules sur la 384 et la plaque de biocapteur optique

  1. Retirer les milieux de croissance des cellules et ajouter de la trypsine pour détacher les cellules de la plaque. Recueillir les cellules et centrifuger à 1000 g pendant 1 min. Retirez le support de la trypsine et remettre les cellules dans un milieu de croissance.
  2. L'utilisation d'un hémocytomètre ou un système automatisécompteur de cellules, déterminer la concentration des cellules.
  3. Afin de minimiser les effets de l'évaporation au cours de l'incubation, 50,0 ul de milieu de croissance par puits sera utilisé. Les cellules doivent être dilués pour obtenir le nombre désiré de cellules par puits dans un volume de 50,0 pi de milieu de croissance. Pour ces expériences, 1000 cellules / puits ont été étalés sur le biocapteur.
  4. Laisser les cellules ensemencées à incuber pendant une nuit dans du milieu de croissance à 37 ° C sous air / 5% CO 2.

4. Préparation des biocapteurs et de composés Plaques pour le dosage GTR optique biocapteur

  1. Retirer la plaque de l'incubateur et éliminer le milieu de croissance des cellules. Laver les cellules 1x avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Ajouter 25,0 ul de HBSS à chaque puits.
  2. Placer la plaque de biocapteur du scanneur BIND et laisser les cellules s'équilibrer à la température ambiante pendant 1-2 heures.
  3. Préparer une plaque de composé séparé de ligands d'intérêt qui seront annonceded à la plaque de biocapteur pendant le dosage. Pour ces dosages, 25,0 ul de solution contenant le composé a été ajouté à chaque puits sur la plaque de biocapteur pour un volume total de 50,0 ul. En tant que tels, les composés en solution ont été préparés dans le 2x concentration finale souhaitée.

5. Effectuez le test GTR optique biocapteur

  1. Prendre une mesure de référence avec le système de scanner pour les puits A1-P12 (la moitié de la plaque 384 puits SBS) avec une résolution maximale de 3,75 um / pixel pour la centrale de 1,5 mm de chaque puits en utilisant le logiciel BIND Scan. Cette analyse de base dure environ 30 min.
  2. Ajouter 25,0 ul des solutions de composés à chaque puits pour les puits A1-P12.
  3. Prendre une mesure de base de puits A13-P24.
  4. Ajouter 25,0 ul des solutions de composés à chaque puits dans les puits A13-P24.
  5. Prenez une mesure de l'addition post composé de puits A1-P12, et répéter pour les puits A13-P24.

6. Analyse des données de dosage avec BIND Voir

  1. Ouvrez les données d'analyse de BIND pour la mesure de référence dans Windows, et cliquez sur le bouton "Grid Editor" pour permettre la sélection de cellules. Le logiciel calcule les paramètres d'intérêt définis par l'utilisateur.
  2. Ouvrez les "plug-ins", qui comprennent le "Finder portable" et la fonction "Baseliner". Définissez les paramètres dans "Finder portable" pour que les cellules se distinguent de l'arrière-plan du biocapteur.
  3. Exportez le fichier de la carte de la cellule qui contient les données "portable Finder" pour la mesure de référence.
  4. Répétez les étapes 6.1 à 6.2 pour les données poste d'addition de composé.
  5. Ouvrez le "Baseliner" plug-in et importer la carte de la cellule à partir de la mesure de référence. Le logiciel calcule le décalage dans la VOP entre les données de base et post composés.
  6. Sélectionnez "Δ cellulaire moyen" pour la sortie du décalage moyen dans la VOP pour les cellules. Les données peuvent ensuite être exportées vers Microsoft Excel pour une analyse ultérieure.

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Representative Results

Slack-B transfectées de façon stable cellules HEK-293 et ​​le contrôle non transfectées cellules HEK-293 ont été ensemencées à 1000 cellules / puits sur 384 et, ECM revêtu GTR plaques de biocapteurs. Images de la centrale de 1,5 mm 2 du biocapteur ont été enregistrées à une résolution de 3,75 um / pixel (Figure 1). gradient de densité de masse des cartes ont été générées avant et 30 minutes après l'addition de composé avec le logiciel BIND Scan. La BIND Voir logiciel a été utilisé pour déterminer le changement de la VOP sur GPCR plus agoniste en soustrayant l'ajout de composé VOP de poste de la VOP de référence.

Le chlorure muscarinique M1 agoniste des récepteurs de carbamoylcholine endogène (carbachol) 19 a été appliqué à la fois le contrôle non transfectées HEK-293 et B-Slack rat exprimant de manière stable des cellules HEK-293 ont donné lieu à un accroissement positif de VOP (figure 2A). Les mesures ont été prises à 30 min et signaux ont été normalisés pour tamponner seulement (HBSS) additisur. Par rapport aux cellules témoins, les cellules transfectées Slack-B avaient une plus grande augmentation de la crête changement de VOP. SFLLR-NH 2, le sel de trifluoroacétate (SFLLR), un pentapeptide TRAP N-terminale qui présente une activité d'agoniste contre le GPCR protéase endogène du récepteur activé par une (PAR1), a également montré des réponses différentielles dans des cellules non transfectées et Slack-B transfectées (Figure 2B). Ces résultats montrent la présence du canal Slack-B augmente de manière significative le déplacement de VOP qui se produit lors de l'activation du GPCR endogènes dans les cellules HEK, et de démontrer la faisabilité de l'utilisation de ce test pour étudier les interactions protéine-canal.

Figure 1
Figure 1. Analyse des réponses cellulaires dans BIND View. Des images représentatives de BINDScanner d ata pour Slack B transfectées de façon stable cellules HEK-293 A) avant et B) après l'analyse d'image avec le logiciel BIND Voir "Cell Finder" plug-in. Seuils ont été définis manuellement en utilisant la "cellule Finder" plug-in pour identifier les cellules de fond. B) Les zones illustrées en rouge représentent pixels identifiés comme appartenant à des cellules et des lignes jaunes distinguer les cellules de la plaque sur fond gris. C) Le changement dans la VOP pour les cellules lors de l'addition SFLLR est représenté par un dégradé de couleurs, où le rouge représente un changement positif dans la VOP et le bleu représente aucun changement. La barre d'échelle représente 100 um. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 2. Expression de Slack-B modifie le décalage dans la VOP suivant l'activation des RCPG. A) Le M1 agoniste des récepteurs muscariniques carbachol (500 M) a produit un changement dans la VOP qui est plus grande amplitude dans Slack-B cellules transfectées que les cellules de contrôle HEK-293 ( P <0,0001, N = 16 puits / condition). B) Application de SFLLR (10 M), un pentapeptide TRAP N-terminale qui présente une activité agoniste contre le GPCR protéase endogène récepteur activé 1 (PAR1), produit un changement dans la réponse de la VOP qui est supérieur en amplitude dans des cellules-B Slack transfectées de contrôle dans des cellules HEK-293 (P <0,0001, n = 16 puits / condition). Les mesures ont été enregistrées 30 plus composé de poste min, et la réponse de ligand a été normalisées au tampon seul contrôle. Les barres d'erreur est de ± SEM. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Discussion

Le premier de Z (Z ') de facteur est une méthode statistique commun pour quantifier la qualité d'un dépistage dosage à haut débit 20, et parce que le dépistage des agonistes de RCPG dans cet essai a eu lieu dans un essai de 384 puits compatible SBS, fournit une excellente mesure de la robustesse et de la validité de ce test 21. AZ "valeur 1 indique une analyse théoriquement idéale avec un nombre infini de points de données avec des écarts types inexistants. AZ "valeur comprise entre 0,5-1 est considéré comme un excellent test à des fins de criblage à haut débit, avec moins de 0,5 considéré comme un test légèrement informatif. Pour cet ensemble de données, le Z 'valeur calculée en utilisant carbachol un SFLLR comme contrôles positifs est de 0,79 et 0,81 respectivement, ce qui indique cet essai est très robuste et les résultats obtenus sont très importants.

Revêtement de la matrice extracellulaire de la plaque de 384 puits de biocapteur optique, l'ensemencement des cellules, et le composé outredans ces expériences a été réalisée manuellement avec un 16 canaux Finnpipette (5-50 pi). Comme ce test est réalisé sur une plaque de SBS, des systèmes de manipulation de liquides robotiques plus avancées peuvent être utilisés dans le criblage à haut débit. Cependant, lors de l'adaptation des systèmes de manutention instrumentation liquide, il faut prendre soin de s'assurer que les embouts de pipette ne touchent pas la surface du biocapteur car cela pourrait causer des dommages au biocapteur.

Lors de l'ajout des composés dissous dans du DMSO, le dosage doit être réalisé de telle sorte que la concentration finale de DMSO dans le milieu d'essai est maintenue constante afin d'éviter un déplacement de la VOP due à la toxicité du DMSO à la cellule ("choc de DMSO"). Bien que différentes lignées cellulaires sont différemment sensibles au DMSO dans cette analyse, nous recommandons que la concentration finale de DMSO ne dépasse pas 0,1-0,2% en volume. Les cellules doivent être incubées à la concentration finale de DMSO dans du tampon d'essai pendant l'étape d'équilibrage de la température de ce protocole, afin d'éviter solvendes décalages induits t-en VOP.

Une gamme variée de cellules, y compris les piles, peut être étudié avec ce test, bien que l'optimisation du dosage pour chaque lignée cellulaire doit être effectuée. Lors de l'utilisation des types de cellules différents, l'optimisation du nombre de cellules et la matrice extracellulaire biocapteur revêtements de surface doit être effectuée. Les cellules doivent être ensemencées à des densités différentes entre 1,000-15,000 cellules / puits et traitées avec un agoniste de récepteur connu pour déterminer la densité qui produit la plus haute Z '. Différents traitements de surface de l'ECM, y compris, mais sans s'y limiter, la fibronectine, le collagène, la laminine et, soit seul, soit en combinaison, doivent être testés pour s'assurer que les cellules restent adhérentes au biocapteur pendant le dosage. Cellule famine (absence de sérum) peut influencer la réponse cellulaire dans ce dosage, et que de telles expériences peuvent être réalisées dans exempt de sérum et contenant du sérum support à des fins d'optimisation initiale de l'essai. La haute résolution de l'étiquette de la BIND Scanner gratuitementdétection permet des mesures de réponse à quantifier à faible densité cellulaire, car l'analyse des réponses cellulaires peut être limité aux seuls pixels contactés par les cellules. En outre, les sous-populations de cellules dans un mélange hétérogène peuvent être bloquées reposent sur plusieurs paramètres (y compris la taille et la force de l'adhérence cellulaire) et évalués pour les réponses cellulaires individuelles. Pris ensemble, ces fonctionnalités font de la BIND scanner idéal pour des essais impliquant des cellules en culture primaire.

Le système de scanner de BIND permet des mesures à prendre au cours d'une évolution temporelle spécifiée, et donc des mesures time-lapse de changements dans la VOP peuvent être enregistrées. Ceci est particulièrement utile pour mesurer les changements dans le comportement des cellules qui se produisent sur des périodes plus longues que celles qui sont dues à des interactions protéine-canal, y compris la prolifération cellulaire, la division cellulaire et la migration cellulaire. La BIND Voir le logiciel permet l'analyse de ces réponses cellulaires, et peut quantifier nombreux parameters de changements dans la structure de la cellule, y compris les changements dans l'adhésion cellulaire, les changements de volume de la cellule, et les changements dans le mouvement des cellules, permettant à la fois une analyse quantitative et imagerie time-lapse de ces événements. Par exemple, ce système peut être utilisé pour déterminer le taux de fibroblastes qui répondent au facteur de croissance de signalisation en suivant le taux de migration des cellules à travers un puits individuel.

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Disclosures

Steven M. Shamah est un employé de X-CORPS Biosciences.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Yangyang Yan dans le laboratoire du Dr Fred Sigworth à l'Université de Yale pour le généreux don de cellules HEK293 exprimant de façon stable la protéine rat Slack-B. En outre, les auteurs tiennent à remercier le Dr Sigworth pour cryo-microscopie électronique modèle d'homologie de Slack affiché dans la vidéo d'introduction. Cette recherche a été financée par le NIH subventions DH067517 et NS073943 à LKK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, High Glucose Life Technologies 11965-092
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415-064
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Geneticin G-418 Sulfate American Bioanalytical AB05057
HBSS Life Technologies 14025-092
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Albumin from chicken egg white Sigma-Aldrich A5378
DPBS Life Technologies 14190-144
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6
Carbamoylcholine chloride Sigma-Aldrich C4382
SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt Sigma-Aldrich S8701
Finnpipette (5-50 µl) Thermo Scientific 4662090
BIND Scanner System X-BODY Biosciences N/A
384-well TiO2 coated plates X-BODY Biosciences TiO-96-CM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. Sinauer Associates. (1992).
  2. Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
  3. Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
  4. Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
  5. Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
  6. Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
  7. Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
  8. Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
  9. Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
  10. Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
  11. Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
  12. Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
  13. Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
  14. Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
  15. Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
  16. Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
  17. Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
  18. Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
  19. Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
  20. Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  21. Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).

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