Une microplaque de dosage rapide et spécifique pour la détermination de l'ascorbate intra-et extracellulaire dans les cellules cultivées

Biology

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Summary

Ascorbate joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement mis en lumière au cours des dernières années. Nous décrivons ici un débit moyen, dosage de microplaques spécifique et peu coûteux pour la détermination de l'ascorbate à la fois intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

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Lane, D. J., Lawen, A. A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (86), e51322, doi:10.3791/51322 (2014).

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Abstract

La vitamine C (ascorbate) joue de nombreux rôles importants dans le métabolisme cellulaire, dont beaucoup ont seulement venir à la lumière au cours des dernières années. Par exemple, dans le cerveau, l'ascorbate agit d'une manière neuroprotecteur et neuromodulateur qui implique vélo ascorbate entre les neurones et les astrocytes vicinaux - une relation qui semble être essentiel pour le cerveau ascorbate homéostasie. En outre, la preuve émergente suggère fortement que l'ascorbate a un rôle considérablement élargi dans la régulation du métabolisme du fer cellulaire et systémique que classiquement reconnu. La reconnaissance croissante du rôle intégrante de l'ascorbate dans la physiologie cellulaire et organismique normale et déréglementé exige une gamme de moyen-débit et haute sensibilité des techniques analytiques qui peuvent être exécutées sans avoir besoin d'équipement spécialisé très coûteux. Ici, nous fournissons des instructions explicites pour un débit moyen, essai de microplaques spécifique et relativement peu coûteux pour la détermination de boe ascorbate intra-et extra-cellulaire dans une culture cellulaire.

Introduction

La découverte de la nature chimique de l'acide ascorbique (vitamine C), et son identification comme le «facteur anti-scorbutique" longtemps cherché, par Albert Szent-Györgyi et d'autres dans les documents publiés de 1928 à 1934 1 étaient événements marquants dans l'histoire de la biochimie. En effet, ces découvertes ont contribué à Szent-Györgyi est attribué le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1937. L'ensemble toujours croissant de rôles pour l'ascorbate en physiologie animale et végétale, ainsi que la santé humaine, continuent à être les sujets de scientifique active enquête et de controverse.

L-ascorbate est un réducteur physiologique abondante et cofacteur enzymatique dans des systèmes de mammifères, et contribue à de nombreuses réactions enzymatiques impliquant bien définies hydroxylation du collagène, de la carnitine et de la norépinéphrine la biosynthèse, le métabolisme de la tyrosine et de l'hormone de peptide amidation 2. Curieusement, evide de montagence suggère que l'ascorbate joue un rôle dans la stimulation d'autres dioxygénases de fer-dépendants, tels que les hydroxylases prolyl et asparaginyle impliquées dans le ciblage et l'hydroxylation des facteurs inductibles par l'hypoxie (HIF) et 1α 2α 3. Un rapport récent suggère que l'ascorbate joue un rôle dans la maturation des lymphocytes T en affectant la chromatine déméthylation via son activité en stimulant les hydroxylases nucléaires, Jumonji C (JmjC) protéines de domaine; ce dernier qui semble exiger ascorbate de pleine activité 4. En effet, la stimulation de ces enzymes par ascorbate semble se produire par un mécanisme similaire à la stimulation par l'ascorbate de collagène et les HIF hydroxylases. Parmi d'autres effets classiques, ascorbate contribue de manière significative à l'anti-oxydation cellulaire en tant que chaîne de tomber en piégeur de radicaux soluble dans l'eau 5 et au recyclage de la membrane plasmique α-tocophérol (vitamine E) par l'intermédiaire de la réduction du radical α-tocophéroxyles 6, which est important dans la protection contre peroxydation des lipides membranaires 7. Il est important, bien que la plupart des mammifères sont capables de novo la synthèse hépatique de l'ascorbate de D-glucose, les primates supérieurs, des cobayes et des chauves-souris dépendent de sources alimentaires de vitamine 8. Cela est dû à l'inactivation du gène GULO, les orthologues de non affectées chez les mammifères qui codent pour l'enzyme, γ-gulono-lactone oxydase 9-13. Cette enzyme est requise pour la réaction finale dans la biosynthèse de l'ascorbate de 13 glucose.

Après absorption de transporteur à médiation par de la lumière intestinale chez l'homme, l'ascorbate est distribué dans tout le corps par le système circulatoire. La vitamine se trouve généralement dans sa forme réduite à des concentrations millimolaires intracellulaire (à l'exception notable des érythrocytes dans laquelle les concentrations sont généralement similaires à la concentration plasmatique en vigueur), et au concentré micromolesentrations (par exemple 50-200 pM) dans la plupart des liquides extracellulaires 14,15.

Dans des conditions physiologiques, l'ascorbate subit typiquement une oxydation à un électron réversible au radical ascorbyle libre (AFR, également connu sous le nom monodehydroascorbate ou semidehydroascorbate). Alors que l'AFR est un radical relativement stable 16, en l'absence de son rapide à un électron réduction enzymatique de retour à l'ascorbate, deux RAS peut encore dismuter à un ascorbate et un déshydroascorbate (DHA) 9,13,17. A l'intérieur de la cellule, le produit d'oxydation à deux électrons de l'ascorbate, le DHA, peut être rapidement ramené en arrière à l'ascorbate et de la glutathion-NAD (P) H-enzymatique de charge et des réactions non enzymatiques 13.

S'il est classiquement admis que seulement le rôle important de l'ascorbate dans le métabolisme du fer est de stimuler l'absorption alimentaire de fer non hémique 18, nous et d'autres avons fourni des preuves dece qui suggère que l'ascorbate trongly joue un rôle considérablement élargi dans le métabolisme de ce métal. Tout d'abord, l'ascorbate qui est libérée par les cellules de l'ascorbate-remplie semble jouer un rôle important dans la modulation de l'absorption du fer non lié à la transferrine par les cellules 19,20, et la preuve très récente indique que l'ascorbate module également l'absorption du fer lié à la transferrine par des cellules 21, cette dernière, qui correspond à une importante absorption physiologique de fer-voie 22.

Ascorbate est essentiel pour la fonction normale du système nerveux central chez les mammifères 23,24. En collaboration avec le cortex, de l'hypophyse, du thymus, de la rétine et du corps jaune surrénale, le cerveau contient des concentrations élevées de l'ascorbate par rapport à d'autres tissus de l'organisme 23,25-27. De plus, l'exposition à la fois les astrocytes et les cellules 28,29 analogues à des neurones 30 de glutamate est connu pour déclencher la libération de l'ascorbate dans l'espace extracellulaire, où l'ascorbatee est pensé pour aider à protéger les neurones contre la dysfonction neuronale induite par le glutamate 31. Bien que le mécanisme exact de induite par le glutamate-ascorbate de presse des astrocytes est inconnue, nous avons récemment apporté des preuves indiquant l'implication de la cellule gonflement causé par une capture de glutamate par le glutamate des astrocytes et de l'aspartate transporteur (GLAST, également appelée acide aminé excitateur transporteur isoforme 1 [EAAT1 ] chez l'homme) et l'activation consécutive de osmolyte et d'anions canaux de volume sensible (VSOACs) qui sont perméables à de petits anions organiques tels que l'ascorbate 32. Les identités moléculaires des conduits de membranes plasmatiques impliquées dans la formation VSOAC restent à identifier 33,34.

Bien que de nombreux essais ont été développées pour la détermination de l'ascorbate dans des échantillons biologiques, qui comprennent les dosages spectrophotométriques, fluorimétriques et 35,36 chromatographiques, il existe une grande variabilité dans la spécificité, la sensibilité, interference par les contaminants chimiques, la gamme linéaire efficace et la stabilité de l'analyte du point de terminaison. En outre, d'autres facteurs importants qui influent sur le choix de test sont la rapidité, la facilité d'utilisation et l'accès à un équipement relativement spécialisé, comme une chromatographie liquide à haute performance (CLHP) appareil.

Ici, nous présentons un dosage simple et hautement spécifique microplaque colorimétrique pour la détermination de l'ascorbate intracellulaire dans des cellules cultivées, ainsi que d'un essai séparé pour la détermination de l'ascorbate-efflux de cellules en culture. Le dernier test a pour but de contourner le problème de la sous-estimation de l'ascorbate de presse à partir de cellules en raison de ré-absorption rapide de l'ascorbate libéré par les transporteurs d'ascorbate de sodium-dépendant (SVCTs). Bien que ces deux méthodes ont fait leur apparition dans certaines de nos publications précédentes 19,20,32,37,38, ce manuscrit fournit un ensemble explicite des instructions et des lignes directrices pour leur exécution effective.

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Protocol

1. Déterminer ascorbate intracellulaire dans les cellules cultivées

  1. culture cellulaire et la récolte
    1. Cultivez suspension (par exemple érythroleucémique humaine, K562) ou des cellules adhérentes (par exemple, les astrocytes primaires) en utilisant des procédures standard de culture 19-21,32,38. Remarque: pour assurer cellules contiennent ascorbate, charger les cellules en culture avec de l'ascorbate soit comme l'ascorbate ou DHA 33,39.
  2. Créez un extrait cellulaire contenant de l'ascorbate-
    1. Incuber un nombre approprié de tampon phosphate salin de suspension (PBS) à la chaux ou de cellules adhérentes avec 450 pi de glacée cellulaire perméabilisation tampon [CPB; 0,1% (p / v) de saponine dans du PBS; 4 ° C]. Remarque: Déterminer le nombre de cellules nécessaires pour obtenir une valeur d'absorbance dans la plage linéaire du dosage (voir ci-dessous) de façon empirique par l'utilisateur final. Remarque: les extraits de tissus peuvent également être utilisés (voir discussion pour plus de détails).
    2. Agitacellules te sur la glace pendant 10 minutes pour assurer la lyse cellulaire complète.
    3. Créer un extrait intracellulaire contenant de l'ascorbate-clarifiée par élimination des débris cellulaires par centrifugation du lysat brut à 16 000 xg pendant 5 min dans une microcentrifugeuse réfrigérée (4 ° C).
    4. Retirez délicatement 4 x 100 aliquotes de chaque échantillon et ajouter à une séquence horizontale de puits dans une plaque 96 puits à fond plat qui contient soit 25 pl / puits de PBS ("-AO") uniquement ou 25 pl / puits de 45,5 U / ml solution mère de L-ascorbate-oxydase (AO) dans du PBS ("+ AO"). Remarque: cela devrait être fait en parallèle avec la préparation des normes (voir ci-dessous).
  3. Ascorbate standard courbe construction (doit être construit à nouveau pour chaque essai)
    1. Préparer une solution stock de 10 mM d'acide ascorbique dans PBS glacé. Remarque: Vérifier la concentration d'ascorbate par spectrophotométrie en utilisant une cuvette de quartz avec un 1cm de longueur de chemin à 265 nm (coefficient d'extinction = 14,5 mM -1 cm -1) 40.
    2. Préparer avec soin une série de normes d'ascorbate entre 0 et 20 uM.
    3. En parallèle à l'étape 1.2.4, retirez soigneusement 4 × aliquotes 100 ul de chaque norme et ajouter à une séquence horizontale de puits dans une plaque 96 puits à fond plat qui contient 25 pl / puits de PBS ("-AO») ou une 45,5 U / ml de solution de AO dans du PBS ("+ AO"). Note: 100 pi des normes d'ascorbate ci-dessus contiennent 0-2 nmol d'ascorbate. S'il vous plaît noter que le but de l'AO est de contrôler la contribution de réducteurs non-ascorbate de ferricyanure réduction.
  4. Déterminer ascorbate intracellulaire - Étape 1: éliminer sélectivement l'ascorbate et quantitativement oxyder ascorbate de ferricyanure
    1. Orbitale mélanger la plaque de 96 puits à 550 rpm à température ambiante pendant 5 min dans l'obscurité en recouvrant la plaque en aluminium. Remarque: Tson étape devrait oxyder tout ascorbate dans les puits "+ AO" à DHA. Les puits "-AO" devraient être affectés.
    2. Ajouter 50 ul de 3,5 mM de ferricyanure de potassium (ci-après dénommé "le ferricyanure») dans du PBS à chaque puits. La finale [ferricyanure] = 1 mM. Remarque: Utilisez un multipipettor.
    3. Orbitale mélanger la plaque à 550 rpm à température ambiante pendant 5 min dans l'obscurité. Remarque: Cette étape doit conduire à la réduction de ferricyanure en ferrocyanure par l'ascorbate dans un rapport stoechiométrique de deux molécules de ferricyanure réduits par une molécule d'ascorbate oxydé.
    4. Ajouter immédiatement 25 pi d'une solution fraîchement construit contenant 50% (v / v) d'acide acétique et 30% (p / v) d'acide trichloroacétique (TCA). Remarque: Utilisez un multipipettor.
  5. Déterminer ascorbate intracellulaire - Etape 2: quantifier la quantité de ferrocyanure formé 37
    1. Ajouter 100 ul de solution de ferrocyanure 37 détermination de each bien. Note: Une solution de travail doit être faite immédiatement avant utilisation: 2 ml de 3 M d'acétate de sodium (pH 6,0); 0,5 ml d'acide acétique glacial (~ 17,4 M d'acide acétique); 2 ml de 0,2 M d'acide citrique; 2 ml de 3,3 mM FeCl 3 à 0,1 M d'acide acétique; 1 ml de 30 mM Ferene-S. Le volume final de cette solution de travail doit être de 7,5 ml.
    2. Orbitale mélanger la plaque dans l'obscurité à 550 tours par minute pendant 30 min à température ambiante.
    3. Lire les valeurs d'absorbance des puits à 593 nm (c'est à dire le maximum d'absorbance du Fe (II) (Ferene-S) 3 complexe).
    4. Calculez le montant de l'ascorbate intracellulaire nmoles ascorbate par million de cellules en soustrayant d'abord les A 593 valeurs nm pour les puits de la '+ AO' des correspondants - puits "AO" pour chaque échantillon, puis l'interpolation de la courbe standard de l'ascorbate (voir l'étape 1.3 ). Lors de la construction de la courbe standard, tracer cette «valeur de la différence» pour chaque norme sur le montant des ascorbmangé par puits.

2. Détermination de l'ascorbate-efflux de cellules en culture

  1. culture cellulaire et la récolte
    1. Cultivez suspension ou de cellules adhérentes comme ci-dessus (voir l'étape 1.1). Remarque: effectuer le dosage ci-dessous dans un format plat de 24 puits avec la suspension et les cellules adhérentes pour obtenir les meilleurs résultats.
    2. cellules en suspension Resuspendre, ou de superposer les cellules adhérentes, avec 400 ul de pré-chauffé une solution saline tamponnée par HEPES, avec ou sans calcium et magnésium, et contenant 5 mM de D-glucose (HBS / D; pH 7,3, 37 ° C) dans des puits d'une plaque de 24 puits. Ajouter le même volume de HBS / D pour puits sans cellules spécifiées sur chaque plaque de 24 puits à examiner. Remarque: ce dernier servira de contrôles exempts de cellules pour la réaction de base (voir ci-dessous).

3. Déterminer le montant de l'ascorbate Paru

  1. Les solutions mères suivantes doivent être préparées à l'avance: 120U / ml AO dans HBS / D (préparer frais); 2,4 mM Ferene-S dans HBS / D; 120 uM FeCl 3 et 600 um Na-citrate dans HBS / D (préparer immédiatement de solutions mères plus concentrées).
  2. Pour démarrer la réaction de ferrireduction (volume final par puits devrait être 600 pi), ajouter les volumes de réactifs aux puits individuels contenant déjà 400 pi de HBS / D suivants:
    1. Ajouter 50 ul de AO (120 U / ml) ou HBS / D pour le jumelage des puits en triple exemplaire. La concentration finale doit être de 10 AO U / ml. Remarque: Étiquette jumelé puits comme "- AO» et «+ AO".
    2. Mélanger les plaques avec un mélange orbital douce pendant 5 min à 37 ° C.
    3. Ajouter 50 ul de 2,4 mM Ferene-S dans tous les puits. La concentration finale Ferene-S devrait être de 200 uM. Mélanger les plaques comme ci-dessus pendant 5 minutes à 37 ° C.
    4. Ajouter 50 ul de fraîchement préparé 120 uM citrate ferrique. La finale en fer et concentrations de citrate devraient être 10 uM fer et 50 uM citrate. Mélangez bien.
    5. En trois puits de contrôle triple, aspirer le milieu de recouvrement et ajouter 600 ul HBS / D contenant 0,1% de saponine. Remarque: Ceux-ci serviront de «100% des cellules lyse" contrôles pour une lactate déshydrogénase (LDH) version d'essai qui se déroulera en parallèle (voir ci-dessous).
    6. Incuber pendant 60 min à l'obscurité à 37 ° C.
    7. A la fin de l'essai d'efflux-ascorbate, aspirer rapidement 500 ul de chaque puits et ajouter marquée de manière appropriée à des puits dans une plaque à 24 puits. Note: pour les cellules en suspension, éliminer initialement les cellules par centrifugation à 4 ° C.
    8. Ajouter 300 aliquotes du surnageant à une plaque de 96 puits et ensuite lire à 593 nm.

    4. Détermination de l'ascorbate extracellulaire

    1. Lire les valeurs d'absorbance des puits à 593 nm.
    2. Calculer la quantité d'ascorbate extracellulaire comme l'ascorbate nmoles par mg de protéine (ou par million de cellules), comme décrit pour la détermination de l'ascorbate intracellulaireà l'étape 1.5.4. Remarque: l'utilisateur final doit optimiser les conditions pour que l'ascorbate de presse n'est pas limitée par l'ascorbate intracellulaire.

    5. Détermination de la LDH de sortie

    1. Avec les 200 ul restants de la solution extracellulaire à partir de chaque échantillon, effectuer un dosage de libération de LDH 32,41 pour déterminer l'étendue de la lyse cellulaire. Remarque: le calcul en% de la LDH libérable totale. Déterminer LDH libéré à partir des échantillons qui ont été traités avec 0,1% de saponine.

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Representative Results

Détermination de l'ascorbate intracellulaire dans les cellules de suspension de culture

Dans le premier essai (figure 1), l'ascorbate intracellulaire est déterminée, à la suite de l'ascorbate-spécifique (c.-à-AO-sensible) la réduction du ferricyanure en ferrocyanure, à l'aide de la détermination hautement sensible de ferrocyanure par un mode opératoire déjà publié 37. La détection de l'ascorbate est basée sur la colorimétrie chélation du fer ferreux qui est générée par la réduction de l'ascorbate-dépendante de ferricyanure en ferrocyanure, suivi par la réduction du fer ferrique en fer ferreux par ferrocyanure. Comme concentrations supra-physiologiques de certains ions métalliques divalents (par exemple Cu 2 +, Co 2 + et Zn 2 +) peuvent interférer, probablement en compétition avec le fer ferreux pour la chélation par Ferene-S, des précautions appropriées doivent être prises dans de telles conditions 37.

FigureLa figure 2 montre une courbe standard pour un ensemble de normes d'ascorbate 0-20 uM (ou 0-2 ascorbate nmol par puits de la plaque de 96 puits; voir l'étape 6.5 dans le «Protocole»).. Bien que non représenté sur cette figure, la linéarité est maintenue jusqu'à 8 nmoles ascorbate par puits (à savoir un filet A 593 nm de ~ 1,6), ce qui correspond à une concentration en ascorbate échantillon de ~ 80 pM. Le dosage peut être utilisé avec succès pour détecter des taux d'ascorbate inférieure à 0,25 nmole ascorbate par puits (2,5 uM de concentration de l'échantillon de l'ascorbate).

Cellules K562 s'accumulent rapidement ascorbate intracellulaire de extracellulaire DHA, mais pas ascorbate (voir la figure 3; reproduit avec la permission de Lane et Lawen 2008 19). Dans cette expérience représentative, les cellules K562-PBS lavées (4 x 10 6 cellules / ml) ont été incubées dans du PBS avec 500 uM d'ascorbate soit (Asc), DHA, DHA + 50 uM de cytochalasine B (CB + DHA), Asc + 5 mM de ferricyanure (Asc / FIC) ou Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) pendant 30 min à 37 ° C. Ascorbate intracellulaire a été déterminée comme décrit dans le «Protocole».

DHA absorption par les cellules K562 se fait par transporteur facilitation de glucose (GLUT) médiée par le transport (voir la figure 4; reproduit avec la permission de Lane et Lawen 2009 42). Pour évaluer l'implication de GLUT en DHA absorption dans cette expérience représentative, les cellules K562 ont été incubées avec des concentrations croissantes de la cytochalasine B (CB) ou dihydrocytochalasine B (H 2 CB) dissous dans du MBS contenant de l'éthanol à 0,5% pendant 15 min à 37 ° C avant à incubation avec 400 uM de DHA pendant 30 min à 37 ° C dans le même milieu (Fig. 4A). Les cellules ont ensuite été lavées trois fois dans 100 volumes du MBS glacées et leur ascorbate intracellulaire déterminés comme décrit dans le «Protocole». Il est important de noter alors que les deux CB et H 2 CB inhibent les processus mobiles à micromolesconcentrations (1 à 100 pM), seulement CB, qui diffère de H 2 CB par la présence d'une double liaison unique, inhibe le transport de GLUT-dépendante à des concentrations micromolaires faibles (1-10 uM) 43. Par conséquent, comme le DHA absorption était inhibée par CB avec un IC 50 <2,5 pM, mais n'était pas inhibée par H 2 CB, DHA absorption se produit probablement par GLUT-transport médié par 38. En variante, la figure 4B, les cellules lavées ont été exposés à des concentrations croissantes de la GLUT-transportable, mais non métabolisable glucose analogique 3 - O-méthyl-D-glucose (3-OMG) ou la non-transportable glucose GLUT-stéréoisomère L - glucose avant l'incubation avec la DHA en tant que panneau A. De nouveau, les résultats indiquent l'implication de GLUT en DHA importation que l'inhibition de l'accumulation intracellulaire d'ascorbate se produit seulement en présence de l'analogue de glucose GLUT-transportable.

Déterminationtion de l'ascorbate-efflux de cellules adhérentes

Dans le deuxième essai, le taux d'ascorbate-efflux de cellules en culture peut être déterminée. Ce test spécifique est important que la libération de l'ascorbate de cellules semble être cruciale pour l'absorption cellulaire ascorbate réglementés de fer non lié à la transferrine par les cellules 19,20. L'absorption du fer non lié à la transferrine est considérée comme étant pertinente pour la pathophysiologie des troubles de surcharge en fer, tels que les hemochromatoses 22, ainsi que d'astrocyte-neurone échange et de l'homéostasie du fer dans le cerveau des mammifères 22. En effet, nous avons récemment montré que le principal neurotransmetteur excitateur, L-glutamate, déclenche la libération de l'ascorbate de astrocytes d'une manière qui dépend de l'absorption du L-glutamate GLAST et par un gonflement cellulaire subséquente qui déclenche la libération de l'ascorbate par VSOACs putatifs 32. Par analogie, l'ascorbate rresse à partir des astrocytes d'ascorbate-chargé peut être stimulée par l'acide aminé excitateur, L-aspartate, mais pas l'acide aminé L-glutamine non-excitateur. Cet effet est représenté sur la figure 5 (reproduit avec la permission de Lane et Lawen 2012 32), qui montre les courbes dose-réponse pour la stimulation de l'ascorbate (AA) la libération par l'aspartate (cercles pleins) et la glutamine (cercles vides) de cultures primaires de ascorbate chargé astrocytes de souris.

Il est important de discuter de la façon dont cet essai ascorbate efflux diffère de l'essai prévu pour la détermination de l'ascorbate intracellulaire. La différence majeure réside dans le fait que le niveau de l'ascorbate restant en solution n'est pas déterminé par une réaction chimique réalisée à la fin d'un point de temps donné, comme c'est le cas pour la méthode de détermination de l'ascorbate intracellulaire. Au lieu de cela, une «signature réductrice" est accumuléeau cours de la période pendant laquelle l'ascorbate est libérée à partir des cellules. Cette signature réductrice est capturée sous la forme de la réduction de l'ascorbate-dépendante de citrate ferrique extracellulaire suivie par la chélation rapide du fer ferreux en tant que grand-impermeant membrane extracellulaire et [Fe (II) (Ferene-S) 3] 4 - chélate . Ferene-S peuvent être considérés de manière similaire à la membrane impermeant au cours de la courte période de l'essai. Les niveaux de ce complexe chromogène peuvent alors être déterminées comme une mesure de point de terminaison. Comme seuls les niveaux AO-sensibles de ce chélate sont déterminées, l'analyse fournit un degré élevé de spécificité pour la détermination de L-ascorbate extracellulaire.

Figure 1
Figure 1. Schéma montrant les principales étapes du protocole dela détermination de l'ascorbate intracellulaire.

Figure 2
Figure 2 Une courbe standard pour un ensemble de normes d'ascorbate 0-20 um..; Barres d'erreur (ou 0-2 ascorbate nmol par puits de la plaque de 96 puits. Voir l'étape 6.5 dans le «Protocole») ne sont pas représentés comme ils sont dans la plage occupée par les symboles.

Figure 3
Figure 3. K562 cellules s'accumulent rapidement ascorbate extracellulaire intracellulaire de DHA, mais pas les cellules K562 ascorbate. PBS-lavés (4 x 10 6 cellules / ml) ont été incubées dans du PBS avec 500 pM of soit ascorbate (Asc), DHA, DHA + 50 uM cytochalasine B (DHA + CB), mM ferricyanure Asc + 5 (Asc / FIC) ou Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) pendant 30 min à 37 ° C. Ascorbate intracellulaire a été déterminée comme décrit dans le «Protocole». Les résultats sont présentés au moyen de trois expériences individuelles (+ SD). * La concentration d'ascorbate intracellulaire a été estimé en utilisant un espace d'eau intracellulaire pré-déterminée pour des cellules K562 (c.-à ~ 1,6 μl/106 cellules) 19,20. Ce chiffre a été reproduit avec l'autorisation de Lane et Lawen 2008 19.

Figure 4
Figure 4. DHA absorption par les cellules K562 produit par transporteur de glucose de facilitation (GLUT) le transport à médiation. Cellules K562 qui ont été cultivés à 6-8 x 10 6 cellules / ml dans du RPMI + 10% (v / v) de sérum bovin foetal à 37 ° C, 5% CO 2 et 95% d'air ont d'abord été lavé trois fois avec de MBS. Les cellules lavées ont ensuite été exposés à des concentrations de cytochalasine B (CB; Sigma) augmenter ou dihydrocytochalasine B (H 2 CB) dissous dans une solution saline Mops tamponnée (MBS, 137 mM NaCl, KCl 2,7, 15 mM MOPS-Na +, pH 7,3 ) contenant 0,5% d'éthanol avant l'incubation avec 400 uM de DHA pendant 30 min à 37 ° C (A). Les cellules ont ensuite été lavées trois fois dans 100 volumes du MBS froid et leur ascorbate intracellulaire déterminés comme décrit dans le «Protocole». Comme DHA absorption était inhibée par CB, mais pas de H 2 CB, DHA absorption se fait par transport GLUT-médiation. En variante, dans (B), les cellules lavées ont été exposés à des concentrations croissantes de la GLUT-transportable, mais non métabolisable glucose analogique 3 - O-méthyl-D-glucose (3-OMG) ou le stéréo-isomère du glucose GLUT-non-transportable (A). Là encore, les résultats indiquent la participation de GLUT en DHA absorption. Ce chiffre a été reproduit avec l'autorisation de Lane et Lawen 2008 42.

Figure 5
Figure 5. Ascorbate libération des astrocytes d'ascorbate-chargé est stimulée par l'acide aminé L-aspartate excitateur, mais pas l'acide aminé L-glutamine non-excitateur. Cette figure montre des courbes dose-réponse pour la stimulation de l'ascorbate (AA) libération par aspartate (cercles pleins) et à la glutamine (cercles ouverts) à partir de cultures primaires d'astrocytes de souris ascorbate-chargé. Les données présentées sont des moyennes (± écart type) de trois expériences. P <0,001 vsla condition de «base». Ce chiffre a été reproduit avec l'autorisation de Lane et Lawen 2012 32.

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Discussion

Dans ce document, nous présentons deux dosages colorimétriques des microplaques rapides, précis et relativement sensibles pour la détermination de l'ascorbate dérivé de compartiments intra-et extracellulaires dans les cellules cultivées. Les analyses peuvent être complétées par l'accès aux équipements et réactifs de laboratoire standard. Le réactif que modérément coûteux requis pour le dosage est AO, qui est essentielle, car elle donne un degré élevé de spécificité analyte vers L-ascorbate. Les dosages sont bien adaptés à soit des cellules de suspension (par exemple K562) ou des cellules adhérentes (par exemple HepG2 ou les astrocytes primaires de rongeurs), et ont été employés avec succès dans des publications antérieures utilisant de telles cellules 19,20,32,37,38. L'utilisation d'autres agents oxydants ascorbate (par exemple tempol) à la place de AO doit être évitée car ils ne sont pas suffisamment précis pour L-ascorbate. En outre, l'utilisation de composés tels queTempol dans le dosage de l'ascorbate-presse sera confondu par la capacité de Tempol de traverser les membranes cellulaires et oxyder l'ascorbate intracellulaire 44. AO est essentiellement membrane imperméant sur les durées utilisées.

Nous avons effectué une comparaison directe des résultats obtenus avec le dosage colorimétrique de l'ascorbate décrit ci-dessus et la détermination fluorométrique de l'ascorbate de Vislisel et collègues 36. Nous avons constaté que les deux essais ont donné des résultats identiques pour l'essai de détermination de l'ascorbate intracellulaire (données non présentées). Fait intéressant, le dosage de l'ascorbate de libération décrit ci-dessus a donné des valeurs nettement plus élevées pour le taux apparent de l'ascorbate efflux qu'avec le test de point de terminaison fluorimétrique. Ceci suggère que le dosage de l'ascorbate-efflux décrit ici permet la détermination de apparent "ascorbate-efflux» qui n'est pas aussi facilement confondu par la probabilité de l'ascorbate de réabsorption par les cellules; un processus qui implique probablement plasma SVCTs membranaires. Cette ré-absorption aurait tendance à provoquer une sous-estimation des niveaux réels de l'ascorbate qui ont été libérés au cours d'une période donnée si une mesure point de terminaison de l'ascorbate a été prise. Il convient de noter que, si les échantillons de tissus (par exemple, muscle, du poumon ou du cerveau) sont à utiliser à la place des cellules cultivées pour l'essai de détermination de l'ascorbate intracellulaire, puis un homogénat de tissu doit être construite en utilisant glacée CPB et une certaine forme de rupture mécanique ( par exemple dounce homogénéisation, pointe de sonde ultrasons, presse française, etc.). Les débris cellulaires devrait être éliminé par centrifugation et l'utilisateur devrait envisager la nécessité éventuelle de déprotéinisation et / ou l'ajout d'inhibiteurs de la protéase échantillon avant de procéder à l'étape 1.2.4.

Nous avons également signalé des concentrations auparavant que de faibles micromolaires de cytochalasine B (<10 M) n'a pas inhibé le taux apparent de l'ascorbate-efflux qui ont été détectés par le test 32 19, 20,38.

Il ya plusieurs étapes essentielles dans ces protocoles. Tout d'abord, les tests décrits ici dépendent de façon critique de la capacité des AO pour éliminer sélectivement et rapidement ascorbate dans des échantillons appariés. Si l'activité spécifique de la préparation de AO est nettement inférieure à l'activité nominale et hypothétique, il est possible que la totalité de l'ascorbate dans le contenant AO-sexemples seront supprimés. Cela peut conduire à une sous-estimation de la quantité d'ascorbate dans les échantillons inconnus si vous utilisez la «méthode directe» pour calculer le montant de l'ascorbate présente. Toutefois, si l'on utilise la «méthode standard courbe", ce qui est recommandé, de faible activité des préparations de AO ne fera que conduire à une perte de dosage sensibilité. Nous avons trouvé que de bons résultats sont obtenus en utilisant constamment les préparations de AO construits par dissolution de 1,000 U de AO dans 1 ml de PBS ou MBS, qui est ensuite divisée en aliquotes de 100 pi qui sont stockés à -80 ° C pendant pas plus d' un mois. Par ailleurs, comme AO est une protéine qui peut être dégradée de manière protéolytique par des lysats de cellules, des inhibiteurs de protease peuvent être ajoutés à des lysats de cellules avant l'addition des lysats dans les puits contenant AO. Cela peut être une modification utile d'envisager l'utilisation de lysats de cellules ou de tissus qui sont riches en activité de la protéase.

De plus, la sensibilité des essais a décrit unBove dépend largement de l'utilisation du bidenté chromogène Fe (II)-chélateur, Ferene-S. Cet agent chélatant peut être remplacé par des chélateurs chimiquement similaires, comme ferrozine et bathophenanthroline disulfonate, mais avec une diminution de la sensibilité correspondant au coefficient d'extinction de la Fe (II) chelate 37. En outre, il faut prendre soin lors de l'utilisation bathophénanthroline disulfonate, comme il semble conduire à des taux plus élevés de ferrireduction autocatalytique apparente dans la présence de complexes de citrate de fer que Ferene-S ou Ferrozine 37,45. Cette préoccupation est pertinente dans le cas du dosage de libération de l'ascorbate comme l'aspect non-ascorbate-dépendante du Fe (II) chelate va diminuer la sensibilité de l'essai.

Alors que le dosage de l'ascorbate-mêmes intracellulaire est compatible avec les cellules adhérentes, le détachement de ces cellules avant la lyse cellulaire doit être effectué par grattage mécanique plutôt que de la trypsine / EDTA. Que la trypsine est une proteaseil sera probablement interférer négativement avec l'étape de l'ascorbate-déplétion avec AO, dont le dernier est une protéine. En outre, l'EDTA sera probablement interférer avec l'étape de détermination de FOC en chélatant le fer en concurrence avec Ferene S-37. De tels agents doivent être évités. Enfin, le dosage de l'ascorbate de libération pourrait être facilement adapté pour des cellules en suspension. Au lieu d'aspirer hors de la sus-jacente de Fe (II) (Ferene-S) 3-chélate contenant à la fin de l'essai, les cellules devraient être rapidement sédimenté par centrifugation comme pour le dosage de l'ascorbate-mêmes intracellulaire. L'absorbance à 593 nm du surnageant doit alors être déterminée.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants au Dr Stephen Robinson et Mme Hania Czerwinska (Monash University) pour l'offre généreuse de cultures d'astrocytes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc 96-well flat-bottom plates Thermo 269620 Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge Eppendorf 5415D A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge Eppendorf 5810R Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer Bio-Rad Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) Eppendorf This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer Sigma-Aldrich 30790 Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762 Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO) Sigma-Aldrich A0157 Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC) Sigma-Aldrich 455989 Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) Sigma-Aldrich 92940
Sodium L-glutamate Sigma-Aldrich
L-glutamine Sigma-Aldrich
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate

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References

  1. Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. (2006).
  2. Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
  3. Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
  4. Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
  5. Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
  6. Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
  7. May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
  8. Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
  9. Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
  10. Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
  11. Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
  12. Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
  13. Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
  14. May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
  15. Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
  16. Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
  17. May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
  18. Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
  19. Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
  20. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
  21. Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
  22. Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
  23. Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
  24. Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
  25. Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
  26. Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
  27. Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
  28. Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
  29. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  30. May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
  31. Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
  32. Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
  33. Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
  34. Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
  35. Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
  36. Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
  37. Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
  38. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
  39. Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
  40. Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
  41. Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
  42. Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
  43. Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
  44. May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
  45. Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).

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