Thérapie à base de cellules pour l'insuffisance cardiaque chez le rat: Double thoracotomie pour infarctus du myocarde et épicardique implantation de cellules et Biomatrice

Bioengineering

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Summary

L'implantation d'un biograft pour traiter l'infarctus du myocarde induite par la ligature LAD dans un modèle de rongeur est classiquement requise des deux opérations à cœur ouvert. Afin de réduire la mortalité et de fournir des conditions optimales pour la fixation de biomatrices gélatineuses solides et associés à des cellules, des procédures minimalement invasives ont été développées.

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Frobert, A., Valentin, J., Cook, S., Lopes-Vicente, J., Giraud, M. N. Cell-based Therapy for Heart Failure in Rat: Double Thoracotomy for Myocardial Infarction and Epicardial Implantation of Cells and Biomatrix. J. Vis. Exp. (91), e51390, doi:10.3791/51390 (2014).

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Abstract

La thérapie cellulaire cardiaque a suscité un intérêt et l'implantation de biomatériaux associés à des cellules de plus en plus est devenu un enjeu majeur pour optimiser la prestation des cellules myocardiques. modèle de rongeur de l'infarctus du myocarde (IM) constitué de gauche artère interventriculaire antérieure (AIA) ligature a généralement été réalisée via une thoracotomie; une deuxième opération à cœur ouvert via une sternotomie est traditionnellement réalisée à une application épicardique du traitement. Depuis la description de modèle de ligature LAD, le taux de mortalité post-opératoire a chuté de 35 à 13%, mais la deuxième chirurgie est restée critique. Afin d'améliorer la récupération post-opératoire et de réduire la douleur et l'infection, les procédures chirurgicales minimalement invasives sont présentés. Deux thoracotomie ont été réalisées, une première pour la ligature LAD et le second pour le traitement administration épicardique. Biografts constitués de cellules associées à des matrices solides ou de type gel ont été appliqués sur l'ar infarciech. CONT ligature a entraîné la perte de la fonction cardiaque telle que confirmée par échocardiographie réalisée au bout de 2 et 6 semaines. Goldner coloration au trichrome effectué sur des sections de coeur confirmé la formation de cicatrices transmurale. Des premier et second chirurgies entraîné moins de 10% de la mortalité post-opératoire.

Introduction

Depuis la fin du 19 e siècle, les maladies cardiovasculaires est resté le numéro un tueur en série dans les pays industrialisés. Parmi ceux-ci, d'une maladie de l'artère coronaire représente l'étiologie principale. Les résultats de la phase aiguë de l'infarctus du myocarde (IM) et est suivi par le remodelage inadapté qui se développe progressivement vers une phase chronique et une insuffisance cardiaque sévère. Malgré les progrès technologiques et thérapeutiques significatifs récents, la morbidité et la mortalité dues à la progression de l'insuffisance cardiaque est encore en croissance 1. Dans ce contexte, la thérapie cellulaire a acquis un intérêt croissant en tant que nouvelle option thérapeutique pour stopper la progression de la maladie vers l'insuffisance cardiaque et à stimuler la capacité de régénération a récemment identifié du myocarde. Des études expérimentales et cliniques ont fourni des preuves convaincantes des effets bénéfiques obtenus après transplantation cardiaque de divers types de cellules. Les principaux résultats figurent l'amélioration de cardila fonction contractile alternatif, une diminution de remodelage ventriculaire gauche, diminution de la taille de l'infarctus, et a augmenté la densité vasculaire dans la zone infarcie. Toutefois, le nombre de cellules à faible rétention après l'injection des cellules est resté un inconvénient important. Association de cellules avec une biomatrice pour améliorer la prestation de la cellule 2 ont récemment favorisé chercheur et intérêts cliniques.

La ligature de la descendante antérieure gauche de l'artère coronaire (DAL) est une méthode de référence pour MI en petit modèle animal qui se traduit par infarctus transmural et une cicatrice mature. La thérapie cellulaire appliqué dans la phase chronique de la MI nécessite une deuxième intervention chirurgicale. Une sternotomie médiane est généralement réalisée pour permettre l'injection intramyocardique de l'implantation des cellules ou de biografts épicardique. Ces procédures chirurgicales invasives augmentent le taux de mortalité post-opératoire temps de récupération, la douleur et le risque d'infection. L'approche mini-invasive présentée ici non seulement empêche une telle partialité, mais fournit également des oaccessibilité ptimal du cœur pour l'application du traitement. MI et l'implantation épicardique de cellules associées à une biomatrice de type gel sont effectuées sur un coeur battant par thoracotomie intercostale gauche.

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Protocol

REMARQUE: Lewis rats mâles et femelles, 200-220 g ont été logés dans des conditions standard de laboratoire (lumière de 12 h et le cycle sombre, l'eau ad libitum et alimentaires, IVC cage). Tous les animaux ont été traités en conformité avec les recommandations de la FELASA et la loi suisse sur la protection des animaux.

1 Préparation des cellules: les cellules souches mésenchymateuses isolement de moelle osseuse

  1. Anesthésier les rats avec de l'isoflurane à 5% de O 2 et 5 l / min dans une chambre d'induction pendant 5 min. Placer le museau de l'animal dans un cône d'entrée connecté au système d'anesthésie. Effectuer un orteil ou pincement de la queue pour confirmer la sédation.
  2. Enlevez la peau de la jambe avec des ciseaux en coupant la peau de la cheville à la hanche. Enlever les muscles et couper l'artère fémorale pour la saignée des animaux. Exposer l'articulation de la hanche et disloquer la tête du fémur. Il est important de ne pas endommager la tête du fémur. Placer les os dans du PBS stérile dans un tube en plastique de 50 ml.
  3. Retirez tous les muscles et les ligaments des os sans les casser. NOTE: Il est important que l'os reste intacte pour éviter liaison de solution de rinçage ou une contamination par de l'éthanol. Rincer les os pelées éthanol à 70% pendant 5 min.
  4. Sous la hotte à flux laminaire stérile, couper les deux extrémités des os avec des ciseaux. Rincer la moelle osseuse par injection de PBS stérile de l'extrémité de l'os. Recueillir osseuse dans un tube de 15 ml. Centrifugeuse 7 min à 300 x g.
  5. Eliminer le surnageant. Suspendre le culot dans 3 ml de tampon de lyse Rouge de cellules sanguines. Incuber la suspension pendant 1 min à température ambiante avant de tourner à nouveau pendant 7 minutes à 300 x g. Dans un ballon de 150 ml de culture, ajouter un milieu de culture cellulaire stérile (395 ml de milieu IMDM, 5 ml de pen / strep, 100 ml de FBS) et ensemencer les cellules.
  6. Changer le milieu de la deuxième journée pour éliminer les cellules non-adhérentes.
    1. Effectuer changements de milieu tous les deux jours pendant deux à trois semaines jusqu'à ce que la quantité de cellules désiré soit obtenu.
    2. Sinon, préparer la biograft par grainesment les cellules sur la matrice solide comme nécessaire et décrit par ailleurs 3.
  7. Le jour de l'implantation cardiaque, préparer les cellules ou récolter le biograft juste avant l'application épicardique.
    1. Recueillir les cellules en utilisant Accutase solution de détachement cellulaire. Compter les cellules. Remplir un tube à centrifuger de 1,5 ml avec le volume de la suspension cellulaire pour obtenir une quantité calculée de la cellule souhaitée. Centrifuger pendant 7 min à 300 g et éliminer le surnageant.
    2. Sinon, récolter le biograft de milieu de culture cellulaire, rincer dans du PBS stérile, et garder dans un milieu de culture frais sans sérum.

2 Première thoracotomie et LAD ligature

  1. Peser le rat. Mettez le coussin chauffant à 37 ° C. Anesthésier le rat avec 5% d'isoflurane et 5 l / min à 100% de O 2 dans une chambre d'induction de 5 à 7 min. Effectuer un orteil ou pincement de la queue pour confirmer la sédation. Placer le rat sur le coussin chauffant.
  2. Intuber l'animal avec un 14G iv cathéter. Raccorder le cathéter d'intubation à un ventilateur de rongeur programmé pour 2,5 L / min d'oxygène, 2,5% d'isoflurane, le volume courant de 2 ml, et une fréquence respiratoire de 90 respirations / min.
  3. Préparer une solution de buprénorphine à 0,1 mg / kg. Injecter en sous-cutané d'un tiers de la solution. Raser la partie gauche du thorax. Désinfecter avec une solution à 1% de Betadine.
  4. Inciser la peau perpendiculairement au sternum à la quatrième espace intercostal. Séparez les 3 couches de muscle thoracique (grand pectoral, ordre croissant pectoral, et pectoral oblique externe). Ouvrir le quatrième espace intercostal (entre les nervures 4 et 5).
  5. Utilisez un petit écarteur pour écarter les côtes et à exposer le cœur. Ouvrez le péricarde attentivement. Recherchez et ligaturer descendante antérieure gauche artère coronaire (DAL) avec un 7,0 mm suture 4 ci-dessous l'atrium.
  6. Fermez l'espace intercostal avec deux points à l'aide de 3,0 points de suture. Placez les deux points de suture proximale et distale du sternum. Tout d'abord, tighten la suture distale. Fixer la tubulure d'échappement du ventilateur pendant 2 s pour gonfler la poitrine et d'éviter toute pneumothorax. Serrer la deuxième suture. Placez les couches de muscles en place (pas de sutures sont nécessaires). Fermez la peau avec une suture 5.0.
  7. Désinfecter la suture avec une solution de Betadine 1%. Injecter le reste de la solution de buprénorphine. Éteignez le système d'anesthésie. Retirer intubation cathéter.
  8. Gardez le rat dans la cage sous une lampe chaude pendant 1-2 heures. Conserver un thermomètre dans la cage et de contrôler la distance entre la lampe et la cage chaud afin d'éviter toute surchauffe. Retour le rat dans l'unité IVC. Injecter par voie sous cutanée buprénorphine 0,05-0,1 mg / kg après chaque -operatively 6-12 h pendant 48 heures.

3. épicardique administration de la Via traitement seconde thoracotomie

  1. Répétez les étapes 2.1 à 2.3.
  2. Inciser la peau perpendiculairement au sternum à la cinquième espace intercostal. Séparer la couche 3s de muscle thoracique (grand pectoral, ordre croissant pectoral et grand pectoral oblique externe). Ouvrez le cinquième espace intercostal (entre les nervures 5 et 6).
  3. Utilisez un petit écarteur pour écarter les côtes et à exposer le cœur. Si il ya une certaine adhésion, les retirer soigneusement avec une pince fine.
  4. Localisez la zone de l'infarctus qui apparaît comme une zone pâle dessous de la ligature. REMARQUE: Si nécessaire, utiliser un morceau de 10 cm de fil de suture (7.0) inséré au sommet de mieux visualiser le ventricule gauche. Tirez doucement à la suture lâche maintenu par une pince pour exposer le cœur.
  5. Appliquer l'un des traitements suivants:
    1. Positionner la biograft à la surface du cœur. Utiliser la seringue pré-remplie d'agent d'étanchéité de fibrine préchauffée à la température ambiante pendant 10 min. Appliquez une goutte (50-100 pi) de la colle de fibrine sous la biograft aide d'une aiguille 25 G Luer. Vérifiez que le biograft est parfaitement étanche.
    2. Alternativement, appliquer le culot cellulaire recueilli avec une pipette à la surface of le cœur sur la zone pâle dessous de la ligature. Appliquer une goutte (50 à 100 pi) de la colle de fibrine sur le culot cellulaire.
  6. Retirez le morceau de suture à partir du sommet.
  7. Répétez les étapes 2,6-2,8.

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Representative Results

Tous les animaux ont récupéré dans 1 heure après thoracotomie. La cicatrisation des plaies a été rapide. Aucune infection ou un oedème a été observé.

La thoracotomie gauche double a permis un accès optimal à cœur (Figure 1). La douleur et la mortalité post-opératoire était faible. L'animal a récupéré rapidement de la chirurgie et a pris du poids (figure 2). Kaplan Meir pour cent de survie était de 96% pour la première thoracotomie. Quatre rats plus de 104 morts dans l'application suivante de 24 heures de traitement par une deuxième thoracotomie. Kaplan-Meir pour cent de survie varie de 100% à l'animal a reçu une seconde thoracotomie mais pas de traitement (factice), 96% de MSC et le groupe de colle de fibrine, ou de 86% lorsque l'animal a reçu MSC directement injecté à l'intérieur du myocarde (figure 3).

Mode M évaluation échocardiographique effectué 2 semaines après la ligature LAD a montré une réduction de la fraction de raccourcissement (FS) de 44 ± 3%à 22 ± 4%. La représentation de la fréquence des FS enregistrés sur 104 animaux deux semaines après ligature LAD fourni la preuve de la répétabilité de la méthode (Figure 4). Le coefficient de variation (CV) a été de 17%. En outre, l'échocardiographie réalisée à 2 et 6 semaines après la ligature LAD montré une progression vers l'insuffisance cardiaque suggérée par une réduction de la fraction d'éjection (FE) et une augmentation de volume LV en diastole et de systole (figures 4 et 5). Le développement d'un infarctus transmural dans le groupe opéré fictive a été confirmée par coloration de Goldner sections transversales de coeur (Figure 6).

Figure 1
Figure 1: (A) L'utilisation de l'enrouleur permis l'accès à l'cardiaque après thoracotomie. DAL ligature a été réalisée deux semaines plus tôtet la suture est visible (flèche). Demande de traitement a été réalisée avec épicardique extériorisation minimum du coeur. (B) Les cellules Pellet fixés avec une colle de fibrine ont été maintenus à la surface de la zone infarcie.

Figure 2
Figure 2: Daily postopératoire suivi a montré une perte de poids pendant 2 jours post-chirurgie. Récupération a été accompagnée d'un gain de poids chez tous les animaux. les variations de poids sont indépendants du type de traitement.

Figure 3
Figure 3 Kaplan-Meir graphique pour cent représentant la survie après la ligature LAD (A) et après le traitement par un deuxième thoracotomie (B) a montré que les deux cabinets ont abouti à la perte réduite d'animaux. groupe témoin représente animal sain qui n'avait pas de chirurgie. Deux semaines après la première thoracotomie, les animaux ont reçu soit une opération fictive, mais pas de traitement (factice), la colle de fibrine seule, les cellules fixées avec une colle de fibrine, ou les cellules directement injectées à l'intérieur du myocarde (MSC injecté).

Figure 4
Figure 4 (A) représentant M en mode images d'échocardiographie pré enregistrée (en bonne santé) et deux semaines après la ligature LAD (infarctus). Répartition (B) de la fréquence des valeurs de la fraction de raccourcissement enregistré deux semaines après la ligature LAD (n = 104).

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Figure 5 fonction cardiaque a été évaluée par échocardiographie 2dimentional (méthode de Simpson biplan) et a enregistré 2 et 6 semaines après la ligature LAD. Animal avait deux thoracotomie, mais n'a reçu aucun traitement. Moyenne ± écart-type ainsi que les valeurs individuelles sont représentées pour la fraction d'éjection (A) de volume LV en systole (B) et la diastole (C). Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'un test non paramétrique de Wilcoxon apparié.

Figure 6
Figure 6 représentant Goldner coloration montrant la cicatrice fibreuse (vert) et le myocarde viable (rouge) à 2 semaines (A) et 6 semaines (B) après ligature LAD.

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Discussion

La ligature permanente de LAD provoque une lésion myocardique irréversible. Le premier modèle animal a été décrit en 1960 4. Depuis lors, il a été considéré comme un modèle standard et adapté à MI chronique. Sa stabilité et la reproductibilité autorisés évaluation expérimentale de thérapies pour MI 5. L'amélioration des procédures suivantes la description initiale ont signalé un taux de mortalité opératoire de 35-13% 6.

Comme prévu, DAL ligature induite fonction cardiaque altérée observée dans les 2 semaines. Une autre diminution de la fonction cardiaque a été enregistrée jusqu'à 6 semaines et associée à la cicatrice fibreuse transmurale. En outre, le remodelage LV y compris la dilatation du VG a été clairement observée 6 semaines après la ligature.

Un intervalle de deux semaines entre la première et la deuxième intervention chirurgicale a été choisi. Dans cette condition, la seconde thoracotomie a été facilitée par l'absence d'adhérences, car ils étaient trop abondante après 1 semaine de performa deuxième chirurgie dans des conditions optimales. En outre, deux semaines ont représenté un laps de temps optimal pour l'application de traitement et ont permis d'éviter le pic précoce de l'inflammation induite par l'ischémie et à appliquer le traitement, avant la formation d'un tissu fibreux dense et la progression de la dilatation.

Bien thoracotomie latérale est aujourd'hui la procédure chirurgicale standard pour CONT ligature de petits animaux, une sternotomie médiane est généralement effectuée pour l'application de la thérapie cellulaire 7. La seconde thoracotomie intercostale présenté pour l'application du traitement est un roman, une approche minimalement invasive; il permet un accès vers le cœur par les côtes sans os de coupe et en divisant le muscle. La survenue d'adhérence est réduite en raison de la petite et limitée cicatrice après la première thoracotomie et ceux-ci n'interfèrent pas avec l'accomplissement de la demande de traitement. L'approche a donné lieu à un très faible risque d'hémorragie, postopératoire rapiderécupération, faible taux de mortalité, de la douleur, et le risque d'infection. Cette seconde procédure peu traumatique a duré 20 min à la chirurgie et à 20 min de la matrice de fixation. La procédure rapide et une exposition limitée de l'assèchement du tissu cardiaque cardiaque réduite. L'échographie post-opératoire a abouti à l'acquisition de bonne qualité d'image pour l'analyse des mesures reproductibles. Il n'y avait pas hématomes qui pourraient nuire à l'image.

L'accessibilité du cœur a permis une visibilité optimale de l'infarctus du myocarde ainsi que d'une bonne exposition du cœur pour l'application de traitements épicardiques y compris biografts de type solide et gel 8-10.

L'utilisation de la colle de fibrine a présenté plusieurs avantages. (I) Pour fixer les patchs solides, l'utilisation de la colle de fibrine est moins traumatisant que des sutures. (Ii) En comparaison avec d'autres colle comme BioGlue (Cryolife), la colle de fibrine est plus souple que BioGlue qui a formé la structure rigide et une altération de coeurcontractions. (Iii) Il est temps de polymérisation était optimal pour échafaudage adéquat ou le positionnement de culot cellulaire. (Iv) de fibrine a permis une excellente adhérence initiale de aplat. La pièce a été maintenue fermement sur ​​la surface du cœur pendant au moins 4 semaines 10. (V) la colle de fibrine était facile à usiner lorsqu'il est utilisé comme échafaudage pour la livraison des cellules épicardiques et des cellules fixées ont été maintenus à la surface de la zone infarcie, jusqu'à la fin de la procédure chirurgicale. Bien que le temps de rétention des cellules est de mise au point de la présente étude et exigerait d'autres investigations, il a été proposé que la matrice permet une meilleure rétention de l'infarctus de 11 à 14 cellules implantées. Laver l'extérieur des cellules lors de la contraction cardiaque, ainsi que l'hypoxie et l'environnement inflammatoire, peut expliquer en partie le jeu rapide. Ces inconvénients peuvent être réduits lorsque les cellules sont associées à une matrice.

Les principaux défis techniques concernent le traitement chirurgical deun biograft solide. Si la matrice est rigide et non flexible, fixation avec des sutures devrait être favorisé. Les étapes essentielles suivantes devraient être envisagées pour la procédure avec succès. Tout d'abord, une attention particulière devrait être accordée pendant une thoracotomie pour éviter de casser les côtes. Deuxièmement, l'excès de colle doit être soigneusement enlevé pour éviter l'adhérence des autres tissus. Enfin, un positionnement de ligature normalisée est importante car elle peut réduire la variabilité de la taille de l'infarctus. Un infarctus transmural peut être obtenue lorsque LAD est ligaturé 4 mm en dessous de l'oreillette.

En conclusion, double thoracotomie a représenté une procédure chirurgicale sans danger avec un faible taux de mortalité, un accès adéquat à cœur battant de la demande de traitement, et ne seront donc favoriser l'optimisation de la planification et réduit le nombre expérimental de la perte de l'animal.

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Acknowledgments

Les auteurs remercient le professeur Hendrik Tevaearai et du département de chirurgie cardiovasculaire de soutien financier pour la première partie de l'étude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polysorb 3-0 suture Covidien UL 204
Polysorb 5-0 suture Covidien UL 202
Surgipro II 7-0 Suture Covidien VP904X
Catheter Insyte 14 G BD 381267
Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator Harvard Apparatus 557058
Dumont #7 Forceps FST Germany 11274-20
Fibrin Sealant Baxter 1501441 TISSEEL Glue, Frozen -20 °C
Castroviejo Eye Specula Harvard Apparatus 72-8925 use as retractor for the ribs
IMDM GlutaMAX Gibco 31980
Pen/Strep Gibco 15140
FBS PAA Clone       A15-101
Bone Scissors Fine Science Tools 16044-10
Red Blood Cell Lysis Solution Gentra Systems D-50k1
Accutase Cell Detachment Solution Stem Cell Technology 7920

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References

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