High Throughput Kvantitativ Expression Screening og oprensning Anvendt til rekombinant disulfid-rige Venom Proteiner fremstillet i
1Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB), Aix-Marseille Université, 2iBiTec-S, Service d'Ingénierie Moléculaire des Protéines (SIMOPRO), Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives (CEA) Saclay, France

Published 7/30/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

En protokol til kvantitativ, high throughput udtryk screening og analytisk oprensning af fusionsproteiner fra små Escherichia coli kulturer er beskrevet og anvendt til at udtrykke disulfid-rigt dyre gift protein-targets.

Cite this Article

Copy Citation

Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli. J. Vis. Exp. (89), e51464, doi:10.3791/51464 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Escherichia coli (E. coli) er den mest udbredte ekspressionssystem til fremstilling af rekombinante proteiner til strukturelle og funktionelle studier. Men oprensning af proteiner er undertiden udfordrende, da mange proteiner udtrykkes i en uopløselig form. Når du arbejder med vanskelige eller flere mål anbefales det derfor at anvende high throughput (HTP) protein udtryk screening på en lille skala (1-4 ml kulturer) til hurtigt at identificere betingelserne for opløselig udtryk. For at kunne håndtere de forskellige strukturelle genomics programmer laboratoriet, en kvantitativ (inden for et område 0,1-100 mg / L kultur af rekombinant protein) og HTP proteinekspression screening protokol blev gennemført og valideret på tusindvis af proteiner. Protokollerne blev automatiseret ved anvendelse af en flydende håndtering robot, men kan også udføres manuelt uden specialiseret udstyr.

Disulfid-rige venom proteiner vinderstigende anerkendelse for deres potentiale som terapeutiske lægemiddelkandidater. De kan være meget potent og selektiv, men deres komplekse disulfidbindings netværk gør dem udfordrende at producere. Som medlem af RP7 europæiske Venomics projekt ( www.venomics.eu ), vores udfordring er at udvikle vellykket produktion strategier med det formål at producere tusindvis af nye venom proteiner til funktionel karakterisering. Hjulpet på vej af redox egenskaber disulfidbindings isomerase DsbC, vi tilpasset vores HTP produktion pipeline for ekspression af oxideret, funktionelle venom peptider i E. coli cytoplasma. Protokollerne gælder også for produktionen af ​​diverse disulfid-rige proteiner. Her demonstrerer vi vores pipeline anvendes til produktionen af ​​animalsk venom proteiner. Med de protokoller, der er beskrevet heri, er det sandsynligt, at opløselige disulfid-rige proteiner vil blive opnået i så lidt som en uge. Selv fra en lille skala, er der potentiale til at bruge the renset proteiner til validering af oxidationstrin ved massespektrometri, til karakterisering i pilotundersøgelser, eller for følsomme mikro-analyser.

Introduction

Motiveret af avancement for genomforskning og accelererende opdagelsen af ​​nye proteiner har høj throughput rørledninger blevet udviklet til at parallelize traditionelle metoder til screening og identifikation af optimale protein produktions strategier. Potentielle variabler, der skal optimeres, indbefatter, men er ikke begrænset til, varierende ekspressionsstammer 1,2, temperatur 3,4, medier 2,3 mål varianter 5, fusionspartnere 6-13, co-ekspression med chaperoner 14,15 cytoplasmisk eller periplasmiske ekspressionssystemer 16-18, og oprensning pufferkomponenter 3. Ved at implementere højkapacitetmetoder, mange variabler eller mange mål kan testes parallelt med en høj grad af effektivitet, samtidig begrænse batch-til-batch variation. Det er vores erfaring strategien giver også god reproducerbarhed ved opskalering ved hjælp af den samme kultur (temperatur, medier, beluftning, osv.) og rensning betingelser (samme resin, buffere, etc.). Adskillige high throughput platforme har været anvendt i de sidste ti år på at identificere betingelserne for opløseligt protein udtryk, nemlig gennem forskellige parametre som fusionspartnere, ekspressionsstammer eller temperatur 19-23.

Vi har for nylig brugt vores high throughput screening metode til ekspression af opløselige disulfid-rige proteiner 11. De udvalgte proteiner var ikke kun fra giftige kilder, men også disulfid-rige enzyminhibitorer fra en lang række arter, herunder planter, grise, køer og mennesker. Forsøget sammenlignede effekten af ​​12 forskellige fusionspartnere og tre forskellige ekspressionsstammer på opløselighed og foldning af 28 disulfid-reticulated proteiner. Vi viste, at ved hjælp af DsbC som en fusionspartner til produktion i stammen BL21 (DE3) pLysS langt outproduced (i både udbytte og antallet af opløselige proteiner opnået) enhver anden kombination af belastning og fusion testet 11. DenResultaterne af dette forsøg dannede grundlag for at tilpasse vores oprindelige generelle high throughput rørledning (som er blevet anvendt til ekspression screening af en lang række proteiner) 22,24 til en mere egnet til ekspression af disulfid-rige mål. Disulfid-rige proteiner fra animalske gifte er af særlig interesse. Gifte er en kompleks blanding af bioaktive peptider og proteiner med potentiel værdi farmakologisk og terapeutisk. Imidlertid ekspression af disulfidbinding-holdige proteiner er ikke trivielt. Disse proteiner indeholder i almindelighed mellem 6:59 disulfidbindinger og skal oxideres med de korrekte disulfid-bindingsmønstre for at være aktiv. I øjeblikket er platform, der bruges til screening udtryk for et stort antal disulfid-rigt dyre venom proteiner som en del af FP7 europæiske VENOMICS Project (www.venomics.eu) og benchmarking nye protokoller for high throughput udtryk for tusindvis af målene . Her en automatiseret metodeer fastsat til high throughput små udtryk screening og rensning (se figur 1) anvendt til disulfidholdig rigt dyre venom proteiner. Strategien for disulfid-rige peptider og proteiner anvender en HIS-tag til oprensning og redox-aktive fusionspartner, DsbC skabe spaltelige HIS-DsbC fusioner til målproteiner (se figur 2).

Mens fokus i de protokoller heri er automatisering ved hjælp af en væske håndteringsrobot og HTP elektroforese, disse metoder er også velegnet til en high throughput manuel tilgang, hvilket betyder, at selv laboratorier med en grundlæggende opsætning kan drage fordel af de protokoller, uden nogen forudsætning for dyrt udstyr . Manuelle protokoller for forvandling til oprensning og analyse (ikke specifik for disulfid-rige proteiner) er blevet offentliggjort andetsteds 24 og vil ikke blive gentaget her. Throughput på manuelle procedure (fra ekspressionsklon, produceret af recombinational kloning 25, til analyse af opløseligt protein i blodet) er 96 (ved hjælp af SDS-PAGE detektion) eller 384 (4 x 96, ved hjælp af dot blot og SDS-PAGE 26) kulturer per uge (se figur 1). Dette kan øges, hvis der udføres i en semi-automatiseret måde (ved hjælp af en væske håndteringsrobot og dot blot 26 eller HTP elektroforese, såsom med en Caliper GXII LabChip-systemet 22 til analyse af resultaterne) til op til 1.152 (12 x 96) kulturer i parallel over en uge som beskrevet heri. Dyrkning udføres i dyb brønd 24 (DW24) format, så regelmæssige rystende kuvøser kan bruges i modsætning til kulturer dyrket i dyb brønd 96 (DW96) format, som kræver brug af korte orbitale højhastighedstog ryste inkubatorer tilstrækkelig beluftning (rysten ved 800 opm). Brugen af auto-induktion medier 27 forenkler også udtryk, hvilket eliminerer manuelle induktion trin. Selv hvor laboratorier anvender allerede foruddefinerede udtryk og purifikation betingelser, kan disse overføres direkte ind i denne HTP system, blot for at forbedre effektiviteten. En detaljeret skematisk af high throughput screening rørledning til disulfid-rige proteiner er tilvejebragt i fig. 3. Parametrene i rørledningen blev udvalgt baseret på omfattende screening eksperimenter 11, 22, hvilket gav os mulighed for at vælge de mest egnede betingelser for proteinproduktion.

Karakterisering kan udføres på taggede proteiner oprenset direkte fra små udtryk i pilotundersøgelser, hvor snesevis af mikrogram prøve er tilstrækkelig, eller til følsomme funktionelle assays og bindingsassays (f.eks lav volumen HTP patch clamp-systemer 28). Det samme kan også udføres på umærkede mål efter spaltning, hvis tag og proteasen fjernes (for eksempel ved omvendt fase HPLC). Kvalitetskontrol kan også udføres ved hjælp af massespektrometri (for at bekræfte den forventede størrelse og oxidation stspiste) eller kromatografiske metoder (for at bekræfte renhed eller heterogenitet) 29. Sommetider tag spaltning er unødvendig eller endda uønsket (især for dårligt opløselige proteiner 30,31), så i denne protokol spaltning er valgfrit. Uanset i alle konstruktioner er der en TEV-protease-spaltningssted (ENLYFQ / [G] 32) umiddelbart forud for målgenet at producere native protein efter spaltning (se figur 2 og diskussion). Hvis der ønskes spaltning af fusion tag, kan spaltning testes (på elueringsfraktionen eller 'på kolonne ") ved den lille skala til at analysere effektiviteten, optimere betingelserne, hvis det kræves, og få pålidelige skøn over udbytterne for efterfølgende opskalering eksperimenter.

Der er to muligheder for mængden af ​​perler, der anvendes under affinitetsrensning, afhængig af de mål og forventninger til eksperimentet. At være i stand til at fange så meget protein som muligt (for at rense for pilot assays eller MS, eller at extrapolspiste til opskalering udbytter) et slutvolumen på 200 pi harpiks bør anvendes, så påvisning af opløseligt protein i området fra 1-100 mg / L kultur, før mætning af systemet (se protokol (A) i afsnit 8.1) . Men hvis formålet med forsøget er påvisning af små mængder af opløselige proteiner derefter et endeligt volumen på 50 pi harpiks er egnet, så påvisning af opløseligt protein i intervallet 0,1-25 mg / L kultur (se protokol (B ) i afsnit 8.2).

Produktionen kan skaleres op, hvis det er nødvendigt, for at opnå milligram mængder rensede mål for yderligere strukturelle og funktionelle undersøgelser ved hjælp af de betingelser, der er identificeret for opløselig udtryk. Detaljerne i opskalering protokoller, der anvendes på AFMB blevet diskuteret andetsteds 22,24.

Yderligere oplysninger er relevante for forsøgsopstillingen, kritiske skridt i protokollen, ændringer og fejlfinding og begrænsninger af teknikken forudsat i skivenussion. Læs venligst diskussionen, før de påbegynder forsøgene.

Gennem de protokoller vi forventer en succesrate på 90% ved hvert trin (for eksempel skal mindst 90% af kulturerne vokse på et givet trin). Hvis succesrate på ethvert trin i eksperimentet falder til under 90% prøverne kasseres, og forsøget gentages for den fulde samling af konstruktioner. Men denne succes rate er ikke anvendelig til antallet af konstruktioner, der udtrykker som opløselige proteiner eller andelen af ​​konstruktioner, som spalter med 100% effektivitet, da dette vil være meget afhængig af de testede proteiner.

De specifikke oplysninger om opsætning af robotten arbejdsbord er fastsat for hver protokol (se også figur 4), men de kan tilpasses efter behov for alternative Arbejdsbord set-ups. Robotten hardware (Tecan) består af en 96-multikanal arm (MCA96), robot manipulator (Roma) og 8-kanals væskehåndtering hoved (Liha). Alle trin anvender de MCA96 kan også udføres ved hjælp af liha hvis en MCA96 ikke er tilgængelig, men de vil tage længere tid, fordi liha bliver nødt til at blive vasket mellem trin. Mens robotten er teknisk set ikke et sterilt miljø, inddragelse af antibiotika generelt sikrer, at der ikke er problemer med forurening eller sterilitet.

Protocol

Del A: Transformation og Test Expression

Manuelle procedurer til kloning 22 og transformation til rensning behandles andetsteds 24. Transformationen protokol kan fuldt udføres på robotten 26, men det er som regel mere tid effektivt at gøre det manuelt. Derfor protokollerne heri begynde fra podning af udtrykket forkulturer og plettering af transformationen fra varmen chokeret transformation blander gøres manuelt. For yderligere oplysninger om de manuelle kloning og transformation procedurer se de relevante referencer 22,24.

1.. Forkulturer og Belægning

  1. Forbered robotten arbejdsbord (se figur 4 for positioner):
    1. Sæt en 300 ml beholder indeholdende 150 ml sterilt LB-medium (suppleret med ampicillin (100 ug / ml) / chloramphenicol (34 ug / ml), eller et andet passende antibiotikum) i stilling 8.
    2. Sæt en steril DW96 på position 11. Put 4x allerede forberedt 24-godt LB-agar (Amp / CAM) vævskulturplader (indeholdende 2 ml agar i hver brønd) med låg på i positionerne 14 til 17.
    3. Sæt omdannelsen plade (indeholdende 96 transformation blander efter varmechok) ved position 13. Dette vil blive anvendt til at pode flydende forkulturer og LB agarplader. Sæt en kasse af sterile 200 ul pipettespidser på position 18.
  2. Ved hjælp af 96-multikanal armen (MCA96) og 200 tips ul aspireres 200 pi LB-bouillon (position 8) og dispensere i DW96 i stilling 11. Gentag, indtil der er et slutvolumen på 1 ml LB-bouillon i hver brønd den DW96. Det bliver den flydende forkultur.
  3. Ved hjælp af robot manipulator (Roma), fjern låget af den første 24-godt LB-agar plade og placere den et andet sted (for eksempel i et hotel carrier), indtil klædningen er færdig for denne plade.
  4. Ved hjælp af 8-kanals væske håndtering (liha) hoved, bland derefter aspiratprøver 50 pi than første kolonne transformation mix på position 13. Denne mængde transformation mix er lige nok til at dække LB-agar godt.
  5. Med de første 4 kanaler, dispensere på den første kolonne i den første 24-brønds LB agarplade ved position 14 (som vist i figur 5).
  6. Med de sidste 4 kanaler, dispensere på den anden kolonne i den første 24-godt LB-agar plade.
  7. Vask alle tips grundigt efter dispensering.
  8. Fortsæt denne proces, indtil alle transformationer er blevet belagt på den første plade på position 14, overførsel fra 96 - til 24-godt at bruge ordningen i figur 5..
  9. Når den første plade er afsluttet, skal du bruge RoMa til låget, og fjern låget fra den næste plade i stilling 15. Fortsæt brugen af ​​klædningen ordning for de næste 3 plader.
  10. Når plating er færdig, indstilles Te-shake til 1.200 rpm og ryste alle plader i 1 min at få en homogen fordeling af omdannelsen mix. Brug af MCA96 og den oprindelige pipettespidser, bland derefter aspiratprøver 60 ul af resterende transformation mix (position 13) og dispensere i DW96 indeholdende LB bouillon på position 11.
  11. Forsegl DW96 forkulturer med åndbar klæbefilm at tillade kultur beluftning.
  12. Sted i et 37 ° C rysteinkubator ved maksimal hastighed O / N (200/800 rpm afhængigt af shaker orbital).
  13. LB agarplader skal anbringes under en hætte med deres lågene indtil tør (10 min.) Så de er placeret omvendt i et 37 ° C plade inkubator indtil den følgende morgen.
  14. Den næste dag er forkultur anvendes til podning testudtrykket auto-induktion medium og til fremstilling af glycerolstamopløsninger. Sæt agarplader i et køleskab, som en back up. Hvis det er nødvendigt, startende fra agarpladerne eller glycerolstamopløsninger, testudtrykket kunne re-done ved at pode en frisk LB forkultur direkte.

2. Fremstilling af DW24 ZYP-5052 Plader

BEMÆRK: Denne procedure tager ca 5 min for at fuldføre for hvert sæt af 4x DW24 plader.

  1. Make up 500 ml ZYP-5052 auto-induktion medium for hver gentagelse af 96 kulturer (464 ml ZY medium, 250 gl 2 M MgSO4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS i nævnte rækkefølge - opskrifterne for hver komponent er tilvejebragt i tabel 1) suppleret med passende antibiotika.
  2. Forbered robot arbejdsbord:
    1. Sæt to 300 ml trug, som hver indeholder ~ 250 ml medium ved position 5 og 6. Sæt fire sterile DW24 plader ved positionerne 14 til 17. Sæt 200 tips pi ved position 18.
  3. Brug af MCA96 og 200 ul tips, aspirat 200 ul ZYP-5052 fra position 5 og dispensere i den første DW24 plade på positionen 14. Gør dette i alt 5 gange (4 tips vil dispensere i et enkelt godt på en gang til en samlet 4 ml). Gentag for de resterende 3 x DW24 plader ved positionerne 15. til 17., Switching til ZYP-5052 i position 6 for de sidste to DW24 plader.

3.. Podning og vækst testudtrykket Cultures

BEMÆRK: Podning tager cirka 10 minutter at udfylde for hver sæt 4x DW24-plader, og væksten fortsætter O / N.

  1. Forbered robot arbejdsbord:
    1. Sæt DW96 plade indeholder forkulturer (fra trin 1.15) ved position 11. Sæt de fire DW24 plader indeholdende ZYP-5052 medium (fra trin 2.3) ved positionerne 14 til 17.
  2. Brug af liha aspirere 100 ul forkulturen fra position 11 til at pode testudtrykket kulturer (1/40 fortynding) ved hjælp af ordningen i fig. 5. Vask liha hoved grundigt ved vask station mellem hver kolonne af de 96-brønds forkulturer.
  3. Forsegl DW24 plader med åndbar film og inkuberes ved 37 ° C med omrystning (200/400 rpm) i 4 timer. Det er den tid af vækstfasen hvorunder glucose fra mediet vil fortrinsvis være udtømt 27.
  4. Sænk temperaturen til 17 ° C. Efter 4 timer og udtømningen af glukose, vil laktose begynde at blive metaboliseret, hvilket fører til induktion af udtryk, der giver de optimale betingelser for BL21 (DE3) pLysS eller Rosetta 2 (DE3) pLysS vækst, i dette arbejde 22. Lad cellerne til at udtrykke O / N. Bruge den resterende forkultur at glycerolstamopløsninger.

4.. Fremstilling af glycerolstamopløsninger

BEMÆRK: glycerolstamopløsninger bør foretages i tre eksemplarer, der skal lagres på forskellige steder i tilfælde af svigt fryser.

  1. Forbered robot arbejdsbord:
    1. Put mikrotiterplader ved position 5 til 7 til at huse de glycerolstamopløsninger. Sæt en 300 ml trug fyldt med 50 ml 100% glycerol i stilling 8. Sæt DW96 indeholdende 800 pi forkultur (efter trin 3.2) i hver brønd i stilling 11. Sæt 200 tips pi ved position 18.
  2. Ved hjælp af en slow aspiration og dispensering hastighed, skal du bruge MCA96 og 200 tips ul at tilføje glycerol i DW96 indeholder forkulturer.
    1. Aspirer 200 pi glycerol (fra position 8).
    2. Doser 150 pi (ved position 11) først, derefter pause i 20 sekunder for at tillade den resterende glycerol at nå bunden af ​​spidsen. Doser de resterende 50 pl.
  3. Idet de samme spidser, bland den kultur og glycerol i DW96 på position 11, indtil de er grundigt blandet. Den endelige koncentration af glycerol er 20%. Aspirer 140 pi fra DW96 og dispensere i den første mikrotiterplade i 5-stillingen.
  4. Gentag trin 4.3 for hvert resterende mikrotiterplade (positionerne 6 og 7).
  5. Forsegle hver mikrotiterplade med plastic tape og opbevares ved -80 ° C. Kassér den resterende kultur i DW96, dekontaminering med et antimikrobielt middel inden bortskaffelse.

5.. Vurdering af vækst i Cultures

600 er normalt det samme for de fleste kulturer (omkring 12 i disse betingelser), dog alle kulturer, der ikke vokser bør bemærkes.

  1. Tag 50 pi af hver kultur (fra trin 3.4) og dispensere i en fladbundet, klar mikrotiterplade indeholdende 150 pi medium.
  2. Mål OD 600, under hensyntagen til 4-fold fortynding. Hvis der er nogen, der ikke vokser meget godt, bemærk dette for den endelige analyse.

6.. Høst af cellerne

BEMÆRK: Denne procedure tager ca 45 min at fuldføre.

  1. Centrifugere 4x DW24 plader (fra trin 3.4) ved 3.000 xg i 10 min og derefter kassere supernatanten i en affaldsbeholder, der indeholder antimikrobielle middel. Tryk på plader, upside-down, mod absorberende papir for at fjerne overskydende medie.
  2. I mellemtiden forbereder 100 ml lysisbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCI, 10 mM imidazol, pH 8, eller anden foretrukken puffer) indeholdende lysozym (slutkoncentration 0,25 mg / ml).
  3. Forbered robot arbejdsbord:
    1. Sæt lysepuffer i en 300 ml trug ved position 5. Sæt en ren DW96 i stilling 11. Sæt 4 x DW24 plader indeholdende cellepellets (fra trin 6.1) i positionerne 14-17. Sæt 200 tips pi ved position 18.
  4. Brug af MCA96 og 200 tips ul, aspirat 125 pi lysisbuffer fra position 5 og dispensere i hver DW24 plade (position 14-17). Gentag. BEMÆRK: 4 tips vil dispensere i et enkelt godt på én gang for et endeligt volumen på 1 ml i hver brønd af DW24 plader.
  5. Ryst pladerne ved positionerne 14-17 ved hjælp af Te-shake (1.000 rpm) i 15 minutter for at resuspendere pillerne.
  6. Når resuspenderes bruge de første 4 kanaler i liha at aspirere 550 ul fra prøver 1 til 4 (den første kolonne i den første DW24, ved position 14), derefter bruge lAST 4 kanaler i liha aspirere 550 pi prøver 5 til 8 (den anden kolonne i den første DW24). Doser i den første række af DW96 på position 11.
  7. Gentag trin 6.6, så alle cellesuspensionen overføres til DW96.
  8. Efter hvert sæt prøver vaske liha tips i vask station.
  9. Gentag trin 6,6-6,8 for hver kolonne i hver DW24 plade (positionerne 15-17) ved hjælp af ordningen i figur 5.. Seal med plastfolie.
  10. Til oprensning på samme dag eller kortvarig frysning, opbevares ved -80 ° C i mindst 1 time, ellers opbevares ved -20 ° C.

Del B: Oprensning og analyse

7.. Cellelyse

BEMÆRK: Denne procedure tager omkring 60 minutter at gennemføre.

  1. Optø frosne cellesuspensioner (fra trin 6.10) i et vandbad (ved stuetemperatur eller 37 ° C) i cirka 15 minutter og resuspenderes i rysteinkubator for en aDERLIGERE 10 min. Kulturerne bør blive tyktflydende.
  2. Tag 500 ul DNase materiel og bland det med 1 ml MgSO4 lager. Manuelt med en 8-kanals pipette eller med robotten Liha dispensere 15 ul i hver brønd af DW96, at give en endelig koncentration på 10 ug / ml DNase og 20 mM MgSO4.
  3. Re-forsegle skiltet med plastik tape og ryste i yderligere 15 min. På dette tidspunkt kulturerne bør være ikke-tyktflydende. Kontrollér omhyggeligt (ved visuel undersøgelse), at alle kulturer er ikke længere tyktflydende. BEMÆRK: Dette er kritisk, hvis nogle kulturer er stadig viskos (for eksempel, hvis DNase uheld blev glemt eller ikke dispenseres hensigtsmæssigt i nogle brønde), vil filteret tilstoppes, genererer et ujævnt pres på prøverne og overløb eller total tilstopning af filterplade kan ske i løbet af oprensningen.
  4. Til SDS-PAGE-prøver af helcellelysat aspireres 10 pi lysat og dispensere i en 96-brønds PCR-plade indeholdende10 pi 4x SDS-PAGE-prøvebuffer og 20 pi vand. Denaturering i 3 minutter ved 95 ° C og fryse indtil analyse (Total fraktion). Hvis en HTP elektroforese system er til rådighed, kan prøverne analyseres på dette i stedet at følge producentens anbefalede protokol for prøveforberedelse. For yderligere oplysninger om analyse af prøverne se afsnit 10.

8.. Ni Affinitetsrensning

BEMÆRK: En langsom aspiration hastighed skal bruges til pipettering alle harpiks suspensioner, da affjedringen er ganske tyk. Over-tørring af harpiksen vil resultere i en reduktion i bindingskapacitet. Til oprensning, specificeret imidazol koncentrationer er gældende for nikkel affinitet harpiks. Hvis der anvendes alternative ioner (fx kobolt), så koncentrationerne bør justeres i overensstemmelse hermed.

  1. A - Ni affinitetsoprensning til detektion i området 1-100 mg / L (endelig harpiks volumen = 200 ul)
    BEMÆRK: Thans oprensningsprocedure tager omkring 1,5 timer at fuldføre, hvilket betyder, at op til 4 kan udføres på én dag.
    1. Forbered robot arbejdsbord:
      1. Sæt 300 ml trug indeholdende bindingspuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCI, 10 mM imidazol, pH 8), vaskepuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, pH 8), og elueringspuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8) i position 6 til 8, hhv.
      2. Efterlad en tom 300 ml truget i stilling 5 for harpiksopslæmning. På position 9 og 10 put plade holdere. På position 10 sætte en DW96 med SPE blok og filter / modtager plade (20 um) på toppen.
      3. Sæt DW96 indeholdende lysatet (fra trin 7.3) på positionen 14. På position 18 og 19 satte 200 ul brede bore tips og 200 tips ul, hhv. Sæt to ekstra DW96 plader til vask og eluering på et hotel. BEMÆRK: De kunne også sættes på en anden lokalitet på arbejdsbordet, hvis et hotel ikke er tilgængelig.
    2. Forbered 105ml ækvilibreret 33% harpiks-opslæmning (35 ml harpiks + 70 ml bindingsbuffer). Tilsæt harpiks suspension til truget ved position 5 umiddelbart før du begynder proceduren.
    3. Brug MCA96 og 200 pi brede boring tips (position 18), blandes harpiksopslæmningen i position 5 grundigt, før aspirering og udlevering 200 pi harpiksopslæmningen i DW96 indeholdende lysatet ved position 14. Gentag to gange, så at 600 pi harpiksopslæmningen er blevet tilsat til lysatet, blanding af harpiksen suspensionen før hver aspiration.
    4. Udfør en 10 min blanding trin vha. MCA96 ved position 14 for at tillade binding og forhindre harpiks pelletering.
    5. Aspirer fra position 14 og dispensere 800 pi (i 200 pi partier) på filterpladen ved position 9, blanding før hver aspiration ellers blev harpiksen vil blive tilbageholdt på bunden af ​​DW96.
    6. Drej vakuum på i position 10 til cirka 90 sekunder at filtrere lysatet gennem pladen iDW96 at indsamle gennemstrømning, pas på ikke at tørre ud harpiksen. Tænd for vakuumet fra.
    7. Gentag trin 8.1.5 og 8.1.6, således at alle harpiksen derefter i filterpladen.
    8. Brug af RoMa arm flytte SPE blok holder filterpladen fra position 10 til position 9, således at den næste vask trin går direkte til affald og overføre DW96 indeholder den gennemstrømning på position 10 til en anden hjemmeside (fx til et hotel bærer) indtil afslutningen af ​​proceduren.
    9. Med et nyt sæt af 200 tips ul (i position 19), vask harpiksen (ved position 9) med i alt 800 ul bindingsbuffer (fra position 6) og anvende vakuum ved position 9, indtil bufferen er passeret gennem . Gentag en gang mere.
    10. Brug RoMa armen for at placere en ny DW96 på position 10 til at indsamle 50 mM imidazol vask og flyt SPE blok og filter plade tilbage på toppen (position 10).
    11. Tilføj 800 pi vaskebuffer fra position 7 på position 10, drejvakuum, indtil bufferen er passeret. Sluk for vakuum slukket.
    12. Med romaerne, fjerne SPE blok og filter plade til at placere 9 og DW96 indeholder vask prøven til hotellet, og holde det til side, indtil afslutningen af ​​proceduren.
    13. Resinen vaskes med yderligere 800 pi vaskebuffer (fra position 7 på position 9), gælder det vakuum, indtil bufferen er passeret. Gentag en gang mere.
    14. Brug romaer for at placere en ny DW96 ved position 10 og placere SPE blok og filter plade tilbage på toppen til at indsamle eluering.
    15. Tilføj alt 500 pi elueringsbuffer (fra position 8 ved position 9), og inkuberes in situ i 3 min. Tænd for vakuum, indtil alle buffer har passeret.
    16. Valgfrit: For meget at udtrykke proteiner, en anden eluering kan udføres i en frisk DW96 som i trin 8.1.14 og 8.1.15.
    17. Tag prøver af gennemstrømning, vask og eluering / s for SDS-PAGE eller HTP elektroforese.
      1. For HTP elektroforese prøver, skal du følge producentens anvisninger. For yderligere oplysninger om analyse af prøverne se afsnit 10.
  2. B - Ni affinitetsoprensning til påvisning i intervallet 0,1-25 mg / L (endelig harpiks volumen = 50 ul)
    BEMÆRK: Denne oprensningsprocedure tager omkring 30 minutter for at fuldføre, hvilket betyder, at op til 12 kan udføres på én dag.
    1. Forbered robot arbejdsbord:
      1. Sæt 300 ml trug indeholdende bindingspuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCI, 10 mM imidazol, pH 8), vask (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, pH 8)og elueringspuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8) i position 6 til 8, hhv.
      2. Efterlad en tom 300 ml truget i stilling 5 for harpiksopslæmning. På position 9 og 10 put plade holdere. På position 10 sætte en DW96 med SPE blok og filter / modtager plade (20 um) på toppen.
      3. Sæt DW96 indeholdende lysatet (fra trin 7.3) på positionen 14. På position 18 og 19 sættes 200 pi brede bore tips og 200 tips ul, hhv. Sæt et ekstra 96-brønds mikrotiterplade til eluering i et hotel. BEMÆRK: Dette kan også sættes på en anden lokalitet på arbejdsbordet, hvis et hotel ikke er tilgængelig.
    2. Forbered 50 ml ækvilibreret 25% harpiksopslæmning (12,5 ml harpiks + 37,5 ml bindingsbuffer). Tilsæt harpiks suspension til truget ved position 5 umiddelbart før du begynder proceduren.
    3. Brug af MCA96 og 200 ul brede boring tips (position 18), bland harpiksopslæmningen ved position 5 grundigt, før sugning og dispensing 200 pi harpiksopslæmningen i DW96 indeholdende lysatet ved position 14.
    4. Inkuber ved RT med rystning ved anvendelse af Te-shake ved 1400 rpm i 10 minutter for at tillade binding.
    5. Aspirer fra position 14 og dispensere den fulde 1.200 pi (i 200 pi partier) De brede boring tips (position 18) på filterpladen ved position 10. Blandes før hver aspiration ellers blev harpiksen vil blive tilbageholdt på bunden af ​​DW96.
    6. Drej vakuum på i position 10 til cirka 30 sekunder at filtrere lysatet gennem pladen i DW96 at indsamle gennemstrømning, pas på ikke at tørre ud harpiksen. Tænd for vakuumet fra.
    7. Brug Romaerne armen, flyt SPE blok holder filterpladen fra position 10 til position 9, således at den næste vask trin går direkte til affald og overføre DW96 indeholder den gennemstrømning på position 10 til en anden hjemmeside (f.eks i en hotel bærer) indtil afslutningen af ​​proceduren.
    8. Med de 200 μl tips (i position 19), vaskes harpiksen (ved position 9) med i alt 800 ul bindingsbuffer (fra position 6) og anvende vakuum ved position 9, indtil bufferen er passeret. Gentag.
    9. Brug RoMa armen for at placere den friske DW96 ved position 10 til at indsamle 50 mM imidazol vask og flyt SPE blok og filter plade tilbage på toppen (position 10).
    10. Tilføj 150 pi vaskebuffer fra position 7 på position 10, drejes vakuum på indtil bufferen er gået igennem. Sluk for vakuum slukket.
    11. Med ROMA fjerne SPE blok og filter plade til at placere 9 og DW96 indeholder vask prøven til hotellet, og holde det til side, indtil afslutningen af ​​proceduren.
    12. Resinen vaskes med yderligere 800 pi vaskebuffer (fra position 7 på position 9), gælder det vakuum, indtil bufferen er passeret. Gentag.
    13. Brug RoMa at placere mikropladen ved position 9 og placer SPE blok og filter plade tilbage på toppen til at indsamle the eluering.
    14. Tilføj 190 pi elueringsbuffer (fra position 8 ved position 9), og inkuberes i stedet for 3 min. Påfør vakuum, indtil alle buffer har passeret.
    15. Tag prøver af gennemstrømning, vask og eluering til SDS-PAGE eller HTP elektroforese.
      1. Til SDS-PAGE-prøver af gennemstrømning, dispensere 10 ul i et 96-brønds PCR-plade indeholdende 10 pi 4X SDS-PAGE-prøvebuffer og 20 pi vand. Til SDS-PAGE-prøver af vask og eluering / r dispensere 30 pi i PCR-plader indeholdende 10 pi 4x SDS-PAGE-prøvebuffer. Denaturering i 3 minutter ved 95 ° C og fryse indtil analyse.
      2. For HTP elektroforese prøver, skal du følge producentens anvisninger. For yderligere oplysninger om analyse af prøverne se afsnit 10.

9.. Tag Spaltning (valgfri)

  1. Tilsæt TEV-protease (2 mg / ml) til eluerede protein (fra trin 8.1.15 (og 8.1.16) eller trin 8.2.14) i et forhold på 1/10 (v / v).
  2. Inkuber ved stuetemperatur (eller 4 ° C i temperaturfølsomme proteiner) O / N med forsigtig rystning.
  3. Ved slutningen af ​​spaltning dispensere 30 ul i et PCR-plade indeholdende 10 pi 4x SDS-PAGE prøvebuffer eller følg producentens anvisninger for HTP elektroforese prøver.
  4. Foretage den resterende spaltningsblandingen (fra trin 9.2) gennem en 96-brønds 0,22 um filter plade og indsamle det opløselige gennemstrømning i en DW96 ved anvendelse af vakuum. Dette kan gøres på en af vakuum steder (f.eks position 10) om væskehåndtering robot, som for elueringstrin i afsnit 8.1 og 8.2. Dette fjerner enhver protein, der udfælder under spaltning.
  5. Efter filtrering, dispensere 30 fil i en PCR-plade indeholdende 10 pi 4x SDS-PAGE prøvebuffer eller forberede som HTP elektroforese prøver. Dette tillader sammenligning af proteinet før spaltningen blandingen efter spaltning og solresterende opløseligt protein efter spaltning og giver gode indikationer af de forventede resultater i de efterfølgende opskalering eksperimenter. For yderligere oplysninger om analyse af prøverne se afsnit 10.

10.. Analyse af resultater

  1. Identificer de konstruktioner, der udtrykker opløseligt protein ved at analysere de rensning prøver på SDS-PAGE, dot blot eller HTP elektroforese system som Caliper LabChip.
    1. Analyser elueringsprofilerne prøverne først at identificere konstruktioner producerer opløseligt protein. I de fleste tilfælde kun elueringsvolumener prøverne analyseres hvis opløselige konstruktioner er identificeret, for at minimere den tid, der bruges på analysen.
    2. Hvis proteinet ikke er i eluering køre vask og gennemstrømning prøver at se om det blev udtrykt og ikke bindende ordentligt til harpiksen.
    3. Til konstruktioner, hvor intet opløseligt protein kan detekteres køre hele cellelysat for at se, hvis proteinet blev udtrykt.
      BEMÆRK: En begrænsning er, at hvis protein af interesse ikke er til stede over baggrunden ekspressionsniveauer, kan det ikke være muligt at se proteinet og kan føre til en falsk negativ. Det skal bemærkes, at det altid er muligt for proteiner til at holde fast og udfældes på affinitet harpiks og dette kunne føre til en falsk negativ eller undervurdering af udbyttet ved hjælp af den anbefalede protokol (en sjælden begivenhed i dette arbejde). I tilfælde af, at proteinet udfældes ved eluering (en hvid pellet er synlig et par minutter / timer efter eluering), anbefales det at ændre buffer sammensætning (fx saltkoncentration) og / eller udføre en differentiel scanning fluorimetri assay at optimere buffere. En lille prøve af harpiksen kan også resuspenderet i SDS-PAGE-prøvebuffer og kogt at opdage, hvis et protein tilbageholdes på harpiksen.
    4. Hvis proteinet ikke blev udtrykt, men cellerne gjorde vokse, forfølge et nyt udtryk strategi, eller hvis OD600 var ikke høj nok regrow og genanalysere kulturen. >
    5. Hvis spaltningsprodukter prøverne skal analyseres, skal de analyseres i en side-by-side måde, således at hver konstruktion kan vises før spaltning en efter spaltning i tilstødende baner, for at forenkle analysen.
  2. Medmindre hjælp af en metode, der giver direkte kvantificering af elueringen koncentrationen, skal kvantificering udføres for positive prøver ved at måle absorbansen ved 280 nm (A280).
    1. Mål A280, tager udslettelse co-effektive af proteinet i betragtning, og ved hjælp elueringsbufferen som en tom, for at give et skøn af protein udbytte med henblik på at identificere den højeste udtrykker opløselige konstruktioner.
    2. For den mest pålidelig sammenligning af opløselige udbytter anbefales det at normalisere udbytterne af kulturens densitet (ved hjælp af OD600 måling), som blev taget på afsnit 5. Hvis alle kulturer voksede til omtrent samme massefylde, normalisering er ikke påkrævet.
e "> 11.. Kvalitetskontrol

  1. Prøverne kan analyseres direkte fra eluering eller spaltning prøve ved væskekromatografi-massespektrometri (LC / MS).
  2. Alternativt afsalte først (for at fjerne imidazol og eventuelle buffersalte, der kan være til stede) ved hjælp ZipTip pipettespidser eller flydende kromatografiske metoder, og derefter analysere ved hjælp af matrix-assisteret laser desorption / ionisering time-of-flight (MALDI-TOF) eller elektrospray ionisering ( ESI) massespektrometri.
  3. Små funktionelle studier kan udføres for at kontrollere, om funktionen af ​​proteinet er som forventet. Hvis der kræves en større mængde til funktionen, kan en opskalering kultur skal foretages, og den testede fra den større kultur, når størrelse og oxidationstrin funktion er blevet bekræftet på lille skala.

Representative Results

Repræsentative resultater er vist i figur 6 for ekspression screening af 96 disulfid-rige proteiner fra VENOMICS rørledningen. Proteinerne er arrangeret ved at øge antallet af disulfidbindinger derefter stigende antal rester. Peptiderne blev udtrykt i cytoplasmaet med en HIS-tag og DsbC fusionspartner. Når du bruger de anbefalede dyrkningsbetingelser, er en OD 600 af 12. normalt opnået. Peptiderne blev oprenset ved anvendelse af protokol 8.2-B med et slutvolumen på 50 pi af nikkel affinitetsharpiks, så et maksimum på ~ 25 mg / L fusionsprotein kunne påvises i dette eksperiment.

Figur 6A viser elektroforesen resultat fra Caliper LabChip systemet (som viser fusion før spaltning) og er helt baseret på ekstrapolation til opnåelse af i mg / l kultur af fusionsproteinet (i niveauer på 0,1 til 2 mg / L kultur, 2 til 10 mg / l kultur, 10 til 25 mg / L kultur og ingen t detekteres.) Bemærk, at det spaltede DsbC tag kører normalt på omkring 32 kDa, snarere end 27 kDa som forventet. Tilsvarende DsbC fusioner også køre omkring 5 kDa højere end forventet. For mange af de mål, som vi ikke kun se det intakte fusionsprotein (øvre bånd), men også fusionspartneren alene (nedre bånd). For nogle af disse mål at optimere dyrkningsbetingelser kan forbedre forholdet mellem det intakte fusionsprotein (øvre bånd) sammenlignet med DsbC alene giver en stigning i det endelige udbytte. Pointsystemet er kun baseret på niveauet af intakt fusion. Kun 16 ud af 96 proteiner ikke kunne påvises ved fusion niveau. Dette svarer til en samlet succes niveau på 83%. Af de 80 proteiner, der kan opdages, var 45 af disse opdages ved mængder større end 2 mg / L kultur (56%). Afhængigt af målet og fusion proteinudbytter er normalt i området fra 2-100 mg / L kultur (men i dette eksempel under anvendelse af protokollen 8.2 B maksimalt ~ 25 mg / L fusionsprotein kan påvises).

t "> En analyse af succes ved antallet af disulfidbindinger til stede (vist i figur 6B) viser rimelig succes for alle numre af disulfid testede obligationer (mellem 1 og 7), med det laveste succes niveau op på 66% for mål, der indeholder 6 disulfid obligationer. En analyse af fordelingen af udtrykket succes er baseret på isoelektriske punkt og antal af rester (vist i figur 6C) viser ingen særlig bias for teknikken, med både held udtrykte mål og mål, som ikke blev opdaget spredt over hele plottet.

Figur 6D viser et eksempel på massespektrometri resultater fra elektrospray massespektrometri (ESI-MS) for et enkelt mål, før og efter reduktion af prøven med DTT. Normalt vil en sådan udtømmende massespektrometrianalyse ikke skal udføres (nedsat stikprøve ikke skal analyseres), men med henblik på en grundig demonstration vi har vist begge resultater. Den viste mål er en 5,7 kDa disulfid-rige venom protein med 4 disulfidbindinger. Spektret til venstre viser resultaterne for det protein før reduktion med DTT, da det var efter spaltning og afsaltning uden yderligere intervention. Spektret på højre side viser protein efter reduktion med DTT efterfulgt af afsaltning for at fjerne overskydende DTT. De ioner, der svarer til de eksperimentelle masserne er markeret med pile på spektrum og betegnelsen for hver ion er vist med grønt. De eksperimentelle moder masserne beregnet for disse ioner (for proteinet før reduktion (-DTT), og efter reduktion (+ DTT)) er vist i tabellen. Masserne (5709,6 Da for prøven forud for reduktion og 5717,6 Da for den reducerede prøve) udviser en masse forskel på 8 Da. En masse forskel på 2 Da svarer til tilstedeværelsen af ​​en oxideret disulfidbinding derfor en masse forskel på 8 Da indikerer tilstedeværelsen af ​​fire disulfidbindinger (som forventet) iden ikke-reducerede prøve.

Figur 1
Figur 1.. Skematisk repræsentation af high throughput udtryk screening protokol. Ved hjælp af denne protokol, kan 96-384 betingelser blive testet af en enkelt person i en uge ved hjælp af manuelle metoder, eller op til 1.152 betingelser med den beskrevne semi-automatiseret udstyr. Ekspressionsplasmider konstrueres ved anvendelse af en rekombination kloningsteknologi så mange mål kan være sub-klonet på én gang. Når opløselige ekspressionsbetingelser er blevet identificeret og spaltning udføres, hvis det ønskes, kan proteinet videre til kvalitetskontrol til at kontrollere oxidation og renhed, microassays og / eller stor-skala produktion.

Figur 2 Figur 2. Skematisk til universel rekombinatorisk kloning og konstruere design. Fra placeringspunktet kloner, kan flere ekspressionsvektorer subklones i et enkelt eksperiment i et højt gennemløb mode (op til 6 x 96 entry kloner i en uge). Det udtrykte protein koder for et His-tag for nikkel affinitetsoprensning. Den DsbC (der mangler sin sekvens periplasmiske signal til cytoplasmatisk ekspression) fusionspartner bruges til at øge opløselighed og / eller støtte foldning og korrekt oxidation af målproteinet. Bemærk, at målet sekvens bør indeholde en N-terminal TEV protease stedet (ENLYFQ), hvis der ønskes tag spaltning. De indsatte øverst til venstre viser produktionen af ​​entry kloner ved hjælp af en donor vektor og målsekvenser, som kan opnås ved PCR eller gensyntese. Adgangskrav kloner kan også fås fra kommercielle entry klonsamlingerne. Flere rekombinatoriske kloningssystemer er til rådighed, men vi udnytter Gateway system, som vist skematisk.

Figur 3
Figur 3.. Højkapacitetsscreening pipeline for flere disulfid-rige mål. Mål i første omgang udtrykt som HIS-DsbC fusioner i cytoplasmaet i BL21 (DE3) pLysS E. coli ved 37/17 ° C ved hjælp af auto-induktion medium (ZYP-5052). Oprensning udføres på nikkel harpiks efterfulgt af påvisning af opløselige konstruktioner efter HTP elektroforese (eller dot blot / SDS-PAGE). Hvis den første runde af udtryk screening er mislykket, er alternative dyrkningsbetingelser prøvet. Hvis konstruktioner producere opløselige proteiner i høje nok udbytter, microassays og kvalitetskontrol kan udføres, og, om nødvendigt, kan stor-skala produktion videreføres. For mål, hvor opløselige udbytter ikke er høj nok, kan udtryk screening fortsætte med alternativ strains og temperaturer så andre fusionspartnere og periplasmatisk udtryk. Valgfrie trin er angivet med stiplede bokse.

Figur 4
Robot Arbejdsbord setup Figur 4.. Til HTP-platformen Layoutet af vores væskehåndtering robot arbejdsbord vises, selvom der også kan anvendes alternative arbejdsborde. Forudsat at der er tilsvarende arealer til rådighed. Opsætningen består af en vask station (WS) til (8-kanals væskehåndteringssystem hoved (liha)), to mikroplatte luftfartsselskaber med 4 positioner hver (MP4, position 1-4 og 5-8), en vakuum-station med 2 positioner (Te-Vacs, positioner 9 og 10), en mikroplade luftfartsselskab med 3 positioner (MP3, position 11-13), to plade shakers med 2 positioner hver (Te-Shakers, positioner 14-15 og 16-17) og et luftfartsselskab for engangsspidser med 3 positioner (Diti, positioner 18-20). Desudenre er to hotel bærere for dyb brønd plader og en til mikroplader (ikke vist). Det er installeret på det flydende håndteringsrobot hardware er en 96-multikanal arm (MCA96) til brug med engangs tips, en 8-kanals væskehåndteringssystem hoved (liha) med faste tips og en robot manipulator (Roma), der bevæger plader / udstyr rundt på arbejdsbordet. Nummereringen af ​​positionerne er refereret til i hele protokollen.

Figur 5
Fig. 5. Skematisk til overførsel fra en enkelt plade med 96 brønde i fire 24-brønds plader.

Figur 6
Fig. 6. Repræsentative resultater er vist for ekspression skærm 96 disulfid-rige venom proproteiner. Proteinerne blev udtrykt som HIS-DsbC fusioner i cytoplasmaet og renses under anvendelse af 50 pi nikkel harpiks (Protokol 8.2-B). A) Expression screening resultater, viser virtuelle gel og scorede for udtrykket udbytte. Kontrasten i den virtuelle gel er justeret lane-til-bane for at kompensere for meget svage eller intense bånd. Bemærk at for nogle mål kan ses to bånd, det øverste bånd svarende til det intakte fusionsprotein og det nedre bånd svarende til fusion tag alene. B) Den andel af proteiner udtrykt på hvert udtryk niveau i forhold til antallet af disulfidbindinger i proteinet. Det faktiske antal af proteiner i hver gruppe er overlejret på grafen. C) Fordelingen af ekspressionsniveauer baseret på isoelektriske punkt (pI), og antallet af rester. D) Et eksempel på massespektrometri resultater for et 5,7 kDa disulfid-rige gift protein med 4 disulfidbindinger. Spektret påden venstre side viser proteinet før reduktion med DTT og spektret på højre side viser reduceret med DTT og derefter afsaltet protein. De ioner, der svarer til de eksperimentelle masserne er markeret med pile og deres opgaver er vist i grøn. De eksperimentelle masserne for proteinet før reduktion og efter reduktion er vist i tabellen og udviser en masse forskel på 8 Da, svarende til tilstedeværelsen af oxideret protein før tilsætning af reduktionsmiddel. Klik her for at se en større version af dette tal .

Component Opskrift Kommentar
ZY ~ 928 ml
10 g trypton
5 g gærekstrakt
925 ml vand
Mix og derefter autoklaveres at sterilisere. 2 M MgSO4 100 ml
49,3 g MgSO4 · 7H 2 O
~ 60 ml vand
Rør rundt indtil opløst derefter autoklaveres for at sterilisere.
50x 5052 1 L
250 g glycerol
730 ml vand
25 g glucose
100 g α-lactose
Tilføj i rækkefølge, rør over varme, indtil alle opløste derefter autoklaveres for at sterilisere.
20x NPS 1 L
900 ml vand
66 g (NH4) 2 SO4
136 g KH 2 PO4
142 g Na 2 HPO 4
Tilføj i rækkefølge og rør indtil alle opløste derefter autoklaveres for at sterilisere.

Tabel 1.. Opskrift på komponenter af ZYP-5052 medium.

Discussion

Der er ingen enkelt universel protokol for ekspression af opløselige, foldede, funktionelle proteiner. At være omkostningseffektive og tid-effektive, de fleste laboratorier eller protein core faciliteter, der arbejder med flere mål derfor benytte high throughput protein udtryk screening for at finde den bedste »generiske« kombination af variabler til at opnå et opløseligt aktivt protein for de fleste af målene. Vi har identificeret DsbC som en generelt anvendelig fusionspartner for den opløselige ekspression af disulfid-rige peptider og proteiner 11. Brug DsbC fusioner og high throughput metoder inden for en uge den opløselige udtryk for flere mål kan observeres 11 og derefter yderligere variabler, som dem omtalt i indledningen, kan screenes i de efterfølgende runder på de mål, der kræver yderligere optimering. De heri beskrevne protokoller er rettet mod ekspression af disulfid-rige proteiner og peptider. Men for brugere, der ønsker at expRESS ikke-retikulerede proteiner i en high throughput måde, har de tilsvarende protokoller blevet offentliggjort tidligere, og kan findes andre steder 22,24.

Den high throughput opsætning er ideel til en række anvendelser, herunder screening af et stort antal forskellige proteiner til opløselige ekspression eller screening af et stort antal ekspressionskonstruktioner (herunder forskellige fusion tags) for flere målgener på samme tid ( eller flere ekspressionskonstruktioner for et enkelt mål) for at forbedre succesraten. Platformen kan også bruges til benchmarking og validering af nye protokoller på en lang række mål. Andre anvendelsesområder omfatter screening af varianter for en enkelt vanskeligere mål, fx alle orthologer eller medlemmer af samme familie, eller teste succes i produktionen af et panel af mutanter af et enkelt mål i et eksperiment. Denne protokol er også blevet anvendt i kombination med co-ekspressionsvektorer (with en mærkede protein) for at tillade pull down og indledende karakterisering af protein-protein-komplekser efterfulgt af mere grundig biofysisk analyse for at bekræfte korrekte kompleks dannelse og støkiometri 33. Mængden af protein renses undertiden egnet til mikro-assays (funktionelle tests, protein-DNA 34 eller protein-protein interaktion assays). Der er flere fordele til high throughput screening ekspression strategi: (i) evnen til at afprøve en lang række mål eller et stort antal variabler i et enkelt eksperiment, (ii) begrænset batch-til-batch variation, (iii) enkelhed og lethed i at arbejde på en mindre skala ved hjælp af dybe brønde, (iv) skalerbarhed og reproducerbarhed på større skala, (v) muligheden for automatisering, og (vi) enkelhed sporing og håndtering (ingen mærkning af enkelte rør, mindre fejltagelser, der blev indført ved brug af pladeformat end med håndtering af enkelte rør i blanding eller udveksling af kloner).

24. For at opnå maksimal effektivitet, er det gavnligt at have et passende system til high throughput kloning, at forenkle sub-kloning af et stort antal mål. For den indledende fase af VENOMICS projektet udnytter vi den alsidige Gateway rekombinationssystemet 25, der tillader subkloning i enhver destination vektor i et tempo på hundredvis af kloner ugen. Protokoller til Gateway rekombination kloning kan findes på Invitrogen hjemmeside. Andre alternativer til high throughput kloning omfatter ligatur-uafhængig kloning (LIC) 35,36 og begrænsning (RF) kloning 37.. Der er flere måder at opnå målgenerne for ytringsfriheden, herunder ved PCR fra skabelon-DNA, fra entry klonsamlingerne ellersyntetiske gener, som er den strategi, der er valgt til VENOMICS projektet. Syntetiske gener kan bestilles med rekombinationssites i hver ende af genet og gensyntese tillader nem kodonoptimering af målgenet sekvens (for at udelukke sjældne E. coli kodoner). Det anbefales, men ikke afgørende. For mål uden kodonoptimering, der indeholder et stort antal sjældne codons, Rosetta 2 (DE3) pLysS (som bærer tRNAs for sjældne codons, der ikke er stærkt udtrykt i E. coli) kan være bedre egnet end BL21 (DE3) pLysS. Mens der er stammer til rådighed, begrænse reduktionen af disulfidbindinger i den normalt reducerende miljø i cytoplasmaet, i vore hænder de har ikke været så vellykket som regelmæssig E. coli-stammer 11.

Analytisk skala affinitetsrensning udføres fra testudtrykket kulturer med henblik på at inddrive de opløselige fusionsproteiner og kvantificere udbyttet. Kvantitative data kan fås på the opløselige udbytter af fusionsproteiner udtrykt i et område fra 0,1 til 100 mg / l kultur. Hvis målet ikke er opløseligt, kan alternative udtryk og induktion temperaturer, stammer eller medier testes, inden de forskellige fusionspartnere forfølges. Til opløselig ekspression af disulfid-rige proteiner, vi tidligere rangeret effekten af fusionspartnere som DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> HIS-tag for cytoplasmatisk udtryk 11. Periplasmisk ekspression er en anden mulighed, der kan hjælpe en vellykket foldning af disulfid-rige mål. Periplasmaet er mindre reducerende miljø end cytoplasmaet og indeholder nyttige redox chaperoner til at bistå disulfidbinding. DsbC, DsbA, og MBP-proteiner normalt lokaliseret til periplasmaet deres periplasmatiske signalsekvenser. Dette giver mulighed for at udnytte disse tags til direkte disulfid-rige mål til det periplasmiske rum med henblik på at hjælpe foldningen. For vanskelige targets, vil det næste skridt være at purify det uopløselige HIS-tagget target fra inklusionslegemer, solubilisering og foldes igen (dette er uden for rammerne af denne protokol og vil ikke blive diskuteret her 3 9). Dette kan være forholdsvis enkelt for mål med kun en eller to disulfidbindinger, men bliver mere og mere vanskeligt, da antallet af disulfidbindinger stiger. Alternativt, og især for proteiner og peptider med fire eller flere disulfidbindinger, kan det være fordelagtigt at prøve mere komplekse produktionssystemer, såsom gær, insekt eller mammal ekspression.

Med fremskridt inden for miniaturisering og automatisering, vil HTP elektrofysiologi lab-on-a-chip teknologi 28 uden tvivl være vejen for fremtiden for funktionelle analyser. Vi forestiller os, at til de fleste formål (måske med undtagelse af strukturelle studier), vil ophæve behovet for store skala kulturer. Lille skala kulturer vil ikke kun være anvendelige til screening af ekspressionsbiblioteker betingelser, men også være i stand til at tilvejebringe tilstrækkekeligt mængder af prøven for disse miniaturiserede funktionelle assays. Evnen til at producere flere mål parallelt i tilstrækkelige mængder til funktionel karakterisering vil sænke omkostningerne ved dyrkning og brug af disse slags platforme, vil ekspression og karakterisering af rekombinante proteiner blive mere omkostningseffektive og tid-effektive.

Protokollerne heri er blevet anvendt til at udtrykke disulfid-rige peptider og proteiner i den indledende fase af FP7 europæiske VENOMICS projekt. Gifte er en glimrende kilde til bioaktive peptider, der ofte har interessante farmakologiske potentiale. Men deres produktion er udfordrende på grund af deres komplekse disulfid-bonding mønstre og lille størrelse. Ved hjælp af high-throughput platforme som den er beskrevet heri, VENOMICS projektet har til formål at generere et bibliotek på 10.000 nye venom peptider til at gengive mangfoldighed observeret i naturen. Dette bibliotek vil blive udnyttet til karakterisering af disulfid-rICH-peptider med potentielle farmakologiske eller terapeutiske anvendelser med henblik på at udvikle nye lægemidler. Platformen er i øjeblikket bliver brugt til benchmarking og validering af nye protokoller til brug i VENOMICS projektet.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af The VENOMICS projektet europæisk projekttilskud nr. 278.346 gennem det syvende rammeprogram (FP7 HEALTH 2011-2015). Den VENOMICS Projektet er et samarbejde mellem flere forskningsinstitutioner og virksomheder i Europa:

AFMB, Aix-Marseille Université (Frankrig), CEA Saclay (Frankrig), NZYTech (Portugal), SistemasGenomicos (Spanien), Université de Liège (Belgien), VenomeTech (Frankrig), Vitamib (Frankrig), Zealand Pharma (Danmark)

Dette arbejde blev støttet af den franske infrastruktur for Integrated Strukturel Biologi (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01.

Forfatterne vil også gerne takke hr. Jeremy Turchetto for at bistå med forberedelserne til optagelserne af videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot Tecan Group Ltd. Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates.
http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
96-well PCR (PCR96) plates Greiner Bio-One 652270 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medium Autoclaved for sterility.
Antibiotic stocks Kanamycin (50 mg/ml), ampicillin (100 mg/ml), chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at −20 °C. Use a 1:1,000 dilution.
Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity Greiner Bio-One 780270 Autoclaved for sterility.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Expression vectors For the expression of target constructs. Store at −20 °C.
BL21 (DE3) pLysS competent cells Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C.
Breathseal breathable adhesive film Greiner Bio-One 676050
PCR machine with 96-well plate block For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.
24-well sterile tissue culture plates Greiner Bio-One 662165 http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar Autoclaved for sterility.
200 μl sterile disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 617 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Multitron shaking incubator, with 3 mm throw Infors AJ103 Not essential, a regular shaking incubator can also be used.
http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Plate incubator
Microtiter plate For glycerol stocks and elution using purification protocol B.
Glycerol For the preparation of glycerol stocks.
200 μl disposable tips Tecan Group Ltd. 30 038 616 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Adhesive tape pads  Qiagen 19570 http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl Orapi Group Or equivalent microbial disinfectant.
ZYP-5052 medium See Table 1 for recipes of components.
Deep well 24 (DW24) plates, 10 ml capacity Whatman 7701-5102 Autoclaved for sterility.
http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Flat-bottomed, clear microtiter plate Greiner Bio-One 655101 For absorbance readings.
http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Plate reading spectrophotometer Optional. For measuring OD600 of cultures.
Centrifuge with rotor for deep well plates  Suitable for 3,800 x g.
Lysozyme 50 mg/ml in water. Store at −20 °C.
Imidazole ACS grade Merck IX0005-1 A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.
Lysis buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.
Water bath
Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) Misonix Inc. Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.
DNase  2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C.
Magnesium sulphate (MgSO4) 2 M stock in water, autoclaved.
SDS-PAGE or Caliper sample buffer 
Binding buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Wash buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
Elution buffer 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C.
96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity Macherey-Nagel 740686.4 http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μl disposable wide bore tips Tecan Group Ltd. 30 050 348 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Fast Flow resin GE Healthcare 17-5318-02 For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use.
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Tobacco Etch Virus (TEV) protease Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C.
96-well 0.22 µm filter plate Millipore MSGV N22 10 Optional. To filter the soluble fraction after cleavage.
http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion.
Spectrophotometer and cuvettes For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.
ZipTip pipette tips Millipore Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control.
http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berrow, N. S., et al. Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).
  2. Correa, A., Oppezzo, P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening. Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).
  3. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5, 135-146 (2008).
  4. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).
  5. Graslund, S., et al. The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins. Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).
  6. Bird, L. E. High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli. Methods. 55, 29-37 (2011).
  7. Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).
  8. Kapust, R. B., Waugh, D. S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).
  9. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).
  10. Marblestone, J. G., et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).
  11. Nozach, H., et al. High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli. Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).
  12. Sachdev, D., Chirgwin, J. M. Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification. Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).
  13. Smith, D. B. Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies. Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).
  14. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  15. Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli. Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).
  16. de Marco, A. Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria. Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).
  17. Katzen, F., Beckwith, J. Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli. Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).
  18. Klint, J. K., et al. Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli. PloS One. 8, e63865 (2013).
  19. Braud, S., et al. Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins. Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).
  20. Douzi, B. G. A., et al. A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry). Advances and new technologies in toxinology. 149-152 (2010).
  21. Groisillier, A., et al. MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms. Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55, 65-72 Forthcoming.
  23. Xiao, R., et al. The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).
  24. Saez, N. J., Vincentelli, R. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. Chen, Y. W. 1091, Humana Press. 33-53 (2014).
  25. Katzen, F. Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system. Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
  26. Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format. Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).
  27. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).
  28. Spencer, C. I., et al. Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics. Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).
  29. Sala, E., de Marco, A. Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography. Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).
  30. Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction. Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).
  31. Zanier, K., et al. Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, Science. New York, N.Y. 694-698 (2013).
  32. Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. The P1' specificity of tobacco etch virus protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).
  33. Vincentelli, R., Romier, C. Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex. Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).
  34. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  35. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).
  36. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  37. van den Ent, F., Lowe, J. RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).
  38. Vincentelli, R., et al. High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats