Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Neuroscience

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Summary

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

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Stewart, R. S., Kiss, I. M., Wilkinson, R. S. Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (86), e51477, doi:10.3791/51477 (2014).

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Abstract

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung Licht verwendet wurde, um das Verhalten von Kleinstrukturen im motorischen Nervenenden der dünnen trans studieren abdominis des Strumpfbandnatter. Raw-Daten umfasst Zeitraffer-Sequenzen von 3D-z-Stacks. Jeder Stapel enthält 4-20 Bilder mit Epifluoreszenz Optik bei Brennebenen von 400-1,500 nm getrennt erworben. Schritte bei der Erfassung von Bildstapeln, wie beispielsweise die Einstellung des Fokus, Schalten der Anregungswellenlängen, und der Betrieb der Digitalkamera, so weit wie möglich, die Bildrate zu maximieren und Gewebeschäden durch Lichteinwirkung zu minimieren automatisiert. Nach der Übernahme wird ein Satz von Bildstapeln entfaltet, um räumliche Auflösung zu verbessern, umgerechnet auf die gewünschte 3D-Format und verwendet, um ein 4D "-Film," dass ist geeignet für eine Vielzahl von computerbasierten Analysen, je nach den experimentellen Daten gesucht erstellen. Eine Anwendung ist das Studium der Dynamik von zwei Klassen von Endosomen in den Nervenenden-macroendosomes gefunden (MES)und saure Endosomen (AES), deren Größen (200-800 nm für beide Typen) sind an oder nahe der Beugungsgrenze. Zugriff auf 3D-Informationen zu jedem Zeitpunkt bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Zeitraffer-Bildgebung. Insbesondere, Größe und Geschwindigkeit der Bewegung der Strukturen über die Zeit ohne Verlust von Schärfe quantifiziert werden. Beispiele für Daten aus 4D-Bildgebung zeigen, dass KU nähern sich der Plasmamembran und verschwinden, was darauf hindeutet, dass sie eher als exocytosed einfach vertikal bewegt weg von einer Ebene des Fokus. Auch offenbart ist putative Fusions MES und AES, durch Visualisierung der Überlappung zwischen den beiden Farbstoff-enthaltenden Strukturen, wie in je drei orthogonalen Projektionen angesehen.

Introduction

Zeitraffer-Bildgebung von lebenden Gewebe bietet visuelle Zugriff auf dynamische Struktur-Funktions-Beziehungen, die nicht in festen Zubereitungen oder leben in einem einzigen Punkt in der Zeit abgebildet geschätzt werden kann. Oft aber der Kompromiss für den Zugriff auf Zeitinformation ist eine Abnahme der optischen Auflösung. Hoher numerischer Apertur Öl-Immersionsobjektive sind unpraktisch in lebendem Gewebe wegen ihrer engen Bereich der Schwerpunkt, so dass Eintauchen in Wasser oder Trocken Ziele als die einzigen Alternativen. Darüber hinaus kann die erhöhte Auflösung durch konfokale Optik lieferte in einigen Lebens Vorbereitungen durch Phototoxizität von dem relativ hohen Niveau der Beleuchtung erforderlich 1,2 verwendet werden. Schließlich, während mehrere Echtzeit oder Zeitraffer-optische Techniken zur Verfügung, die eine verbesserte Auflösung bieten, ihre Anwendbarkeit auf Zubereitungen, für die Strukturen von Interesse nur wenige hundert Nanometer von der Ziel-1 positioniert werden beschränkt. Das beschriebene Verfahrenmacht von relativ kostengünstigen Ausrüstung ist vielseitig und bietet dennoch eine verbesserte Auflösung im Vergleich zu gebräuchlicheren Zeitraffertechniken. Es ist für den Einsatz in einzelnen Labors sowie Imaging-Einrichtungen vorgesehen.

Das Verfahren verwendet herkömmliche Epifluoreszenzmikroskopie, kombiniert mit einer empfindlichen digitalen Kamera und mit Hardware zur schnellen Sätze von Bildern erfassen mit leicht unterschiedlichen Brennebenen (Z-Stapel). Jedes Z-Stapel wird digital entfaltet, um die Auflösung zu erhöhen. Ein Merkmal der 3D Zeitraffer (4D)-Bildgebung ist präzise Verfolgung bewegter Organellen oder anderen Strukturen. Wenn richtig eingerichtet ist, nicht abgebildeten Strukturen nicht aus dem Fokus zu gehen, und die Bewegung in allen drei Richtungen beobachtet und quantifiziert werden. So ist es unmöglich für einen Bunt Struktur, um über eine oder mehrere Zeitraffer-Frames nur durch Driften über oder unter einem schmalen Brennebene verschwinden. Das Verfahren dient auch als empfindlich für die Beurteilung der Wechselwirkungen und mögliche fusion von kleinen Strukturen. Konventionelle Epifluoreszenz oder konfokale Bilder von Strukturen in der Nähe der Beugungsgrenze (ein paar hundert nm) nicht bestätigen Fusion zusammengeführt, auch wenn Bilder zeigen Überlappung der jeweiligen Etiketten 3. Fusion vorgeschlagen, aber es weiterhin möglich, dass die Objekte horizontal oder vertikal um eine Distanz, die unterhalb der Beugungsgrenze ist, abgetrennt. Drei-oder vierdimensionalen Abbildung, dagegen ermöglicht die Anzeige der Objekte in jeder der drei orthogonalen Richtungen. Das Aussehen der Fusion in allen drei Ansichten erhöht den Grad der Gewissheit. Und in einigen Lebensmittel, gerichtet oder Brownsche Bewegung der vermeintlich abgesichert Objekte ist ein weiterer Beweis, wenn beide Etiketten in der Zeit zusammen zu bewegen. Natürlich, wenn in der Nähe der Beugungsgrenze das Niveau der Sicherheit in anspruchsvollen Strukturen von Hintergrund oder zeigen, dass sie zwei Farbstoffe (Fusion) enthalten, ist nicht absolut. Ggf. spezielle Techniken, wie Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)4, sind besser geeignet.

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Protocol

1. Stain die Zubereitung mit Supravitalfarbstoffe

  1. Für die Strumpfbandnatter Dissektion Protokoll sehen Stewart et al. 5 und Teng et al. 6 Reptilien-Gewebe bleibt physiologische für längere Zeit und mit weniger bakterielle Verunreinigung, wenn sie bei niedrigen Temperaturen gehalten (siehe unten). Säugergewebe wird üblicherweise bei Raumtemperatur oder höher gehalten wird.
  2. Für lysosomale Vitalfarbstoff-Färbung, lösen den Farbstoff in kalten Reptilien Ringer-Lösung 1:5000 (0,2 uM). Inkubieren bei 4 ° C für 15 min. Mehrmals mit kaltem Ringers waschen. Bild so schnell wie möglich.
  3. Für FM1-43 Färbung mit KCl-Stimulation, verdünnen den Farbstoff in hoher KCl Ringers 1:500 (7 uM). Inkubieren bei 4 ° C für 30-60 Sekunden maximal. Schnell waschen dreimal mit kaltem Ringers, ~ 1 min / Spülung. Bild so schnell wie möglich.
  4. Für FM1-43 Färbung mit hypertoni (Saccharose) Stimulation, verdünnen den Farbstoff in 0,5 M Saccharose Ringers wie oben. Inkubation bei 4 & #176, C für 2-5 min. Wie in Schritt 1.3 oben mit kaltem Ringers. Bild so schnell wie möglich.
  5. Für FM1-43-Färbung durch elektrische Stimulation, siehe Teng et al. 6. Kurz gesagt, wird die Herstellung einer Schale mit physiologischer Kochsalzlösung und der Farbstoff gegeben. Der Nerv wird mit einem vorprogrammierten Zug von 200 Mikrosekunden Rechteckimpulse (~ 7 V, 30 Hz, 18 Mikrosekunden) stimuliert. Wie in Schritt 1.3 oben mit kaltem Ringers. Bild so schnell wie möglich.

2. Konfigurieren Sie die Vorbereitung für Imaging

  1. Richten Sie die Vorbereitung so, dass die Strukturen von Interesse sind, so nah wie möglich an der Mikroskopobjektiv.
  2. Wenn ein inverses Mikroskop verwendet wird, nutzen eine Kammer, deren Boden enthält eine dünne runde Deckglas. Typischerweise sollte die Abbildungskammer haben eine dünne Edelstahlboden mit einem Durchmesser von 25 mm Dicke Nr. 1 Deckglas in der Mitte. Wenn ein aufrechtes Mikroskop verwendet wird, wird eine Unterdeck nicht erforderlich, aber ist nützlichBildgebung mit Durchlicht ermöglichen (zB Differentialinterferenzkontrast, DIC), um die Probe zu orientieren und suchen Objekte von Interesse.
  3. Wählen Sie einen geeigneten Ziel, die höchstmögliche 3D Auflösung zu erhalten. Es gibt Kompromisse zwischen numerischen Apertur (NA), Arbeitsabstand, Vergrößerung und Objektivtyp (trocken, Wasser-und Ölimmersion). Für dünne Präparate wie Gewebekulturen, sind Öl Ziele am besten. Mit einem aufrechten Mikroskop, schweben ein Deckglas auf dem wässrigen Bad, und verwenden Immersionsöl zwischen der Oberseite des Deckglases und dem Ziel.
  4. Wenn Entfaltungs Software verwendet wird, kann der Verkäufer vorbestimmten Punktbildfunktionen (PSF) für bestimmte Ziele zu liefern. Wenn keine solche Informationen zur Verfügung gestellt, oder wenn eine nicht unterstützte Ziel gewählt wird, bestimmen die PSF durch bildgebende Fluoreszenzmikropunkte oder ähnliche Objekte beugungsbegrenzten 7,8.

3. Stellen Sie die gewünschte Schärfentiefe und Anzahl der Images Wunsch pro Zeitraffer-Rahmen

  1. Wählen Sie die Gesamttiefe, so dass die Interaktion bewegt oder Strukturen der Interessen nicht verschwinden oder gehen aus dem Fokus, wie sie in der z-Richtung zu bewegen. Die z-Bereich sollte die vertikale Abmessung der Zelle oder Zellfort abzubildenden leicht übersteigen. Für Wirbelmotorklemmen, ist 15-20 um typisch.
  2. Berechnen der Z-Achsen-Stufe für jedes Inkrement des Fokus nötig. Auflösung entlang der z-Achse variiert in Abhängigkeit von Eigenschaften des Ziels; es ist etwa ein Viertel der xy-Ebene Auflösung. Wenn entweder konfokale Bildgebung oder Entfaltungs Software verwendet wird, wird der z-Achsenauflösung verbessert. Verbessern endgültige Auflösung durch gezielte Oversampling in der z-Richtung 5, siehe aber auch unter Schritt 3.3. Eine typische Schrittintervall ist im Bereich von 40 nm für 400-1,500-100X Ziele. Licht sollte während jeder z-Schritt-Bildschalt werden.
  3. Wählen Sie die Anzahl der Bilder pro Z-Stapel, nämlich die gewünschte Schärfentiefe geteiltdurch den Schritt Intervall. Zeit, um eine typische Z-Stapel abzuschließen 1-10 sek. Schnell bewegten Objekten (100 nm / s) erscheinen kann in einer 3D-Bildstapel unscharf, da jeder Bildebene entspricht einem etwas anderen Zeitpunkt. Außerdem trägt jede weitere Bild, um Photobleaching und mögliche Phototoxizität (siehe Diskussion). Wenn eine Situation bezieht, wählen Sie eine größere z-Schritt zu weniger Bilder pro Stapel zu sammeln. Kompensieren Sie später mit Bild-Interpolation-Software (Schritt 6.3).

4. Wählen Sie die Zeitraffer-Bildrate

Wählen Sie durch Experimentieren eine Rate, die gerade ausreichend ist, um sich mit der Zeit wie Bewegung, Wechselwirkungen oder Fusionsereignisse 9 reibungslos zu lösen. Unter Probenahme von Bewegungsartefakten (Stichprobenfehler) produzieren kann, während Oversampling erhöht unnötigerweise die Belichtung. Sammeln entweder eine einzige lange Sequenz oder mehrerer Wiederholungssequenzen aus der gleichen Zubereitung, die jeweils mit einer relativ kleinen Gesamtzeitintervall (

5. Füllen Sie alle Live-Imaging für eine bestimmte Zubereitung

Reptilien-Präparate in der Regel robust bleiben für ca. 1-2 Stunden, länger, wenn gekühlt.

6. Analysieren von Daten gemäß der gewünschten Nutzung

  1. Bewahren Sie alle Rohdaten-Dateien. Während digitale Speicher ist in der Regel kein Problem ist, ist die Verarbeitungszeit sogar bei schnellen PCs oder Workstations signifikant. Aus diesem Grund Zuschneiden von Bildern in einer Region von Interesse [ROI]. Sicher, dass die gesamte Region von Interesse ist der Anbau Fenster während der gesamten Zeitverlauf.
  2. Zu entfalten Bildstapeln mit der entsprechenden Software und den richtigen Point-Spread-Funktion. Bestätigen Sie, dass die Auflösung verbessert und dass kein Artefakt ist durch die erzeugte wordenEntfaltungsalgorithmus. 3 zeigt Beispiele.
  3. Verwenden Sie ein Interpolations-Algorithmus, um z-Achse scheinbare Auflösung erweitern. Ein 6X Expansion von einer tatsächlichen Bild 1,5 um Ebenentrennung zu einer scheinbaren 0,25 um Trennung vorgeschlagen. Alternativ können Sie eine Kombination aus Oversampling (Schritt 3.2) und Interpolation.
  4. Führen Sie Kontrast, Helligkeit, Rauschfilterung, Bleichen und andere typische Bildverarbeitungs Anpassungen, falls gewünscht. Bildbearbeitungsstandards schreiben vor, dass für die meisten wissenschaftlichen Arbeiten, ist es angebracht, dass die gleichen Korrekturen sowohl innerhalb eines Stapels und zu verschiedenen Zeitpunkten auf alle Bilder angewendet werden. Die Folge einer bestimmten Einstellung sollte unter allen Bildern 9 beurteilt werden.
  5. Wählen Sie einen bestimmten Anzeigemodus für den Export von Daten. Die einfachste Display ist mit Stereo-Video entweder Rot-Grün oder Rot-Blau-Anaglyphen (Beispiele in Abbildung 3), Stereo-Paare oder abwechselnd links / Rechtt Augenrahmen mit Shutter-Brille. Anaglyphen sind einfarbige begrenzt. Verbessern scheinbare Bildtiefe, wenn gewünscht, um z-Achse visuelle Auflösung zu verbessern.
  6. Experimentieren Sie mit verschiedenen Filter-und Bildverbesserungstechniken. Zum Beispiel ist Laplace-Filterung nützlich, um den Kontrast von kleinen Strukturen über dem Hintergrund zu erhöhen. Die Helligkeit der Pixel in der Mitte eines Fensters ausgeführt wird verbessert, während die Helligkeit der Umgebung reduziert wird. Beachten Sie, dass einige Filtermethoden nicht gut in Kombination zu arbeiten.
  7. Bewerben Driftkorrektur, wenn es wesentliche Bewegung der Zubereitung über die Zeit. Diese Bewegung ist in lebenden Muskel häufig, auch mit Drogen gegeben, um Aktionspotentiale und synaptische Potentiale zu unterdrücken. Ein Pixel Registrierungsalgorithmus (z. B.. Imaris, Adobe Aftereffects, TURBOREG Plugin für ImageJ) richtet Zeitraffer-Bilder und kann zu reduzieren, aber in der Regel nicht vollständig beseitigen, wie Bewegung.

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Representative Results

Die dargestellten Daten sind aus Schlangenneuromuskuläre Terminals (siehe niedriger und hoher Vergrößerung Blick in Abbildung 3, die endozytischen Farbstoff (FM1-43)-Aufnahme erzeugt eine Trübung, die jeden bouton füllt) und insbesondere macroendosomes (MES) und sauren Endosomen (AEs) innerhalb dieser Klemmen 5. KU werden von Groß Endozytose neuronale Aktivität während 10 erstellt, und ihre Zahl sinkt exponentiell mit der Zeit nach Aktivität 6 eingestellt. Verwendung von 4D Live-Aufnahmen war es, festzustellen, ob KU auf der Plasmamembran zu bewegen und schnell zu verschwinden, was darauf hindeutet, dass ihre Zahl nimmt ab, weil einige von ihnen Exocytose. Alle derartigen KU waren zu einem Zeitpunkt vorhanden ist (und die vor) und an der nächsten Zeitpunkt komplett weg (und die danach). So war die Zeit für das Verschwinden benötigt weniger als unsere Bildintervall (so kurz wie 30 sec) und im Einklang mit Exozytose. Eine alternative Theorie, nicht von 4D-Daten unterstützt wird, ist, dass KU langsam über Knospung v zerstreuenesicles, bis sie verschwinden. Vesikelbildung tritt sechs, aber zumindest einige MES entweder während oder nach angeh 5 exocytosed. Abbildung 1 und S1 Film veranschaulichen das Verschwinden eines ME zwischen zwei Zeitraffer-Frames. KU bestimmt, verschwinden nicht Form oder Helligkeit über zwei oder mehr Frames (N = 16) ändern, was gewesen wäre, die mit langsam Ableitung haben während der Zeitdauer des Films (beginnend mehrere Minuten nach der kurzen Stimulation). ME Verschwinden wurde zuvor in herkömmlichen Zeitraffer beobachtet, aber es war möglich, dass die Strukturen hatte einfach die Fokusebene verlassen. Darüber Ergebnisse sind von einer Vielzahl von Perspektiven (Film S1) bestätigt, dass die ME Verschwinden war plötzlich. Bei herkömmlichen Live-Bildgebung (Blick aus einer Perspektive, zB die xy-Bildebene) Rauschartefakte zu begrenzen Fähigkeit des Forschers, um zu bestätigen, dass eine Struktur war unverändert. Solche Artefakte sind häufig vorhandenin einer Ansicht, andere aber nicht.

Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass in Endosomen Motorklemmen sind klein, in der Nähe der Beugungsgrenze des Lichts 10. Daher Fusion dieser Endosomen kann nicht absolut aus der Nähe räumliche Zuordnung bei Lichtniveau unterschieden werden. KU wurden mit FM1-43 (grün-fluoreszierende) und AES mit einer lysosomalen Vitalfarbstoff (rot-fluoreszierende) markiert. Bauwerke, die in beiden Farben fluoreszieren (erscheint gelb) wurden gelegentlich in 4D-Bilddatensätzen festgestellt. Mit geeigneter Software wurden Ansichten dieser doppelt markierten und damit scheinbar verschmolzen Endosomen aus einer Vielzahl von Perspektive, um die Übereinstimmung der beiden Labels in Voxel in der Nähe und in der scheinbaren Struktur untersuchen generiert. Abbildung 2 zeigt eine mutmaßliche verschmolzen AE-ME ab drei orthogonalen Richtungen betrachtet. Eine Ansicht ist die xy-Ebene; die anderen Ansichten sind orthogonal zu dieser Ebene und zueinander. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde festgestellt, dass Voxelentweder überlappen, wie in diesem Beispiel, oder dass sie eindeutig nicht in einer oder mehreren Betrachtungsebenen. Film S2 zeigt die gleiche putative fusioniert AE-ME als interaktive virtuelle Realität Anzeige (in 3 Dimensionen voll drehbar) dargestellt.

Digitale Entfaltung ist ein nützliches Werkzeug zur Verbesserung der Auflösung von 3D sowie 4D-Bilder aus konventionellen und konfokale Mikroskope 11. Dekonvolution eine numerische iterative Prozess gleicht in gewissem Maße für eine begrenzte räumliche Auflösung des verwendeten Objektivs. Diese Resolution wird als Point Spread Function-das 3D-Volumen des Objektivs durch das Bild einer unendlich kleinen Punkt gekennzeichnet besetzt. Theoretisch Entfaltung wieder das Bild, das entstehen würde, wenn das Ziel waren perfekt. Figur 3 ist eine 3D-Volumenansicht von zwei verschiedenen Datensätzen, die jeweils als ein Paar von Rot-Grün Anaglyphenverfahren angezeigt. Die rechten Bilder zeigen typische Verbesserung der Schärfe nach digitaler deFaltung des Bildstapels.

Figur 1
Abbildung 1. Macroendosome A (ME) verschwindet nach offensichtlich Kontakt mit der Plasmamembran. Eine Schlange Nerv-Muskel-Präparat wurde elektrisch in Gegenwart von FM1-43 stimuliert. Daten wurden unter Verwendung von 4D-Bildgebung, wie in Methoden beschrieben und werden als "3D-Volumenansichten" an sechs Zeitpunkten (60 s Intervall) angezeigt, um die Z-Tiefe eines einzelnen bouton illustrieren gesammelt. Ein ME kann weg von der Y-Achse (rot gestrichelte Linie) über mehrere Rahmen, bevor er zwischen den Zeitpunkten 5 und 6 beobachtet werden. Kurz vor Verschwinden, erscheint die ME bei Plasmamembran der Bouton (durch FM1-43 Vesikel abgegrenzt sein Färbung oder "Dunst," Legende siehe Abbildung 3). Die ME nicht wieder inspäter Zeitpunkten (Daten nicht gezeigt, siehe Film S1). Maßstabsbalken, 2 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

MOVIE S1:. 4D Zeitraffer-Blick auf ME Verschwinden Klicken Sie hier, um Film anzusehen. Das gleiche Rohdatensatz in Abbildung 1 dargestellt ist als ein "4D-Volumen-Ansicht" mit einem niedrigeren Vergrößerungs gezeigt. Die ursprüngliche Zeitraffersequenz umfasst acht Zeitpunkten, die jeweils von 60 Sekunden voneinander getrennt sind; Wiedergabe ist bei 4 Bilder / Sek. Die Sequenz wird kurz am Anfang jedes der 24 3D-Rotation Schritte um die y-Achse (15 Grad / Schritt) hielt inne, um Aufmerksamkeit auf die bald-zu-sein Verschwinden ME (roter Pfeil). Beachten Sie, dass die ME sichtbar ist, nähert sich der Rand des Bouton (Plasmamembran), verschwindet und kehrt nicht zurück, inAlle Anzeigen Perspektiven. Wegen der z-Achse Auflösung niedriger im Vergleich zu xy-Auflösung, wird die Form der ME zu verlängern und zu verkürzen, je nach Blickperspektive. Die Bilder wurden als Quicktime-Film exportiert, und kommentierte mit Quicktime Pro. Maßstabsbalken, 2 um.

Figur 2
Ein Nerv Muskel-Präparat Abbildung 2. Orthogonale Ansichten eines mutmaßlichen verschmolzen Endosomen. Wurde nacheinander mit einer lysosomalen Vitalfarbstoff (rot) gefärbt, um AEs und FM1-43 (grün) markieren, um zu kennzeichnen KU unter Verwendung von 0,5 M Saccharose-Stimulation, wie in Methoden beschrieben. Daten von einem Zeitpunkt von einer 4D-Film als 3D-Volumen-Ansichten in drei Orientierungen angezeigt. An der Spitze (Panels 1-3) ist die herkömmliche Ansicht von oben (xy-Ebene). Bei mittleren (4-6 Platten) ist eine Ansicht senkrecht zu der xy-Ebene undin der (beliebige) Richtung der großen roten Pfeil. Im Grunde (Panels 7-9) ist eine Ansicht senkrecht zueinander zu beiden Ansichten oben in Richtung des großen blauen Pfeil. Ein ME (grün) wird durch einen grünen Pfeil gekennzeichnet; zwei AEs (rot) werden durch rote Pfeile gekennzeichnet. Ein Endosomen, die beide Farbstoffe (gelb) wird durch einen gelben Pfeil in Platten 3, 6 markiert und 9. Beachten Sie, dass Überschneidungen von Rot und Grün ist ebenso komplett in allen drei orthogonalen Projektionen. Maßstabsbalken, 2 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

MOVIE S2:. Interaktive Dreh Bild mit KU und sauren Endosomen AEs . Klicken Sie hier, um Film anzusehen Der Datensatz von 2 ist als voll drehbaren 3D-Bild (Quicktime Virtuelle Reali konfiguriert gezeigtty-Format; verwenden Sie die Maus, um das Bild zu drehen für die Anzeige von jeder Richtung). Die mutmaßlichen verschmolzen ME / AE bleibt gelb aus allen Perspektiven.

Fig. 3
Abbildung 3. 3D Dekonvolution verbessert die räumliche Auflösung. Zwei typische Schlange Nervenenden, bei niedrigen (oben) gezeigt und hohe (unten) bzw. Vergrößerung und während der Stimulation mit FM1-43 gefärbt. FM1-43 Hintergrund "Dunst", durch Kennzeichnung von einzelnen 50 nm Vesikel, zeigt die Form der Klemme Boutons, in dem KU beschränkt sind. Die Daten werden als Rot-Grün Anaglyphen 3D-Ansichten angezeigt Volumen (Tiefe mit rot-grün oder rot-blaue Brille visualisiert werden, rot auf dem linken Auge, Anm. der Axon oben links hinab in die Ebene des Terminals von oben). Linke Platten: Rohdaten; Rechts Platten: Daten nachEntfaltung. Beachten Sie die deutliche Verbesserung der Auflösung von MES. Top-Panels: Die elektrische Stimulation; gesamte Terminal gezeigt (~ 30 x 50 um) (gleiche Rohdaten wie in Abbildung 1 und Film-S1; Maßstab, 10 um). Bodenplatten: KCl-Stimulation; vergrößert, um vier Einzel Boutons (~ 3 x 5 um, Maßstabsbalken, 2 um) zu zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Der wichtigste Aspekt der 4D-Bildgebung ist das Management von der Dauer und Intensität der Lichteinwirkung. Photobleichen abnimmt Bildsignal-zu-Rausch-Verhältnis und kann problematisch oder nicht in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Auswahl der Fluorophore sein. Unspezifische Schäden an lebendem Gewebe (Phototoxizität) auf Photobleaching bezogen, und kann manchmal mit Fluoreszenzsonden für die Zwecke 2,12 oder durch Prüfung der Morphologie mit geeigneten Hell Optik, wie Differentialinterferenzkontrast (DIC) entworfen identifiziert werden.

Es ist jedoch möglich, um eine physiologische Wirkung, die auf Licht deutlich unter der Größe der Personen mit Photobleaching und Phototoxizität assoziiert auftritt induzieren. Beispielsweise in der frühen Experimente mit mehreren Präparaten, die jeweils zu einem anderen Zeitpunkt nach der Stimulation fixiert wurde die Geschwindigkeit, mit der MEs verschwand mit der Zeit nach einer kurzen Stimulation 6 gemessen. Wie üblich to minimieren Fading, wurden die Vorbereitungen im Dunkeln gehalten, bis sie angesehen wurden. Wenn ähnliche Experimente wurden mit 4D Live-Bildgebung, blieben viele mehr KU während des Experiments (~ 20-60 min) und nicht verschwinden. Die Verwendung der gleichen Live-Imaging-Protokoll, mit Ausnahme der eigentlichen Aufnahme nicht und damit die Begrenzung der Belichtung zu einem einzigen 3D-Rahmen am Anfang und einem einzigen Frame am Ende, wieder die erwartete Gesamtrate der Endosomen Verschwinden der von festen Zubereitungen.

Weitere Problemlösungen an, dass die Geschwindigkeit des Verschwindens war teilweise umgekehrt und monoton zu Gesamtlichtexposition während eines Experiments zusammen. Nach erfolglosen Versuchen, um die Exposition über konventionelle und Multi konfokale Optik zu reduzieren, wurde das Problem schließlich durch Kauf eines ~ 3x empfindlicher Kamera (Tabelle 1) behoben. Es wird empfohlen, dass ähnliche Vergleiche wenn möglich gemacht werden, abhängig von der Anwendung des Benutzers. Wenn einige process oder Übergang wird im Laufe der Zeit dokumentiert, zu bestätigen, dass es keine Modifikation zurückzuführen, um die Intensität oder die Gesamtdauer der Beleuchtung. Phototoxizität und Photobleaching sind Farbstoff-spezifisch. Zum Beispiel sahen wir keinen signifikanten Fading nach wiederholten 4D-Bildgebung von einem Terminal (350 einzelnen Belichtungen über 30 min) mit FM1-43. Das gleiche Bildgebungsprotokoll unter Verwendung eines ähnlichen Farbstoff SGC5 (Tabelle 1), jedoch zu einem gewissen Schwund und vermutlich Phototoxizität sowie (Daten nicht gezeigt).

Mit Ausnahme von Verbesserungen durch digitale Entfaltung zur Verfügung gestellt (und konfokale Optik falls verwendet, nicht gezeigt), bietet die beschriebene einfache Methode keine "super" Auflösung. Das Verfahren hat jedoch den Vorteil der Verbesserung der praktischen oder intuitive Auflösung bei der Anzeige von lebenden Strukturen, insbesondere diejenigen beweglichen, deren Größe bei oder etwas größer als die Beugungsgrenze. Die Möglichkeit, Objekte aus verschiedenen Perspektiven zu betrachten, including Darstellung in jeder der drei orthogonalen Ebenen, führt der Prüfer, ob tatsächlich eine Struktur über dem Rauschpegel und ob sie von einem oder mehreren Fluorophoren besteht. Beispielsweise in Experimenten entwickelt, um die Anzahl und Größe von MES und AES quantifizieren, war es möglich zu bestätigen, daß die Struktur aus verschiedenen Perspektiven zu sehen war und dass jede Dimension (und damit seine dreidimensionale Volumen) lag im Bereich typisch, dass Struktur. Die Lage einer Struktur wird, genauer zu definieren, beispielsweise innerhalb eines Axons, Nervenende etc. anstatt über oder unter ihr. Im Gegensatz dazu, wenn das Sichtfeld entweder auf eine einzelne 2D-Bildebene oder auf eine einzelne Projektion von 3D-Daten beschränkt, putative Strukturen oft erwiesen "Rauschen". Ebenso putative doppelt markierten Strukturen oft zwei Strukturen, die von einer Betrachtungsperspektive (oder zwei), aber nicht aus allen übereinstimm erschien erwiesen. Visualisierung von drei orthogonalen Richtungengen bietet eine Standard-und Routine Kriterium für die Beurteilung der Existenz, Größe und Eigenschaften der Kennzeichnung Endosomen oder ähnliche Strukturen für den Einsatz in quantitative und statistische Analysen.

Die beschriebene Methode ist praktisch, da eine herkömmliche Video-Mikroskops von der in vielen Laboratorien gefunden verwendet werden. Die Instrumentierung ist vielseitig einsetzbar und nicht spezialisiert und relativ kostengünstig. Während Software für eine bestimmte Mikroskop wurde hier verwendet, kann Open-Source-Software sowohl für die Bildaufnahme und Datenverarbeitung 13 ähnliche Ergebnisse zu produzieren. Techniken (einschließlich Entfaltung) gelten für Einzel-und Multiphotonen-konfokale Bildgebung mit ähnlichen Vorteilen, so lange Belichtung wird von der Lebens Herstellung verwendet toleriert. In der Zukunft wird Design-Verbesserungen weiteren Verbesserung der Gebrauchs 4D Live-Bildgebung. Dazu zählen in erster Linie, Hardware, die die Geschwindigkeit der Fokussierung und Anregungs / Emissionsfilter cha verbessertnging und Verfügbarkeit der noch empfindlicher Videokameras.

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Disclosures

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den US National Institutes of Health Grants NS-024572 (RSW) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
SGC5 Biotium, Hayward, CA 70057 Final conc: 10 mM
FM1-43FX Invitrogen, Carlsbad, CA F35335 Final conc: 7 mM
LysoTracker Red Invitrogen, Carlsbad, CA L7528 Final conc: 0.2 mM
Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High KCl Reptilian Ringers pH 7.2
NaCl 86 mM
KCl 60 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
High Sucrose Ringers pH 7.2
NaCl 145 mM
KCl 2.5 mM
CaCl2 3.6 mM
MgSO4 1.8 mM
KH2PO4 (Dibasic) 1.0 mM
HEPES 5.0 mM
Sucrose 0.5 M (17.1 g/50 ml)
Axioplan 200 inverted microscope Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4 mm  Carl Zeiss, Thornwood, NY www.zeiss.com
DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA 175W Xenon arc lamp www.sutter.com
Lambda 10-2  emission filterwheel switcher Sutter Instruments, Novato, CA www.sutter.com
Sensicam CCD camera Cooke Instruments, Tonawanda, NY www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD camera Photometrics, Tucson, AZ www.photometrics.com
Imaging dishes- made in-house-11 cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins
Software
Slidebook 5.0 Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2 Bitplane, South Windsor, CT Drift correction; 3D and 4D data presentation www.bitplane.com
AfterEffects CS6 Adobe, San Jose, CA Drift correction www.adobe.com
ImageJ 1.46 National Institutes of Health, Bethesda, MD Multiple plugins available; Stereo pair construction http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY Stereo pair construction www.zeiss.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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