Transgen Gnagere analyse for Kvantifisering Mann Germ Cell Mutant Frequency

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

O'Brien, J. M., Beal, M. A., Gingerich, J. D., Soper, L., Douglas, G. R., Yauk, C. L., Marchetti, F. Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency. J. Vis. Exp. (90), e51576, doi:10.3791/51576 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Sporadiske DNA mutasjoner i germline kan føre til redusert reproduktiv suksess, og hvis arvet, kan føre til genetisk sykdom eller økt predisposisjon for kreft hos avkommet 1-3. Betydelige bevis viser at en stor andel av de novo mutasjoner er arvet fra fars germline 4, og at antall mutasjoner i avkom er positivt korrelert med faderlig alder på tidspunktet for unnfangelsen fem. Jo høyere andelen av hann mutasjoner antas å være et resultat av forskjellen i alder under gametogenesis mellom kjønn, jo større antallet av spermatogenesecelledelsammenlignet med antallet av oogenic celledelinger i den kvinnelige kimlinje 2, og en progressiv nedgang i DNA reparere effektivitet med alderen hos menn. Alle disse faktorer bidrar til en økt sannsynlighet for replikasjonsfeil i den mannlige kimlinje 6. Men til virkningen av faderlig eksponering Environmental faktorer på hyppigheten av de novo mutasjoner er fortsatt usikker. Ikke desto mindre er kjent et stort antall miljømessige midler for å indusere bakteriecelle-mutasjoner i gnagere 7, og det er bevis på at noen av disse midler kan også påvirke den menneskelige kimlinje 8.. På tross av disse problemer, er kjemikalier rutinemessig testet for deres evne til å indusere mutasjoner i somatiske celler for reguleringsformål, og det er generelt antatt at somatiske tester som er tilstrekkelig til å beskytte den kimlinje. Derfor blir kjemikalier bare sjelden målt for deres evne til å indusere bakteriecelle-mutasjoner.

En grunn til kimcellemutagenitet testing stor grad har vært utelatt fra den regulatoriske beslutningsprosessen er en mangel på praktiske metoder. Tradisjonelle gnager-baserte metoder, slik som de dominerende dødelige 9 og spesifikke locus 10 tester, anslå bakterie celle mutasjon priser ved å score mutante fenotyper i embryoer eller avkom aveksponerte foreldre. Disse analyser krever at det brukes et meget stort antall dyr, tid og ressurser for å skaffe statistisk meningsfulle resultater.

Selv om flere moderne metoder for å kvantifisere bakterie celle mutasjon har nylig dukket opp, mange lider mangler i form av deres praktiske, effektivitet og biologisk relevans. For eksempel, gjenta lengde mutasjoner ved utvidet enkel tandem repeat (ESTR) loci kan kvantifiseres i mannlige kjønnsceller ved hjelp av en enkelt molekyl PCR tilnærming 15. Imidlertid kan gjennomføringen av denne metoden være teknisk utfordrende og arbeidskrevende, og i motsetning til punktmutasjoner, det biologiske og helse betydningen av endringer i repetisjons lengden på svært ustabil ESTR loci fortsatt uklare 16. Moderne hele genomsekvensering teknologier kan gi et vell av biologisk menings data når den brukes til problemet med arvelige mutasjoner 4,17, men de høye kostnadene, høye feilrater, krevde forbundet valideringå bekrefte mutasjoner, og bioinformatikk utfordringer fortsatt begrense rutinemessig anvendelse av dette alternativet i en regulerende testing kapasitet 18.

Heri beskrives en praktisk metode for å kvantifisere induserte mutasjoner direkte i kjønnsceller av transgene hannmus. Denne protokollen er beskrevet for den transgene MutaMouse modell som har flere sammenkjedede kopier av et rekombinant λgt10 fag-vektor inneholdende en Escherichia coli-lacZ-reporter-genet integrert i begge kopier av kromosom 3 19 (figur 1).

Denne protokollen er også relevant for andre transgene gnagere (TGR) modeller basert på de samme prinsippene (BigBlue mus og rotter, eller lacZ plasmid mus, etc.) Eller litt forskjellige reporter gener (GPT delta mus og rotter, TGR-modellene i Lambert et al. 20). Denne metoden er basert på den TGR mutasjonsanalyse er beskrevet i en nylig utgittog revidert OECD TG 21 og vi utdype de spesielle hensyn som kreves for å imøtekomme vurdering av mutasjoner i den mannlige germline grunn av de unike egenskapene til spermatogenesen. I korthet innebærer analysen utsette transgene hannmus til en mutagen substans, etterfulgt av en samplingstids der pre-mutasjons lesjoner er festet til stabile mutasjoner. På den valgte prøvetaking tid, mus avlives og kjønnsceller er hentet fra enten cauda bitestikkel eller sædkanaler. Som diskutert nedenfor, kan mutagene virkninger ved forskjellige faser av spermatogenesen bestemmes ved å velge tiden mellom eksponering og prøvetaking. Transgene innsatser, bestående av flere kopier av λ phage genomet per celle, er isolert fra bakteriecellen genomisk DNA og pakket inn i fag-λ tomme kapsider lage infeksiøse λ fag-partikler som deretter brukes til å infisere en E. coli vert. De infiserte bakterier dyrkes på selective medier som kan skille celler som inneholder en vektor med en mutert kopi av lacZ fra celler som villtype lacZ. Den mutagene virkningen av eksponering på hann kimlinje bestemmes ved å sammenligne hyppigheten av mutante transgener mellom kontroll og behandlede mus (figur 2, er gjennomgått i Lambert et al. 20). Et stort antall av kjønnsceller kan bli analysert fra en enkelt mus, noe som gir denne analysen overlegen sensitivitet enn tradisjonelle metoder, og samtidig redusere antallet dyr som kreves. Og fordi ingen spesialisert utstyr eller opplæring er nødvendig, gir denne analysen en praktisk og effektiv alternativ for bakterie celle mutasjonstesting i de fleste moderne toksikologi / molekylærbiologiske laboratorier.

En viktig forutsetning for effektiv anvendelse av TGR bakterie celle mutasjonsanalyse er en forståelse av spermatogenic syklus (figur 3). Tiden for mus kjønnsceller til fremgang fra stem celler i sædkanaler til spermatogonier, spermatocytter, spermatider, og til slutt å modne sædceller i bitestiklene (ie. spermatogenesen) er ca 49 dager. Mutasjon kan oppstå på ulike faser av denne syklusen og er ofte sammensatte bestemt. To viktige funksjoner som er av særlig relevans for mutagenese i mannlige kjønnsceller er opphør av DNA-syntese under tidlig meiose, og den progressive tap av DNA-reparasjon kapasitet 6 i slutten av post-meiose, to prosesser som er nødvendige for induksjon og fiksering av fleste mutasjoner.

På grunn av disse unike egenskaper av spermatogenese, er det tre viktige eksperimentelle variabler for gjennomføring av TGR bakterie celle mutasjonsanalyse: (1) testforbindelsen administrasjonstid; (2) den samplingstid; og (3) valget av bakterie cellepopulasjon for å samle inn for analyse (Figur 3 og Tabell 1). Administrasjonstid er experimental variabel som bestemmer hvor lenge målceller blir utsatt for testforbindelsene. Lengden av administrasjonstiden kan også anvendes til å målrette eksponeringer til spesifikke celletyper eller faser av spermatogenesen. For eksempel kan en enkelt dag administrering brukes til å bestemme virkningene av en akutt eksponering på en bestemt celletype. På samme måte kan eksponeringen være fokusert til en hel spermatogenic fase, for eksempel ved å målrette bare meiotically dele spermatocytter, eller mitotisk dele spermatogonier ved hjelp av en 2 ukers administrasjonstid og en passende prøvetaking. Kroniske og sub-kronisk administrering ganger brukes for å vurdere virkningene av langtidseksponering, for å sikre tilstrekkelig farmakokinetiske fordeling av testforbindelsen, eller tillate tilstrekkelig akkumulering av mutasjoner fra svake mutagenene (for eksempel 28 dagers administrasjon tid anbefales i OECD-test retningslinje).

Samplingstiden er kritisk variabel for å bestemme ved hvilkenfase av spermatogenesen målcellene var ved tidspunktet for eksponering. Prøvetakings tid bestemmer hvor mye tid, og derfor hvor mye videre langs spermatogenic syklus, cellene passerer gjennom etter eksponering. For eksempel, for å undersøke effekter i stamcellespermatogonier, en sampling Tid> 49 dager er nødvendig hvis samle fullt modnet sperm, eller> 42 dager hvis samle umodne kjønnsceller fra sædkanaler, for å sikre at alle innsamlede cellene har hatt nok tid til å utvikle seg fra utsatt stammer celler. Det er viktig å merke seg at en sampling på minst 70 døgn ville være å foretrekke for å demonstrere en virkelig stamcelle effekt for å gi tilstrekkelig tid for farmakokinetisk fordeling av toksikanten, for eliminering av celler eksponert i senere faser av spermatogenese, og for å utgjøre en periode på midlertidig sterilitet som kan oppstå ~ 6 uker etter eksponering for sterkt mutagene forbindelser 22. Likeledes vil en prøvetakingstiden på 21 dager at spermier collected fra cauda bitestikkelen ville ha nettopp fullført meiose på den siste dagen av eksponering.

Kjønnsceller kan samles som modne sædceller fra cauda bitestikkelen, eller som en blanding av ulike spermatogenic celletyper fra sædkanaler. Modne sædceller forbli i cauda for ~ 3 dager, noe som gjør det mulig å bestemme med relativ nøyaktighet på celletypen eller fase av spermatogenesen hvorfra sperm stammer for en gitt eksperimentell design. Dermed analyse av cauda sperm tillatelser svært målrettede undersøkelser av scenespesifikke mutasjons effekter. På den annen side, cellesuspensjoner som er samlet fra de sædkanaler inneholde en blanding av forskjellige bakterie celletyper i forskjellige faser av utvikling, og dermed gi dårligere oppløsning av spermatogenic fase hvor mutasjoner stammer. I tillegg er cellesuspensjoner gjenvunnet fra de sædkanaler en tendens til å inneholde en overrepresentasjon av spermatider, etterfulgt av spermatocytter, og very noen spermatogoniene og stamceller (disse mengder er representert ved graderte hvite streker i Figur 3). Videre kan suspensjoner fremstilt fra sædkanaler også inneholde ulike somatiske celler. Således, fordi så mange typer celler er til stede, mutasjons effekter kan påvirkes av en rekke ikke-målceller. Men prøvetaking fra sædkanaler tilbyr et økonomisk alternativ for samtidig screening flere bakterie celletyper, og enkel integrasjon av bakterie celle analyse inn i standard OECD testprotokoll for somatisk mutasjon.

For å gjenta, avhengig av behovene til etterforsker, administrasjonstid, prøvetaking tid og samlet cellepopulasjon kan justeres for å avhøre effekten av eksponering i ulike celletyper og i ulike faser av spermatogenesen. Ved å nøye velge disse variablene, kan eksperimenter være utformet for målrettet mekanistiske studier, eller for mer generalisert regulatoriske testing formål.

For å oppnå ferdigheter i analysen, anbefales det bruk av en akutt oral administrering av 100 mg / kg N-etyl-N-nitrosourea (NOR), etterfulgt av en 70 dagers samplingstid som positiv kontroll. Analyse av cauda sperm rettet således spermatogonial stamceller (figur 3), som typisk oppviser en 4-5 gangers økning i mutantfrekvens (MF) over kontrollene etter dette svært mutagen dose av NOR. Det bør bemerkes at denne dosen er kjent for å indusere sterilitet 6 uker etter eksponering, slik at det kan ikke være en egnet kontrolldose for kortere samplingstider. Denne dosen vil også produsere en påvisbar økning i MF i de fleste somatiske vev 20. De representative resultatene som presenteres nedenfor ble generert etter en akutt +70 eksponering diett med tre doser av NOR opp til og med 100 mg / kg.

Protocol

Alle protokoller som involverer husdyrhold, vedlikehold og håndtering ble godkjent av Health Canada dyr omsorg komiteen.

1. Animal eksponeringer

  1. Tilfeldig distribuere transgene hannmus (8-12 uker gammel) til å styre grupper og behandlingsgrupper (min = 5 per gruppe) .Treat mus med testforbindelse og relevant kontroll ved en passende eksponeringsveien for den valgte administrasjonstid. Velge den riktige samplingstid ifølge spermatogenic celletype av interesse (figur 3).
  2. Etter at prøvetakingstiden, avlive musene ved halshugging henhold isofluorane anestesi (eller en annen passende metode). Nøye trekke testiklene fra et snitt i buken eller pungen og avgiftsdirektoratet cauda bitestiklene. (Figur 4, for å vise en detaljert video av bitestikkelen samling se Duselis et al. 24). Alternativt samle testiklene hvis analysere seminiferøst tubuleS-celler. Fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C for senere bruk.

2. Isolering og fordøyelse av Cauda Sperm

  1. Tine cauda bitestikkel på is. Tinte cauda til en petriskål og grundig hakke med en skalpell eller barberblad.
  2. Legg 700 mL av romtemperatur i D-PBS til petriskålen. Ved hjelp av en wide-bore 1000 mL pipette tips, slipper sperm fra cauda ved å tegne og slippe suspensjon inntil D-PBS blir overskyet med sperm (ca 10 ganger). MERK: For å forberede wide-bore pipettespissen kutte 2-3 mm fra enden av en plast pipette tips.
  3. Filtrer suspensjonen gjennom en rustfri stålnetting filteret i en frisk 1,5 ml rør. Vask petriskål med en ytterligere 700 ul av D-PBS og overfør til samme 1,5 ml rør gjennom filteret. Fjern maske plassere røret på is.
  4. Gjenta trinn 02.01 til 02.03 for de resterende prøvene.
  5. Spin samplesat 11.000 xg i 3 min. Nøye decant supernatant. Unngå å forstyrre pelleten.
  6. Legg 1,0 ml kald 1x saltvann natriumsitrat (SSC). Vortex inntil pellet er helt re-suspendert. Dette vil noen ganger ta flere runder med virvling.
  7. Tilsett 15 ul 10% SDS. Inverter / rist kraftig i 30 sekunder for å forstyrre ikke-sædceller. Risting for forsiktig vil resultere i utilstrekkelig avbrudd og pelleten vil ikke dannes korrekt i det følgende trinnet.
  8. Spinne på 11.000 xg for 2 min. En løs, "fluffy" pellet er et tegn på ufullstendig avbrudd av somatiske celler på grunn av utilstrekkelig risting i trinn 2.7. Hvis dette skjer, er det bare ryste prøven igjen, og respin inntil en tett pellet dannes. Dekanter forsiktig supernatanten. Unngå å forstyrre pelleten. Kort spinne igjen og fjerne gjenværende supernatanten med 200 mL pipette.
  9. Legg 940 mL 0,2x kaldt SSC og virvle til pellet resuspendert. Dette pellet kan være svært vanskelig å re-suspendere og kan ta flere runder med virvling. Noen ganger klumper av sperm er uunngåelig.
  10. Legg 120 mL β-merkaptoetanol, 100 ul 10% SDS, 20 pl 0,5 M EDTA, pH 8, og 20 pl proteinase K (60 mg / ml, fremstilt frisk). Bland godt og fordøye over natten med rotasjon ved 37 ° C. Fortsett til fenol / kloroform ekstraksjon.

3. Fenol / kloroform Utvinning av DNA fra Cauda Sperm

MERK: Fordi kjerne-DNA i sen fase spermatider og modne sædceller er kompleks med protamines, og er sterkt komprimert sammenlignet med DNA av somatiske celler, konvensjonelle nukleinsyreisolering metoder vil ikke generere DNA av tilstrekkelig kapasitet og renhet for mutasjonsanalyse til å jobbe effektivt. Multiple fenol-kloroform-ekstraksjon etter en aggressiv fordøyelsen er nødvendig for å frigjøre og rense sperm DNA (basert på metoder fra 15).

  1. Overføring sædcelle fordøye til et 15 ml polypropylenrør.
  2. Tilsett 2 ml fenol: kloroform-blanding (1: 1). Roter rør ved 22 rpmi 3 min.
  3. Sentrifuger ved 1600 xg i 10 min, og overføre vandige topplaget sammen med fuzzy grensesnittlaget til en frisk 15 ml tube.
  4. Gjenta trinn 3.1.2 og 3.1.3 3x, men å endre rotasjons ganger til 3 min, 4 min, og 6 min, henholdsvis. På den siste repeat, unngå å overføre noen av de "uklar" grensesnittet laget.
  5. Etter den 4. ekstraksjon, tilsett 70 pl 3 M NaAc, pH 5,2 1 ml vandig ekstrakt og 2 ml kloroform: isoamylalkohol (24: 1). Rotere røret ved 22 rpm i 12 min.
  6. Sentrifuger ved 1600 xg i 10 min, og overføre vandige topplaget til en frisk 15 ml tube.
  7. DNA utfelles ved tilsetning av 2 volumdeler absolutt etanol og forsiktig rotere røret på sin side med forsiktig gynger.
  8. Samle DNA ved oppvikling på tuppen av en varmeforseglet beite pipette. Skyll DNA ved å svinge den pipettespiss i 70% etanol og lufttørkes i 5 min.
  9. Etter ekstraksjon, oppløse DNA utfelling i 40 - 100 mikroliter Tris-EDTA-buffer, pH 8. Oppbevar ved 4 ° C. Tillat DNA til å oppløse ved 4 ° C i minst to dager før man fortsetter til lacZ mutasjonsanalyse. Hvis løselighetsproblemer påtreffes, kan DNA bli ytterligere oppløst ved 65 ° C i 15 min før bruk. Bestem konsentrasjonen av DNA med en spectrophotometre ved A 260 og sørge for at konsentrasjonen av det oppløste DNA er mellom 200-2,000 nanogram / ​​mikroliter.

4. Isolering og fordøyelsen av kjønnsceller fra sædkanaler

  1. Hvis frosset, tine testikkel på is (ca. 1 time). Transfer testis til en bakkeglassplate.
  2. Hold den ene enden av testis med en pinsett. I den andre enden av testis, punktere et hull i kapselen ved hjelp av en annen epiteliale pinsett eller et par av disseksjon saks (figur 5A). Klem sædkanaler gjennom punktering og kast epithelial kapsel (Figur 5B).
  3. Add 500 mL av romtemperatur D-PBS til Decapsulated sædkanaler.
  4. Vinkel en vev valsen (silikongummi tett tilpasset over en fritt roterende 5 mm diameter rustfritt stål, eller lignende anordning), slik at en ende er i kontakt med platen med en omtrentlig vinkel på 5-10 ° (figur 5C). Uten å bruke noe press, forsiktig flytte rullen fram og tilbake over de rørene før de er flat og D-PBS blir overskyet med frigitte celler (ca. 5-10x).
  5. Legg til ytterligere 500 mL av D-PBS over tubuli og forsiktig rulle over tubuli noen flere ganger.
  6. Overfør cellesuspensjonen til et 1,5 ml mikro-sentrifugerør og samtidig minimere mengden av frittliggende tubuli som blir overført (figur 5D).
  7. Gjenta trinn 04.05 til 04.06 for å samle flere celler hvis det er nødvendig.
  8. Tillat 1 - 2 minutter for eventuelle uhell innsamlede tubuli fikk sette seg på bunnen av røret. Overfør D-PBS til en fresh 1,5 ml tube later de bosatte tubuli (ca. 100 mL av D-PBS). En liten alikvot av denne suspensjonen kan kontrolleres under et mikroskop (fasekontrast) for å evaluere sammensetningen av cellepopulasjonen.
  9. Spinn ned cellene ved 11 000 xg i 30 sek. Dekanter supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten. Den cellepelleten kan fryses ved -80 ° C på dette tidspunkt om nødvendig.
  10. Tine celler hvis nødvendig. Overføring til et 15 ml polypropylenrør og resuspender cellene i 5 ml lyseringsbuffer (10 mM Tris pH 7,6, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mg / ml proteinase K, 1% SDS). Digest over natten i inkubatoren med rotasjon ved 37 ° C.
  11. Fortsett til fenol / kloroform ekstraksjon.

5. Fenol / Kloroform Utvinning av DNA fra semniferøst tubuli kjønnsceller

MERK: En mindre aggressive utvinning brukes til å isolere sædkanaler bakterie celle DNA, siden disse celletypene ennå ikke har kommet gjennom nuclear kondens.

  1. Tilsett 5 ml fenol: kloroform-blanding (1: 1) for å over natten sædkanaler celle fordøyelsen. Rotere røret ved 22 rpm i 20 min.
  2. Sentrifuger ved 1600 xg i 10 min, og overføre vandige toppsjikt, samtidig som man unngår "fuzzy"-grensesnitt lag, til en frisk 15 ml tube.
  3. Tilsett 100 ul av 5 M NaCl per 5 ml vandig ekstrakt (vanligvis 5 ml gjenvinnes)
  4. Tilsett 5 ml av kloroform: isoamylalkohol (24: 1). Rotere røret ved 22 rpm i 12 min.
  5. Sentrifuger ved 1600 xg i 10 min, og overføre vandige topplaget til en frisk 15 ml tube.
  6. DNA utfelles ved tilsetning av 2 volumdeler absolutt etanol og forsiktig rotere og inverterende rør.
  7. Samle DNA ved oppvikling på spissen av en forseglet av beite pipette. Skyll DNA ved å svinge den pipettespiss i 70% etanol og lufttørkes i 5 min.
  8. Oppløs-DNA i 40-100 ul Tris-EDTA-buffer, pH 8. Oppbevar ved 4 ° C. Tillat DNA for å løse opp ved 4 ° C i minst todager før du fortsetter til lacZ mutasjonsanalyse (se trinn 3.9). Hvis løselighetsproblemer påtreffes, kan DNA bli ytterligere oppløst ved 65 ° C i 15 min før bruk. Bestem konsentrasjonen av DNA med en spectrophotometre ved A 260 og sørge for at konsentrasjonen er mellom 200 og 2000 ng / mL.

6. LacZ mutasjonsanalyse

Bakteriell eller soppforurensning kan forstyrre emballasje effektivitet, samt plakkvekst og scoring. Det er derfor viktig å utføre den lacZ-assay ved å bruke de passende aseptiske forholdsregler for å hindre forurensning av emballasjen reaksjon, vertskultur og vekstmedier.

  1. Dag Før analysen: Forbered Bottom Agar og natten kultur
    1. Åtte plater (4 plater å score mutanter, 4 plater å telle titer) som inneholder 8 ml bunnen agar hver er nødvendig per prøve (ie., 64 ml per prøve). Bunnen agar er identisk for bådemutant og titer count plater. Forbered tilstrekkelig bunn agar for antall prøver blir behandlet. Aseptisk hell i 90 mm petriskåler (8 ml per parabol) og la agar å stivne. MERK: Bottom agar plater kan være forberedt på opp til 1 uke i forveien.
    2. I et 50 ml rør tilsett 10 ml LB-næringsløsning, 100 ul av 20% maltose-løsning, 25 pl ampicillin (20 mg / ml) og 20 mL kanamycin (5 mg / ml). Vaksinere med E. coli (lacZ - / Gale -) 25 og vokse over natten ved 37 ° C med risting ved 240 rpm.
  2. Dag 1: subkultur Cells
    1. Sub-kultur celler ved å forberede en 1: 100 fortynning av natten kultur i frisk LB (ingen antibiotika). Et volum på 8 ml subkultur er nødvendig per prøve. Inkuber ved 37 ° C med rysting ved 240 rpm i ca 3,5 timer inntil OD 600 = 1.
    2. Da OD 600 = 1, dividere cellesuspensjonen jevnt i 50 ml rør og sentrifuger ved 1300 xg ved 15 ° C i 10min. Fjern supernatanten og re-suspendere celler i halvparten av det opprinnelige volumet (ie., 4 ml per prøve) av LB inneholder 10 mM MgSO fire. Sett celler til side inntil nødvendig [trinn 6.2.4.3].
  3. Dag 1: Emballasje DNA i Lambda fag-partikler
    1. Varm opp et vannbad til 30 ° C.
    2. Ved hjelp av en bred-boring 10 mL pipettespissen, overføring 4 pl DNA til et 1,5 ml rør. MERK: Dette trinnet kan utføres av en dag eller mer i forveien for å redusere forberedelsestid.
    3. Varm opp den første tube (rød) fra et fag emballasje ekstrakt kit (1 tube for hver 2 prøver). Kort spinne å samle utdrag nederst i røret.
    4. Overfør 4,8 mL av emballasje utdrag fra det første røret til DNA-prøven og bland ved forsiktig omrøring med pipettespissen. Kort spinne ned prøver i rør. Inkuber i 1,5 timer i 30 ° C vannbad.
    5. Varm opp den andre (blå) emballasje ekstrakt tube (1 tube for ~ 15 prøver). Kort spinne å samle utdrag nederstav røret.
    6. Overfør 4,8 mL av emballasje-ekstrakt fra det andre røret til DNA-prøve og blandes ved forsiktig omrøring. Kort spinne ned prøver i rør. Inkuber i ytterligere 1,5 time i 30 ° C vannbad.
    7. Re-suspen pakkede fag-partikler i 500 pl SM-buffer og blandes ved å rotere i 30 min ved 20 rpm.
    8. Etter å ha rotert, kort virvel prøver og sentrifuger ved 11.000 xg i 30 sek å samle inn prøver på bunnen av rørene. Fag-partikler er klare for infeksjon [trinn 6.2.4].
  4. Dag 1: Forbered Top Agar
    1. Forbered separat topp agar for titer plater og mutante utvalg plater. Hver prøve krever 4 titer plater og 4 mutante platene. Hver plate krever 8 ml toppen agar. Tilsett selektivt middel fenyl-β-D-galaktopyranosid (p-Gal) til den mutante valg topp agar kun. Forbered både topp agarer på forhånd (dagen i analysen) og opprettholde ved 50 ° C før du legger MgSO 4 til både topp agarer, og PGal til mutant utvalg agar.
  5. Dag 1: infisere celler med pakkede Fag og plating
    1. Etikett to 50 ml rør per prøve: 1 "mutant" tube per prøve og 1 "titer" tube per prøve
    2. Label 8 agar plater per sampling: 4 "mutant" plater per prøve og 4 "titer" plater per prøve
    3. Delmengde 2 ml resuspenderte celler [fra trinn 6.2.1.2] til hvert rør.
    4. Legg 500 mL av pakket fag-partikler [fra trinn 6.2.2.8] til "mutant" 50 ml tube (som inneholder celler). Bland forsiktig og tillater fag-partikler til å infisere cellene i 30 min ved romtemperatur.
    5. Etter 30 min kort vortex-infiserte celler og overføre 15 ul av infiserte celler til den aktuelle 50 ml "titer" rør (inneholdende celler).
    6. Til plate titer prøven, tilsett 30 ml varmt (50 ° C) "titer" top agar (som ikke inneholder P-Gal) til "titer" 50 ml tube. Umiddelbart distribUte agar / celle blanding blant de fire "titer" plater (~ 8 ml per plate). Arbeid raskt slik at toppen agar avkjøles ikke i pipettene, og prøv å ikke innføre luftbobler.
    7. Tallerken "mutant" prøver neste. Sikre P-Gal er lagt til "mutant utvalg" top agar. Tilsett 30 ml varm "mutant selection" agar (inneholdende P-Gal) til "mutant" 50 ml rør. Umiddelbart distribuere agar / celle blanding blant de fire "mutant" plater (~ 8 ml per plate).
    8. Tillater platene å stivne (~ 15 min) og deretter inverteres og inkuber ved 37 ° C over natten.
  6. Dag 2: Telle Plaketter
    1. Etter inkubering over natten, telle antall plaques på de mutante og titer plater. For et stort antall plaques, telle bare en del av platen for å beregne den totale telling (f.eks. Ofte? Av titer platen vil ha mellom 100-200 plaques). Et minimum av 100 plaketter som skal regnes per plate når counting en del av platen.
    2. Beregn antall plakkdannende enheter (PFUs) per mL av celler. Dette gjøres ved å dele antall plaques på "titer" plater av volumet av celler belagt (15 mL).
    3. Bruk antall PFUs / mL å beregne den totale antallet PFUs i totalvolumet av infiserte celler belagt på "mutant" plater (PFUs / mL [2 ml celler + 0,5 ml pakkede fag-partikler - 15 ul for titer plater] ).
    4. Estimer MF ved å dividere det totale antall mutante plakk tellet på 4 "mutant" plater av den beregnede totale antall PFUs i det totale volumet av infiserte celler bestemt fra de "titer" plater.
  7. Når den spontane lacZ MF er i størrelsesorden 3 x 10 -5 i kontrollgruppen, som det for MutaMouse kimceller, anbefaler OECD Guideline minst 125.000 til 300.000 ikke-mutante PFUs per dyr være skjermened for mutasjon for å oppnå et pålitelig utgangssignal. Andre transgene modeller kan ha lavere spontan MF, i hvilket tilfelle et større antall PFUs ville være nødvendig. En statistisk styrke test kan utføres for å bestemme det minste antall PFUs og dyr er nødvendig for å oppnå den ønskede oppløsning. Data fra flere replikater kan bli slått sammen for å tilfredsstille dette minimum PFU krav, forutsatt at de ikke produserer signifikant forskjellige mutante frekvenser.

7. Statistikk

Den eksperimentelle enhet for analysen er musen. Data produsert fra denne analysen er generelt ikke normalfordelt. Som sådan, velger den statistiske metode for analyse basert på fordelingen karakteristisk for dataene.

MERK: Standard parametriske analyser (. F.eks ANOVA) kan anvendes dersom det er hensiktsmessig datatransformasjon blir benyttet for å utjevne variasjonene i respons på tvers av rekken av observasjon. Poisson eller binomial regresjonsanalyser er ofte mer hensiktsmessig. Nonparametric analyse kan også benyttes. Vi benytter rutinemessig Poisson regresjon ved hjelp av generalisert lineær modell prosedyre (ie., Proc GENMOD) i SAS v.9.2 (SAS Institute, Cary, NC) som beskrevet av Lemieux et al 26.

Representative Results

Med en gjennomsnittlig plakett telle på 200.000 plaketter per dyr, vi vanligvis observerer en gjennomsnittlig bakgrunn MF på ca 2,8 x 10 -5 i mannlige kjønnsceller med et standardavvik på 1,7 x 10 -5 i våre kontrollgrupper (basert på data fra åtte uavhengige forsøk). Med denne plakett teller, bakgrunnsnivå og varians, dosegrupper med n = 5 dyr hver er tilstrekkelig til å oppdage en 2 ganger økning i MF med kraft> 0.8.

Resultatene er vanligvis rapportert i tabellform eller grafiske formater. Tabell 2 og figur 6 viser representative resultater fra cauda spermiene MutaMouse hanner (n = 5 pr gruppe) som utsettes for en enkelt akutt dose på 0, 25, 50 og 100 mg / kg N-etyl-N-nitrosourea (NOR) etterfulgt av en 70 dagers samplingstid. Denne 70 dagers perioden tillater måling av mutasjons hendelser som skjedde i sperm som var spermatogonial stamceller på tidspunktet for eksponering (figur 3). Typiske plaque tettheter på mutant og titer platene er vist i Figur 7. Som vist i tabell 2 og figur 6, akutt NOR eksponering induserte en signifikant doseavhengig økning i MF av spermatogonial stamceller. Den lave dose induserte en signifikant 2,6 gangers økning sammenlignet med kontroller, noe som hadde en basislinje MF på 2,6 x 10 -5. Maksimal induksjon skjedde i høy dose som fremkalte en 4,4 gangers økning sammenlignet med kontroller.

Et eksempel på denne analysen utført på sædproduserende tubuli kjønnsceller kan finnes i Douglas et al. 27, hvor MF ble bestemt i tubuli kimceller ved forskjellige tidsintervaller etter en 5 dagers gjentar intraperitoneal injeksjon av 50 mg / kg NOR. I den studien, mutante frekvenser i sædproduserende celler økes opp til 15 dager etter behandling og holdt seg konstant etterpå.

Exposikker på diett Innsamlet vev Innsamlet celletype (målcellen) Fasen av målcellen ved begynnelsen av eksponeringen Faser gått under eksponering
Akutt + 70 Cauda Moden sperm Stamcelle Stamcelle
14 + 21 Cauda Moden sperm Spermatogonier Spermatid
14 + 35 Cauda Moden sperm Stamcelle Spermatocyte
28 + 3 Cauda Moden sperm Spermatocyte Spermatocyte
Spermatid
Moden sperm
Tubuli Stamcelle Stamcelle Stamcelle
Spermatogonier Spermatogonia Spermatogonier
Spermatocyte Spermatocyte
Spermatid Spermatid
28 + 49 Cauda Moden sperm Stem cel Stamcelle
Tubuli Stamcelle
Spermatogonier
Spermatocyte
Spermatid
Stamcelle Stamcelle

Tabell 1. celletyper og faser av spermatogenesen som er rettet av den transgene gnager mutasjonsanalyse av ulike eksperimentelle design.

Dosegruppen Animal # Mutant PFU Total PFU MF (x10 -5) Avg MF (x 10 -5) Ganger endring p-verdi
Kontroll 1 5 180245 2.8 2.6 1,0 -
2 4 137835 2.9
3 11 385672 2.9
4 2 431396 0.5
5 6 152413 3.9
25 mg / kg 6 17 162353 10.5 6.9 2.6 0,0002
7 14 150094 9.3
8 4 154401 2.6
9 9 154401 5.8
10 12 196978 6.1
50 mg / kg 11 17 155727 10.9 9.3 3.6 <0,0001
12 11 135847 8.1
13 25 193499 12.9
14 12 133859 </ Td> 9,0
15 14 252807 5.5
100 mg / kg 16 26 170968 15.2 11.5 4.4 <0,0001
17 28 234584 11.9
18 10 145289 6.9
19 35 292236 12.0
20 22 190848 11.5

Tabell 2. lacZ mutant frekvens i cauda sperm av transgen mannlige mis utsatt akutt til NOR da de var spermatogonial stamceller (administrasjonstid = 1 dag, prøvetaking tid = 70 dager). PFU = plakk dannende enhet, MF = mutant frekvens.

Figur 1
Figur 1. En skjematisk fremstilling av λgt10 phage konstruktet.

Fig. 2
Figur 2. Et omriss av den transgene gnager bakterie celle mutasjonsanalyse.

Figur 3
Figur 3. Et skjematisk diagram av spermatogenesen hos mus og celletyper og phases som er rettet av den transgene gnager mutasjonsanalyse av ulike eksperimentelle design. MERK: uteksaminert hvite søylene representerer den relative andelen av celletyper som finnes i cellesuspensjoner fremstilt fra sædkanaler (dvs. spermatider> spermatocytter> spermatogonier> stamceller). Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Innsamling av musen cauda bitestikkelen. A) Lag et snitt i buken mot pungen. B) Identifiser epididymal fett puten. C) trekker fett puten forsiktig å trekke ut testiklene og bitestiklene. D) Finn og avgiftsdirektoratet cauda bitestikkelen.


Figur 5. Utarbeidelse av suspensjon av kjønnsceller fra sædkanaler. A) Et snitt er gjort i epithelial kapsel av testis, utsette sædkanaler. B) sædkanaler blir presset ut av kapselen. C) En vev valsen forsiktig gått over tubuli på en 5-10 ° vinkel slipper kjønnsceller som finnes i. D) Den bakterie cellesuspensjonen samles for videre behandling.

Figur 6
Figur 6. Grafisk fremstilling av lacZ mutant frekvens i MutaMouse sperm utsatt akutt som stamceller til NOR (n = 5). Hvertrekanten representerer MF av ett dyr. * p <0,05 som bestemt ved Poisson regresjon.

Figur 7
Figur 7. Representative agar plater fra den transgene gnager mutasjonsassay med plaketter dannet på en plen av E. coli-vertsbakterier. A) De "mutant" platene vil ha svært få plakk (merket med piler), spesielt i kontroll dosegruppene, som til tider vil ha null plakater på noen plater. B) "titer" platene kan ha hundrevis av plakk.

Discussion

Sammenlignet med tradisjonelle metoder, gir TGR bakterie celle mutasjonsanalyse en raskere, mer økonomisk og mer sensitive hjelp av kvantifisering indusert in vivo bakterie celle mutasjoner. Ved vurderingen av transgenet MF direkte i sæd, i motsetning til avkom, antall dyr, er tid og ressurser som kreves for å vurdere kimlinje mutagenisitet for en enkelt forbindelse reduseres vesentlig. Når det gjelder følsomhet, var vi i stand til å oppdage en betydelig 2,6 ganger økning i spermatogonier stamcelle MF etter eksponering for 25 mg / kg NOR med bare fem dyr per gruppe dose. I kontrast, den spesifikke locus analysen var ikke i stand til å oppdage noen vesentlig endring i MF på denne samme dose ved hjelp av> 3000 mus i den eksponerte gruppen og> 500.000 kontroll mus 28.

I tillegg til sin egnethet for både mekanistiske og regulatoriske undersøkelser, gir denne metoden en mulighet for sammenlignende studier mellom somatiske og kjønnsceller Mutatipå priser. Nylige bevis antyder at for noen agenter kjønnscelle mutasjoner kan induseres ved lavere konsentrasjon enn det som kreves for somatisk mutasjon. For eksempel, forlenget eksponering for N-hydroxymethylacrylamide, en metabolitt av maten carcinogen akrylamid 12, øker frekvensen av dominerende dødelige bakteriecelle mutasjoner i mus uten å påvirke mikrokjernefrekvensen i røde blodceller, en tradisjonell måling av somatiske celle cytogenetisk skade 13. I tillegg eksponering av mus til både mainstream og sidestream tobakksrøyk årsaker forhøyede mutasjons frekvenser ved tandem gjenta DNA loci i sperm ved doser som ikke øker blod mikrokjernefrekvens 14. Disse funnene utfordrer antagelsen om at somatiske gentoksisitet testing er alltid beskyttende av germline, og forsterke etterspørselen etter en mer effektiv og kostnadseffektiv måte å kvantifisere bakterie celle mutasjon frekvens. Men, er fortsatt svak bevisene for fortrinnsrett bakterie celle mutagener, Hovedsakelig på grunn av mangel på tilgjengelig data for å sammenligne mutasjon priser i somatiske og bakterie celle vev. Den TGR mutasjonsanalyse tillater parallell testing og sammenligning av indusert mutasjon priser i flere vev ved hjelp av den samme transgenet. Dermed komparativ mutasjon testing med TGR analysen vil bidra til å fylle datahull rundt muligheten for fortrinnsrett bakterie celle effekter.

Samtidig vurdering av somatiske og bakterie celle mutasjon for regulatoriske testing vil også forbedre effektiviteten ved å redusere antall dyr som kreves. OECD-retningslinjen for somatisk mutasjon innstiller en 28 dagers administrasjon tid, etterfulgt av en tre dagers samplingstid (28 + 3). Analyse av cauda sædceller kan gi dårlig sensitivitet på dette tidspunkt, siden det er rettet mot cellene eksponert for det meste i løpet av spermatocyte og spermatid faser av spermatogenesen (figur 3). Celler i disse fasene ikke syntetisere DNA og gradvis miste sin kapasitet for DNA-reparasjon 6 </ Sup>. Videre, ville samplings cauda sperm på dette tidspunkt ikke klarer å påvise mutasjoner som forekommer i spermatogoniene og stamceller. Derfor, for integrering i 28 + 3 design, anbefaler OECD retningslinje samle kjønnsceller fra sædkanaler. Denne blandet populasjon inneholder celler avledet fra DNA-syntese og reparasjon dyktig celletyper, inkludert stamceller og er utsatt over flertallet av spermatogenese faser. Imidlertid, på grunn av den blandede naturen av disse celler, sædkanaler celle analyse gir ikke fasespesifikk informasjon. Videre er det bekymring for at tilstedeværelsen av ikke-målceller kan påvirke observerte MF (f.eks falske positive kimcellemutagen anrop på grunn av forurensning av muterte somatiske celler, eller fortynning av et mutert bakterie cellesignal fra DNA-reparasjon-manglende kimceller) . Foreløpig er det ikke tilstrekkelig med data for å konkludere om resultatene fra sædkanaler celler på 28 + 3 tilbyr samme sensitivitet og spesifisitet ens cauda sperm på senere tidspunkter. Vårt laboratorium sammenligner for tiden indusert MFs i sædkanaler celler og cauda sperm samlet etter ulike prøvetakingstider for å løse dette punktet. Vi merker oss at OECD Guideline antyder en alternativ samplingstid på 28 dager for langsomt skille vev så som lever som også kan være egnet for bakteriecelleanalyse. Likevel er tilgjengelig data fortsatt utilstrekkelig og vi er nå i stand til å anbefale en enkelt eksperimentell design for samtidig analyse av somatiske celler og kjønnsceller ved hjelp av TGR mutasjonsanalyse for regulatoriske testing.

Et karakteristisk trekk ved denne analysen som bør bemerkes er at mutasjonshendelser vurderes på en ikke-transgen murin. Men det er rikelig med bevis som tyder på at transgenet reagerer på miljø mutagener på en lignende måte til endogene gener 20. I tillegg, fordi den nøyaktige opprinnelse uavhengige mutasjonshendelser er vanskelige åløse, er resultatene generelt rapportert som en mutant frekvens (i motsetning til en mutasjonsfrekvens). Selve mutasjonsfrekvens kan løses hvis resultater er korrigert for klonal ekspansjon (dvs.. Delingen og multiplikasjon av en eneste mutert celle som kan bidra til den observerte frekvensen for transgene mutanter) ved DNA-sekvensering. Sekvensering av de mutante transgener kan bli utført for å karakterisere lacZ-mutasjoner, og identifisere mutanter som kan være avledet fra klonal ekspansjon hendelser, selv om dette øker i betydelig grad tiden og kostnadene for analysen. I tillegg til lacZ-genet, havner theλgt10 transgen vektor en alternativ temperaturavhengig mutasjon-reporter-genet: en variant av λ cII-genet, som er kortere (294 bp vs 3021 bp lacZ, figur 1) og lettere å sekvensere 29. Sekvense muliggjør også analyse av indusert mutasjon spektrum, og gir innsikt i mutational mekanismen av forbindelsen i spørsmålet. Et ekstremt eksempel på klonal ekspansjon er forekomsten av en "jackpot" mutasjon (ie., Transgene mutasjoner på et svært tidlig stadium av et organ utvikling som bidrar til en dramatisk forhøyet MF, noen ganger hundrevis til tusenvis av ganger større enn bakgrunnen). Dyr eller vev med en "jackpot"-mutasjon bør fjernes fra analysen.

Analysen som vi har beskrevet er bredt anvendelig på andre TGR modeller som BigBlue mus og rotte, og lacZ-plasmid-mus, alle av hvilke havnen lignende mutasjon rapportør vektorer (gjennomgått i 20). De aller fleste av bakterie celle studier utført hittil som bruker lignende metoder har fokusert nesten utelukkende på godt karakteriserte mutagener som NOR og stråling (anmeldt i 30). Det er forventet at med den siste utgaven av OECD TG for TGR analysen, vil dette assay blistadig mer populært for kjemisk screening og regulatoriske evaluering. Innlemmelse av TGR bakterie celle mutasjonsanalyse i en regulatorisk testing batteri vil fylle det eksisterende gapet ved å tillate effektiv vurdering av mutasjons induksjon i kjønnsceller 11. Videre kan denne analysen anvendes for å måle MF i praktisk talt en hvilken som helst vev, som gir et egnet middel for å sammenligne de relative sensitiviteter av somatiske celler og kimceller til induksjon av mutasjoner av forurensninger ved identiske genetiske endepunkter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MutaMouse Covance -
E. coli (lacZ-/galE-) Covance - See reference 25 in manuscript
Chloroform Caledon 3001-2-40
Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) Gibco 14190-250
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5 M, pH 8 Sigma-Aldrich 03690 FLUKA
Isoamyl alcohol Caledon 2/10/7900
Lennon LB broth base Invitrogen 12780-029
Stainless steel mesh filter Sigma-Aldrich S3770
Transpack packaging extract Agilent Technologies 200220
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH) Commercial Alcohols -
Ampicilin Gibco 11593-027 prepare 20 mg/ml in dH2O
Kanamycin Gibco 11815-024 prepare 5 mg/ml in dH2O
Phenol Invitrogen 15509-097 Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction
Phenyl-β-D-galactopyranoside (P-Gal) Sigma-Aldrich P6501 dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide
Proteinase K Invitrogen 25530-031 prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 µl per sample
Sodium acetate (NaAc) Fisher Scientific BP333-500 prepare 3 M solutution, pH 5.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L4390 prepare 10% solution in dH2O
1 M MgSO4 24.6 g MgSO4·7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
LB Broth 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1 L dH2O. Autoclave and cool
Saline sodium citrate (SSC) 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0 
SM Buffer 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4·7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1 L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmadi, A., Ng, S. C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa. J. Exp. Zool. 284, (6), 696-704 (1999).
  2. Crow, J. F. The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation. Nat. Rev. Genet. 1, (1), 40-47 (2000).
  3. Nelson, K., Holmes, L. B. Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants. N. Engl. J. Med. 320, (1), 19-23 (1989).
  4. Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk. Nature. 488, (7412), 471-475 (2012).
  5. Michaelson, J. J., et al. Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation. Cell. 151, (7), 1431-1442 (2012).
  6. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage. DNA Repair (Amst). 7, (4), 572-581 (2008).
  7. Marchetti, F., Wyrobek, A. J. Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities. Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75, (2), 112-129 (2005).
  8. Demarini, D. M. Declaring the existence of human germ-cell mutagens. Environ. Mol. Mutagen. 53, (3), 166-172 (2012).
  9. Epstein, S. S. Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals. Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).
  10. Russell, W. L. X-ray-induced mutations in mice. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).
  11. Singer, T. M., Yauk, C. L. Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century. Environ. Mol. Mutagen. 51, (8-9), 919-928 (2010).
  12. Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. Acrylamide: A cooking carcinogen. Chem. Res. Toxicol. 13, (6), 517-522 (2000).
  13. Witt, K. L., et al. Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay. Environ. Mol. Mutagen. 41, (2), 111-120 (2003).
  14. Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (31), 12811-12814 (2011).
  15. Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus. Mutat. Res. 500, (1-2), 147-156 (2002).
  16. Niwa, O. Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci. Mutat. Res. 598, (1-2), 61-72 (2006).
  17. Campbell, C. D., et al. Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population. Nat. Genet. 44, (11), 1277-1281 (2012).
  18. Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism. Mutat. Res. 750, (2), 96-106 (2012).
  19. Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements. Mutagenesis. 25, (6), 609-616 (2010).
  20. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat. Res. 590, (1-3), 1-280 (2005).
  21. OECD. OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. (2011).
  22. Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice. Toxicol. Lett. 17, (1-2), 77-80 (1983).
  23. Russell, L. B. Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse. Genetica. 122, (1), 25-36 (2004).
  24. Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting sperm and artificial insemination of mice. J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).
  25. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20, (12), 3254 (1992).
  26. Lemieux, C. L., et al. Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse. Environ. Mol. Mutagen. 52, (9), 756-765 (2011).
  27. Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, (16), 7485-7489 (1995).
  28. Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, (11), 3589-3591 (1982).
  29. Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. The cII locus in the MutaMouse system. Environ. Mol. Mutagen. 34, (2-3), 201-207 (1999).
  30. Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays. Mutat. Res. 598, (1-2), 164-193 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics