MikroRNA Expression Profiler av Human iPS-celler, pigmentepitelet härledas från iPS, och Fetal pigmentepitelet

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den mikroRNA (miRNA) profiler av mänskligt framkallade-pluripotenta stamceller (iPS-celler), retinal pigment epitel (RPE) som härrör från humant framkallade-pluripotenta stamceller (iPS) celler (iPS-RPE), och foster RPE, jämfördes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Greene, W. A., Muñiz, A., Plamper, M. L., Kaini, R. R., Wang, H. C. MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (88), e51589, doi:10.3791/51589 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Syftet med denna rapport är att beskriva protokoll för att jämföra mikroRNA (miRNA) profiler av mänskligt framkallade-pluripotenta stamceller (iPS) celler, retinal pigment epitel (RPE) som härrör från mänskliga iPS-celler (iPS-RPE), och foster RPE. Protokollen omfattar insamling av RNA för analys av microarray, och analys av microarraydata för att identifiera miRNA som differentiellt uttrycks bland tre celltyper. Metoderna för odling av iPS-celler och fetala RPE förklaras. Det protokoll som används för differentiering av RPE från human iPS beskrivs också. RNA-extraktion teknik beskriver vi valdes för att möjliggöra maximal återvinning av mycket små RNA för användning i en miRNA microarray. Slutligen cell-bana och nätverksanalys av microarray uppgifter förklaras. Dessa tekniker kommer att underlätta jämförelsen av miRNA profiler av tre olika celltyper.

Introduction

Stamceller har förmåga att replikera obegränsat och kan differentieras till någon somatisk celltyp. Utvecklingen av tekniker för att programmera om somatiska celler till pluripotenta stamceller har framkallat stor uppståndelse i forskarsamhället och bland läkare, som tillkomsten av personliga vävnadsregenerering är på horisonten 1. Induced-pluripotenta stamceller (iPS) celler uppvisar samma funktioner i obegränsade replika potential och pluripotens som embryonala stamceller (ES-celler) samtidigt som den kringgår de etiska dilemman i samband med ekonomiska och sociala råd. Dessutom kommer patientgenererade stamceller inte stimulera ett immunsvar, kraftigt ökar sannolikheten för framgångsrika terapeutiska tillämpningar 2-3. Under vissa odlingsbetingelser, har iPS-celler visat att differentiera till flera olika celltyper in vitro, inklusive cardiomyocytes, neuroner, betacellerna i bukspottkörteln, leverceller och retinal pigmenterade epitel (RPE) 4-12.

RPE är en specialiserad skikt av pigmenterade epitelceller belägna på baksidan av näthinnan som har flera funktioner som är väsentliga för visuella hälsa och funktion, såsom absorption av ströljus, fagocytos av fotoreceptoryttersegmenten, och bearbetning av retinoider för produktion av visuell kromoforen. Dysfunktion i RPE grund av skada eller sjukdom djupt påverkar ljusmätare hälsa och visuell funktion som framgår av de bländande sjukdomar som är en följd av underliggande RPE patologi såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), Stargardts sjukdom, och retinitis pigmentosa (RP) 13. Verkligen effektiva behandlingar som kan återställa synen har inte uppnåtts, och ersättning av sjuka RPE med friska RPE kan vara det bästa alternativet för att förhindra synförlust 14-15. RPE härrör från iPS (iPS-RPE) är en möjlig källa till celler för att ersätta den skadade RPE. iPS-RPE uttrycker karakteristiskatic RPE proteiner LRAT, CRALBP, PEDF och RPE65; visar den klassiska högt pigmente sexkantiga RPE morfologi; och utför RPE funktioner såsom fagocytos, retinoida bearbetning och utsöndring av 11 - cis retinal 5,16. Men innan iPS-RPE kan användas terapeutiskt, iPS-RPE måste noggrant karakteriserats. Att förstå de faktorer som styr RPE differentiering är nödvändig för att förbättra utbytet och renheten av de celler som skall användas för kliniska tillämpningar.

Celldifferentiering är ett resultat av mycket reglerad genexpression. Epigenetisk ombyggnad av genomet och samordning av transkriptionsfaktorer som krävs för cell öde beslut som inträffar under differentiering och utveckling 17. Reglering av meddelande-RNA (mRNA) översättning av mikro-RNA (miRNA) presenterar ännu en nivå av reglering som påverkar cellens öde 1. MiRNA är korta, ~ 22 nt, längder av nukleotider som antingen undertrycka översättningbindning till 3'-UTR av mRNA eller rikta mRNA för nedbrytning. MiRNA har upptäckts i praktiskt taget alla vävnader och hittills över 2.000 unika mänskliga mikroRNA har registrerats i miRBase databasen. Eftersom miRNA kräver endast delvis kompletterar varandra för att binda till mål-mRNA, kan en enda miRNA potentiellt binder till tiotals eller hundratals mål, och vice versa, dvs en enda mRNA kan riktas genom flera olika miRNA. Denna promiskuösa bindande kännetecken ökar dramatiskt graden av komplexitet reglering samt graden av svårigheten att bestämma funktionerna hos enskilda miRNA och vilken roll var och en spelar i cellulära funktioner 18-21. Trots detta har studier visat att miRNA förädlar genuttryck under differentiering genom att påverka DNA-metylering status 17. I en studie mer specifika för RPE ades miR-204/211 visats främja epitelial fenotyp i RPE 22. En annan grupp analyserade miRNA profilav RPE under differentiering av ES-celler och visade distinkta uppsättningar av miRNA uttrycks under differentieringsprocessen 23. I själva verket kan miRNA profiler entydigt särskilja celltyper, inklusive ES-celler, föregångarceller och terminalt differentierade celler 24,25. Över 250 miRNAs uttrycks i näthinnan. Baserat på dessa studier, hypotes vi att miRNA spelar en viktig roll vid differentieringen av RPE från Ips.

Syftet med denna rapport är att beskriva protokollen för differentiering av RPE från IMR90-4 iPS-celler, insamling av RNA för analys av microarray, och analys av microarraydata för att identifiera miRNA som differentiellt uttrycks bland tre celltyper, iPS-celler , iPS-RPE och foster RPE. Totalt RNA extraherades från odlingar av varje celltyp och hybridiserades till en miRNA microarray, som innehåller sönder specifika för 1205 mänskliga miRNA och 144 virala miRNA. De microarray Resultaten jämförad för att avgöra vilka miRNA var differentiellt uttryckta mellan de olika celltyper. miRNA med 2-faldig eller större faldig förändring i expression valdes ut för vidare analys. En miRNA analysprogram program användes för att identifiera potentiella mål för differentiellt uttryckta miRNA och generera mobilnät regleras av de utvalda miRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av kultur Reagens och odlingsplattor

  1. mTeSR1 medier: Förbered mTeSR1 media i enlighet med tillverkarens anvisningar. Tina 100 ml mTeSR1 5x tillägg över natten vid 4 ° C. Tillsätt 100 ml mTeSR1 5x komplement till 400 ml mTeSR1 basala medier och blanda väl. Detta media är stabil vid 4 ° C i upp till två veckor och vid -20 ° C under 6 månader.
  2. Differentiering medier: Förbered differentieringsmedia i DMEM/F12 för erhållande av 0,1 mM β-merkaptoetanol, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 2,0 mM L-glutamin, 10% knockout serum och 10 | ig / ml gentamicin.
  3. iPS-RPE medier: Förbered iPS-RPE medier i MEM för att ge 1x N1 komplettera, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 250 ug / ml taurin, 13 ng / ml trijodo-L-tyronin-natriumsalt, 20 ng / ml hydrokortison, 5 mikrogram / ml gentamicin, och 15% FBS 26.
  4. Trijodo-L-tyronin-natriumsalt förrådslösning. För att bereda stamlösning lösa upp 1,0 mg trijod-L-tyroninnatriumsalt i 1 N natriumhydroxid genom försiktig virvling. Tillsätt 49,0 ml av oädla medier för att göra 50,0 ml av 20 ^ g / ml trijodo-L-tyronin-natriumsalt. Förbered alikvoter och frys vid -20 ° C tills de behövdes. Använd lämplig volym för att uppnå önskad koncentration i slutodlingsmedier.
  5. Hydrokortison stamlösning: att förbereda en hydrostamlösning, lösa 1 mg hydrokortison i 1 ml absolut etanol genom försiktig skakning. Tillsätt 19,0 ml av oädla media för 20 ml hydrokortison förrådslösning av 50 | ig / ml. alikvot och frys vid -20 ° C tills de behövdes. Använd lämplig volym för att uppnå den önskade koncentrationen i det slutliga odlingsmedia.
  6. Fetal RPE tillväxtmedium. Förbered tillväxtmediet genom att blanda samtliga reagens i RTEGM kit i basalmedier, enligt tillverkarens anvisningar, utom för FBS.
  7. Fostrets RPE plätering media. Förbered plating media genom att överföra en liten mängd av tillväxtmediet till en steril behållare och endd FBS till en slutkoncentration av 2%.
  8. Dispas: Bered arbetslösning av dispas av 1 mg / ml i DMEM/F12.
  9. Matrigel belagda plattor: Förbered matrigel i DMEM/F12 till 0,08 mg / ml.
  10. Coat varje brunn i en 6-brunnsplatta med 1,0 ml av matrigel lösning.
  11. Inkubera de bestrukna plattorna vid rumstemperatur under 1,0 timmar.
  12. Efter 1,0 h inkubation, aspirera överskottet DMEM/F12.
  13. Lägg till 0,5 ml av mTeSR1 material för att undvika torkning. Matrigel-belagda plattor är nu redo för användning.

2. IPS Kultur

  1. Före iPS cell sådd har alla rör, varm mTESR1 media till rumstemperatur och Matrigel belagda plattorna färdiga.
  2. Snabbt tina IMR90-4 iPS-celler i ett 37 ° C vattenbad. Ta sedan bort köldkärlet från vattenbadet och sterilisera med användning av 70% etanol.
  3. Överför celler till ett 15 ml koniskt rör med användning av en 2 ml pipett för att minimera brytning av cellaggregat.
  4. Droppvis tillsätt 5 ml warm mTeSR1 media till cellerna och blanda försiktigt. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten.
  5. Noggrant återsuspendera cellaggregat i 2 ml mTeSR1 medier och ympa cellerna på en brunn i en sex brunnar.
  6. Placera plattan i en 37 ° C inkubator och kultur med 5% CO2, 95% luftfuktighet.
  7. Ändra iPS cellodlingsmedia dagligen. Odifferentierade kolonier visas 5-7 dagar efter sådd. Kontrollera om odifferentierade kolonier som är redo för passage (kolonier med en tät centrum).

3. Passaging av iPS-celler

  1. Före början till passagen iPS-cellerna har samtliga rör, dispas-lösning, DMEM/F12 och mTERS1 medier värmdes till rumstemperatur, och den Matrigel-belagda plattor redo.
  2. Innan passaging iPS-celler, ta bort alla områden av differentiering genom skrapning området och aspirera media. Differentiering bör ligga under 20% av den väl för högakvalitet kulturer. Skölj försiktigt iPS cellinnehållande väl med 2 ml DMEM/F12 och tillsätt 1 ml av 1 mg / ml dispas till varje brunn.
  3. Inkubera vid 37 ° C under 7 min. Aspirera dispas och försiktigt skölja cellkolonier med 2 ml DMEM/F12 två gånger.
  4. Efter sköljning, tillsätt 2 ml av mTSER1 till varje brunn.
  5. Med hjälp av en 5 ml pipett försiktigt skrapa kolonierna av plattan för att bilda aggregat.
  6. Överför de lösgjorda kolonier till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt tillräckligt med mTeSR1 media till utsäde nästa passage av celler.

4. Differentiering av iPS-celler till iPS-RPE

  1. Plate iPS-cellerna på ett nyligen belagd plåt i mTESR1 media.
  2. Tillåt iPS cellkolonier expandera under 4-5 dagar i kultur.
  3. Suppleant mTeSR1 media med 4 ml differentiering media. Ändra hälften av medierna var 3 dagar.
  4. Tillåt pigmenterade foci växa tillräckligt stor för att vara manuellt dissekerades ut av kulturen (40 till 50 dagar).
  5. Använd ett200 l pipettspetsen att skära runt och lyft de pigmenterade kolonier.
  6. Samla in och sammanställa de dissekerade kolonierna i en 15 ml koniska rör.
  7. Tillsätt sedan 5 ml DMEM/F12 till de poolade RPE-celler och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter två gånger.
  8. Förbered en enda cell lösning genom inkubering av poolade iPS-RPE med 0,25% trypsin-EDTA.
  9. Skölj iPS-RPE-celler med iPS-RPE medier och platta de insamlade cellerna på en färsk matrigel belagd väl i 4 ml iPS-RPE medier.
  10. Kultur cellerna för 3 veckor före passage. Ändra media var 3 dagar. För experimentet, platt iPS-RPE vid 100.000 celler / cm 2. Samla cellerna på dag 17. Räkna dagen seeding som Dag 0.

5. Provtagning

  1. iPS Cell Collection
    1. Kultur iPS-cellerna tills odifferentierade kolonier observerades vara tät i centrum.
    2. Skölj kolonierna i DMEM/F12.
    3. Sönderfalla i enskilda celler med hjälp accutas e. Samla cellerna in i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min. Sug ut supernatant. Resuspendera i 2 ml av DMEM/F12.
  2. Fetal RPE Collection
    1. Skölj Fostrets RPE cellkulturer med DMEM/F12 och sönderfalla i enskilda celler med hjälp av 0,25% trypsin-EDTA.
    2. Samla cellerna i ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera vid 300 x g under 5 min. Sug ut supernatant. Resuspendera i 2 ml av DMEM/F12.
  3. iPS-RPE cellsamling
    1. När iPS-RPE nå passagen 3 och passagen 5, samla cellerna på dag 17 efter passage. Skölj iPS-RPE två gånger i PBS och framställa en enkelcellsuspension genom inkubering med 1,0 ml av 0,25% trypsin.
    2. Neutralisera trypsin med 2 ml iskall iPS-RPE medier.
    3. Samla cellerna i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min. Sug ut supernatant.
    4. Resuspendera cellsuspensionen i 3 ml färgning buffert från mikrokorn kit.
ve_title "> 6. Negativt Val av iPS-RPE bort odifferentierade celler

  1. Förvara alla reagenser vid 4 ° C fram till användning, men fungerar inte på is. Centrifugera cellsuspension från steg 5.3.4 vid 300 xg under 5 minuter. Sug ut supernatant.
  2. Resuspendera cellerna i 100 l av färgning buffert från mikrokorn kit per 2 x 10 6 celler.
  3. Tillsätt 10 l av anti-TRA-1-60-PE-antikroppen per 2 x 10 6 celler.
  4. Blanda väl och inkubera vid 4 ° C under 10 min.
  5. Tvätta celler i 1-2 ml buffert per 2 x 10 6 celler. Centrifugera i 10 minuter vid 300 x g.. Sug ut supernatant.
  6. Resuspendera cellerna i 80 l av färgning buffert per 2 x 10 6 celler. Tillsätt 20 l av anti-PE-märkta mikropärlor (från sats) per 2 x 10 6 celler. Blanda väl. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C.
  7. Lägg 1-2 ml färgning buffert per 2 x 10 6 celler. Centrifugera i 10 minuter vid 300 x g.. Sug ut supernatant.
  8. Resuspendera cellerna i 500 & #956, l av färgning buffert.
  9. Magnetisk cellseparation:
    1. Placera kolonnen i magnetisk cellsorterare. Skölj kolonnen med 3 ml färgningsbuffert.
    2. Applicera cellsuspension från 6,8 till kolonnen.
    3. Placera ett rör vid den negativa porten för att samla in TRA-1 till 60-negativa celler.

7. Total RNA-extraktion

  1. Lyse cellerna genom att köra proverna genom en kommersiellt tillgänglig mikrosator mini spinnkolonn avsedd för nukleinsyra minipreps.
  2. Utdrag totala RNA från iPS-celler, iPS-RPE och foster RPE med den kommersiellt tillgängliga RNA-extraktion kit för att bevara små RNA-molekyler 27.
  3. Bestämning av de totala RNA-koncentrationer med hjälp av en Nanodrop spektrofotometer.

8. Bioanalyzer och microarray-analys

  1. Kontrollera RNA integritet med Bioanalyzer i samband med kommersiellt tillgängligt RNA kvalitet kit.
  2. Inkubera 100 ng avtotalt RNA med fosfatas från kalvtarm vid 37 ° C under 30 min
  3. Denaturera RNA med användning av 100% DMSO vid 100 ° C under 5 min.
  4. Märk proverna med pCp-Cy3 med användning av T4-ligas genom inkubation vid 16 ° C under 1 timme.
  5. Hybridisera på en 8_x_15K format humant miRNA array.
  6. Tvätta matriser enligt tillverkarens anvisningar och scanna med en upplösning på 5 nm med hjälp av en skanner.
  7. Förvärva data med hjälp av microarray feature extraction programvara kompatibel med miRNA microarray.
  8. Bearbeta miRNA signalerna för att bestämma den relativa nivån av uttryck i varje prov.
  9. Jämför uttrycksnivåer av varje miRNA mellan provgrupperna. Välj miRNA med åtminstone två-faldig differentiellt uttryck för ytterligare analys.
  10. Med hjälp av kommersiellt tillgänglig programvara för dataanalys, följ instruktionerna för att generera värmekartor för visualisering av differentiellt uttryckta miRNA 28.

9. Pathway Analys

  1. Spara data från miRNA valts i 8.9 i Excel-format.
  2. Logga in på online-RNA vägen analysprogram. Ladda upp Excel-filen. Välj "Flexibel Format" för filformat och välj "Agilent" från rullgardinsmenyn för ID-typ.
  3. Under rådata rubriken, tilldela "ID" för att sondera ID-kolumnen och tilldela "Observation 1" och "log förhållande" till logg ranson kolumnen. Välj "ignorera" för alla andra kolumner.
  4. Välj parametrarna för analys enligt följande: Förtroende: experimentellt observerats endast; omfattar direkta och indirekta relationer; och inkluderar endogena kemikalier; Välj Uppfinningsrikedom Kunskapsbas som referensuppsättning. Välj databasen referensmolekyler som innehåller data från alla arter, alla cellinjer och vävnader, och alla mutationer.
  5. Kör nätverk och vägen analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

iPS-celler (Figur 1A) odlades i differentieringsbetingelser för att inducera differentiering in i iPS-RPE-celler. IPS-RPE uppvisade klassiska RPE fenotyp av sexkantiga pigmenterad cell morfologi (Figur 1B) liknar foster RPE (Figur 1C).

För att bättre förstå vilken roll miRNA kan spela under differentieringsprocessen från iPS till iPS-RPE var microarray analys av miRNA uttryck genomförts. Totalt RNA samlades in från iPS-celler, foster RPE och iPS-RPE använder Mirvana miRNA isolering kit för att säkerställa maximal retention av små RNA. RNA kvantifierades och testades med avseende på renhet före hybridisering till microarray LabChip. Probes representerande 1.205 människa och 144 virus miRNA användes för att analysera miRNA uttryck från varje provuppsättning. De signaler som analyserades för att bestämma de relativa nivåerna av uttryck av varje miRNA från varje prov. Data användes för att jämföra miRNA e Xpression profil för iPS-RPE till iPS och foster RPE. Värme kartor genererades för att möjliggöra visualisering av differential miRNA uttryck mellan grupperna (Figur 2A). 83 miRNAs som differentiellt uttryckta i iPS jämfört med iPS-RPE, med 47 miRNA uppreglerade i iPS jämfört med iPS-RPE och 36 nedregleras i iPS (Figur 2B). 110 miRNA var differentiellt uttryckta i foster RPE jämfört med iPS-RPE, med 61 miRNA uppreglerade i fRPE, och 49 nedregleras i fRPE jämfört med iPS-RPE (figur 2C). Pathway analys med mjukvaran Uppfinningsrikedom IPA angivna differentiellt uttryckta miRNA mål avskrifter för gener som är involverade i cell-utveckling, tillväxt, spridning och överlevnad, cellcykeln och cellrörelse. MiRNA uttryckt i okulära vävnader in vivo visade sig vara anrikade på iPS-RPE och fetalt RPE jämfört iPS (figurerna 3 och 4).

t "fo: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 1
Figur 1. Bright bilder av iPS, fetala RPE, och iPS-RPE. Bright bilder (100X) av iPS-celler före differentiering, foster RPE och RPE härrör från iPS. Både foster RPE och iPS-RPE visa klassiska RPE morfologi sexkantig form och pigmentering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. MiRNA uttryck profil från iPS-RPE jämfört med iPS och foster RPE. A) Värmekartor skildra den relativa graden av differentierade uttryck av miRNA. Färgenskalan representerar uttrycksnivåer av miRNA som ovan (röd), nedan (grön), eller vid betyda uttrycksnivån (svart) i alla prover. B) Jämförelse av miRNA profiler av iPS-RPE till iPS-celler. C) Jämförelse av miRNA profiler av iPS-RPE till foster RPE. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. A) Nätverksanalys av miRNA uttryck profiler av föräldra iPS-celler kontra iPS-derived RPE. Topp 4 nätverken visas separat (till vänster) och slås samman (mitten). B) Pathway analys av differentiellt uttryckta miRNA. Please klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. A) Nätverksanalys av miRNA uttryck profiler av foster RPE kontra iPS-derived RPE. Topp 7 nätverken visas separat (till vänster) och slås samman (mitten). B) Pathway analys av differentiellt uttryckta miRNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Avslutningsvis beskrivs i rapporten de metoder som används för kultur iPS-celler, iPS-RPE och foster RPE. RPE härrör från iPS är morfologiskt och funktionellt liknar foster RPE. IPS-RPE uttrycker också karakteristiska RPE gener inklusive RPE65, CRALBP, PEDF och LRAT 16. För att ytterligare karaktärisera dessa celler extraherades RNA och användes för att utföra mikromatrisanalys för att identifiera differentiellt uttryckta miRNA. Analys av signalintensiteterna visade att det största antalet differentiellt uttryckta miRNA upptäcktes i foster RPE kontra iPS-RPE jämförelser, vilket tyder på iPS-RPE kan vara mer mogen. Framtida studier planeras för att validera dessa resultat med RT-PCR.

Det finns flera kritiska punkter under detta experiment som måste noggrant för att säkerställa framgång för analysen och förvärv av korrekta uppgifter. Den första nyckeln steget sker under kultur av iPS-celler. iPS-celler måste förbli i ett pluripotent staten att behålla sin stemness. Cellerna måste noggrant kontrolleras dagligen för tecken på differentiering. Odifferentierade iPS-celler växa som kompakta flercelliga kolonier. Cellerna bör ha en hög kärn till cytoplasman förhållande och framträdande nukleolerna. De iPS kolonierna kännetecknas av en tydlig gräns, med flera lager av celler i centrum. Tecken på differentiering är förlust av definierade koloni gränser, icke-enhetlig cell morfologi, samt uppkomsten av uppenbara celltyper, till exempel nervceller och fibroblaster. Enstaka celler som har differentierade kan avlägsnas genom dispas och sköljning dock kolonier med dessa egenskaper måste tas bort manuellt från odlings 29.

Beredning av RNA för microarray analys är nästa kritiska steg. Inkonsekvent RNA kvalitet är en viktig källa till variabilitet i microarraydata. RNA-extraktion bör ge hög molekylvikt och minimalt nedbruten RNA för bästa resultat. FramgångsriktRNA-extraktion kommer att ge total RNA med minimal nedbrytning och fri från kontaminerande RNaser. Efter bestämning av RNA-koncentrationen med spektrofotometri vid 260 nm bör renheten hos provet bestämdes vid 230 och 280 nm för att detektera kontaminering med polysackarider eller protein. Den 230:260:280 förhållande till RNA bör vara 1:02:01 att indikera hög kvalitet RNA utan föroreningar 30.

Vid planering av microarray experiment, är det mest kritiska steget att införa negativa kontroller för att säkerställa att hybridisering till sonderna är specifikt, och att köra varje prov i tre exemplar för att säkerställa att de signaler som detekteras är giltiga för den provuppsättning. Under analys av microarray resultat, är en viktig punkt bakgrundskorrektion, där bakgrundsbruset subtraheras från den observerade signalen för att ge den sanna signalintensiteten för varje särskild sond. Detta steg kommer att eliminera falska positiva, samtidigt lyfta fram de sanna positiva signaler. </ P>

Slutligen, under nätverk och väg analys av microarrayresultat, är det viktigaste steget för att etablera rätt parametrar och filter innan analysen. Detta steg kommer att bestämma vilka databaser kommer att användas av programmet för att generera de nätverk och identifiera cellulära vägar som påverkas av de miRNA visats vara differentiellt uttryckt i jämförelserna.

Efter förvärvet av data med hjälp av de metoder som beskrivs i denna rapport, är det nödvändigt att beakta de begränsningar av dessa analyser vid tolkning av resultaten. Även osannolikt, är det fortfarande möjligt att RPE kultur inte är en homogen population av RPE-celler. Den anti-TRA-1-60 sorteringen är en negativ urvalsprocess som tar bort de celler som fortfarande uttrycker stamcellsmarkörer; men det garanterar inte de kvarvarande cellerna är rena RPE-celler. Även morfologiskt cellerna uppvisar klassiska RPE morfologi pigmente and polygonala cellform, är det möjligt att inte alla celler är RPE.

Mikroarray experiment kan ge falska positiva för expression av RNA, i synnerhet i fallet med mikro-RNA på grund av de mycket korta sekvenser. Även om microarray-system som används för detta experiment ingår flera sonder att rikta olika regioner i varje mål, bör resultaten alltid valideras av QRT-PCR.

Analys av microarray data genom Påhittighet IPA är beroende av kvantiteten och kvaliteten på informationen i Uppfinningsrikedom databasen. Mycket av informationen om geners funktion och cellulära vägar kommer från experiment som utförts på transformerade cellinjer eller inom ramen för cancerforskning. Därför kan resultaten av vägen och nätverksanalys med hjälp av detta program är inte alltid nödvändigt för primära celler eller, i detta fall, stamceller.

Trots dessa begränsningar, kan de metoder som beskrivs i denna rapport skall användas förkultur av iPS-celler och fetala RPE, härrör RPE från iPS-celler, och extraktion av RNA för microarray analys av miRNA. De data som genereras av dessa analyser kan användas för att identifiera miRNA involverade i differentieringsprocessen, såväl som de som reglerar RPE funktioner.

Trots att fler miRNA befanns vara differentiellt uttryckta i foster RPE vs iPS-RPE jämförelse än i iPS vs iPS-RPE jämförelse, det finns många möjliga orsaker till detta. Först av allt, vid den tidpunkt denna analys utfördes, miRNA microarray-plattform kunde upptäcka 1,205 människa och 144 virus-miRNA. Sedan dess har plattformen utökats med prober för över 2.000 mänskliga miRNA. Det är säkert möjligt att miRNA differential uttryck profiler kommer att förändras om fler miRNA upptäcks. Av de 1349 miRNA detekterade genom denna analys, visade de flesta av miRNA ingen skillnad i uttrycket mellan celltyper (fig 2B och 2C

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Yttrandena eller påståenden i detta dokument är de privata åsikter författarnas och ska inte tolkas som tjänsteman eller som avspeglar synpunkter från avdelningen av armén eller försvarsdepartementet.

Denna forskning utfördes medan författarna Whitney A. Greene, Alberto Muniz, och Ramesh R. Kaini höll en National Research Council Forskarassistent Associateship på USAISR.

Microarray analyser utfördes av Greehey Barnens Cancer Research Institute Microarray Core Facility och bioinformatik Institutionen vid UT Health Science Center i San Antonio.

Detta arbete stöddes av amerikanska armén klinisk rehabiliterings Medicine Research Program (CRMRP) och Militära Operational Medicine Research Program (MOMRP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5X supplement Stem Cell Technologies 5850
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-β-mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sodium salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Fetal RPE media RTEGM kit Life Technologies 195406
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Trypsin Hyclone(Fisher) 25200-072
Miltenyi Biotec washing buffer StemGent 130-092-987
Miltenyi Biotec rinsing buffer StemGent 130-092-222
Anti-TRA-1-60 microbead kit StemGent 130-095-816
Miltenyi Biotec cell sorter column StemGent 130-021-101
RNeasy micro kit Qiagen 74004
QIA shredder Qiagen 79654
RNA 6000 Pico LabChip kit Agilent G2938-90046
Human miRNA microarray v16 Agilent G4471A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
  2. Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
  3. Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
  4. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
  5. Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
  6. Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
  7. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  8. Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
  9. Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
  10. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
  11. Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
  12. Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
  13. la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
  15. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
  16. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
  17. Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
  18. Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
  19. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
  20. Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
  21. Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
  22. Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
  23. Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
  24. Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
  25. Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
  26. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
  27. Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. (2013).
  28. Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. (2011).
  29. Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. (2010).
  30. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics