Hochdurchsatz-Analyse von Säugetiergeruchsrezeptoren: Die Messung der Rezeptoraktivierung über Luciferaseaktivität

Neuroscience

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Summary

Riechrezeptoraktivierungsmuster kodieren Geruch Identität, sondern der Mangel an veröffentlichten Daten zur Identifizierung Geruchsliganden für Säugetiergeruchsrezeptoren behindert die Entwicklung eines umfassenden Modells der Duftkodierung. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Identifizierung Geruchsrezeptorliganden und Quantifizierung der Rezeptoraktivierung zu erleichtern.

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Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity. J. Vis. Exp. (88), e51640, doi:10.3791/51640 (2014).

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Abstract

Geruchsstoffe schaffen einzigartige und überlappenden Mustern von olfaktorischen Rezeptoraktivierung, so dass eine Familie von rund 1.000 Mäuse-und 400 menschliche Rezeptoren, um Tausende von Geruchsstoffen zu erkennen. Riechstoffliganden für weniger als 6% der menschlichen Rezeptoren 1-11 erschienen. Dieser Mangel an Daten zum Teil auf Schwierigkeiten funktionell exprimieren diese Rezeptoren in heterologen Systemen. Hier beschreiben wir eine Methode für die Mehrheit der olfaktorischen Rezeptorfamilie in Hana3A Zellen, gefolgt von Hochdurchsatz-Beurteilung der olfaktorischen Rezeptoraktivierung mit Hilfe eines Luciferase-Reporter-Assay zum Ausdruck. Dieser Test kann (1) Bildschirm-Panels von Geruchsstoffen gegen Platten von olfaktorischen Rezeptoren verwendet werden; (2) bestätigen Geruchs / Rezeptor-Interaktion über Dosis-Wirkungs-Kurven; und (3) Vergleich der Rezeptoraktivierung Niveaus unter Rezeptorvarianten. In unserem Beispieldaten wurden 328 Geruchsrezeptoren gegen 26 Geruchsstoffe untersucht. Riechstoff / Rezeptor-Paare mit unterschiedlichen Antwort-Werte waren AuswahlTed und in Dosis-Wirkungs-getestet. Diese Daten zeigen, dass ein Bildschirm ist eine wirksame Methode, um Geruchs / Rezeptor-Paare, die eine Dosis-Wirkungs-Experiment passieren wird, dh Rezeptoren, die einen echten Reaktion auf einen Duftstoff haben zu bereichern. Daher ist dieses Hochdurch Luciferase-Assay eine effektive Methode zur Geruchsrezeptoren, einen wesentlichen Schritt in Richtung eines Modells der Duftkodierung im Säugetierriechsystem charakterisieren.

Introduction

Die Säugetierriechsystem hat die Fähigkeit, auf eine Vielzahl von Geruchsreize zu reagieren, so dass für den Nachweis und die Unterscheidung von Tausenden von Geruchsstoffen. Olfaktorischen Rezeptoren (OR) sind die molekularen Sensoren von den Riechzellen im Riechepithel 12 ausgedrückt. Säugetiergeruchserkennung erfolgt durch unterschiedliche Aktivierung von OR durch Geruchsstoffe, und die ODER-Gen-Familie ist umfangreich, mit rund 1.000 murinen und menschlichen Rezeptoren 400 12-16. Zurück funktionelle Analysen von OR in olfaktorischen Neuronen und in heterologen Zellen haben gezeigt, dass unterschiedliche Geruchsstoffe werden durch eindeutige erkannt, aber überlappenden Ensembles von OR 10,17-20. Passende Liganden an OPs ist entscheidend für das Verständnis der olfaktorischen Code und wesentlich für den Aufbau lebensfähige Modelle des Geruchssinns. Aufgrund von Schwierigkeiten exprimieren ORs in heterologen Systemen sowie die große Zahl der beiden Duftstoffe und ORs hat diese Daten von der f weitgehend gefehltield; ja, weniger als 6% der menschlichen OPs haben einen Liganden 1-11 veröffentlicht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Luciferase-Assays zur Geruchs / oder Wechselwirkungen charakterisieren. Dieser Test ermöglicht die Hochdurchsatz-Charakterisierung von OPs, eine Aufgabe, die für das Verständnis Geruchs / ODER Wechselwirkungen sowie die Entwicklung eines Modells der Duftkodierung ist.

Hochdurchsatz-Untersuchungen der OPs stehen vor drei großen Herausforderungen. Zunächst wurden ORs in heterologen Zellen exprimiert im ER zurückgehalten und anschließend in das Proteasom abgebaut 21,22, verhindert die RUP Interaktion mit Geruchsstoffen in dem Testsystem 23-25. Dieses Problem wurde durch die Entdeckung der Hilfsproteine, die stabile Zelloberflächenexpression von einer breiten Palette von OR 19,26,27 erleichtern gerichtet. Rezeptor-Transporter-Proteine ​​1 und 2 (RTP1 und 2) fördern oder Zelloberflächenexpression und Aktivierung in Reaktion auf Geruchsstimulation 19. Basierend auf dieser Arbeit wurden HEK293T-Zellenmodifiziert, um stabil exprimieren RTP1 lang (RTP1L) und RTP2, Rezeptor Expression verstärkenden Protein 1 und G αolf, was in der Hana3A Zellinie 19,27. Darüber hinaus ist die Art 3 muskarinischen Acetylcholinrezeptors (M3-R) wirkt mit ORs an der Zelloberfläche und fördert die Aktivierung in Reaktion auf Riechstoffe 26. Co-Transfektion eines OR mit RTP1S und M3-R in Hana3A Zellen führt die robuste, konsistente und funktionelle Expression von einer breiten Palette von OPs an der Zelloberfläche 27. Zweitens Säugetier ODER Repertoires sind recht groß. Bei Menschen, zum Beispiel, ist die OR-Repertoire um eine Größenordnung zahlreicher als die Geschmacksrezeptorrepertoire und 2 Größenordnungen zahlreicher als die visuellen Rezeptor Repertoire. Obwohl das Klonen einer einzigen OR ist eine relativ einfache Protokoll wird bedeutende Vorleistungen Aufwand erforderlich, um eine umfassende Bibliothek zu erzeugen. Drittens, obwohl wir wissen, dass in der Sicht, übersetzt Wellenlänge in Farbe undVorsingen in Frequenz übersetzt in Tonhöhe, die Organisation von Gerüchen schlecht verstanden, dass es schwierig für Forscher aus einer repräsentativen Stichprobe von Geruchsstoffen zu interpolieren. Obwohl einige Fortschritte an dieser Front 10,28 erzielt wurden, bleibt die Karte des olfaktorischen Landschaft unvollständig. Screening Zehntausende von Molekülen gegen Hunderte von OPs ist eine gewaltige Aufgabe; Hochdurchsatz-Bildschirme in diesem Bereich erfordern sorgfältig definierten Kampagnen. Die wichtigsten sind die verbleibenden Herausforderungen der Logistik und Kosten und nicht als Probleme, die auf die Technik. Obwohl heterologen Screening wurde nicht häufig verwendet, um Liganden von akademischen Gruppen zu identifizieren, hat ein privates Unternehmen die gleiche Technik verwendet, um Liganden für 100 menschlichen OR 29 zu identifizieren. Leider bleiben diese Daten geschützt.

Die Hochdurchsatz-Luciferase-Assay skizzierten hat mehrere Vorteile gegenüber verwendet werden, um zu beurteilen oder Aktivierung alternativer Methoden. Obwohl die Verantwortungses von nativen Riechzellen gemessen worden mit Elektrophysiologie und Kalzium-Imaging, haben diese Techniken Schwierigkeiten auseinander, die Hänseleien ODER Antwort eines Neurons aufgrund der Überlappung in Reaktion Eigenschaften für olfaktorischen Neuronen führt. Obwohl Klopfen in einem GFP-markierten Rezeptor Typ 30,31 und liefert spezifische Rezeptoren über Adenovirus olfaktorischen Neuronen murinen 32,33 oder die Durchführung der RT-PCR nach Aufnahmen 17,24,33 können Aufnahmen zu einzelnen Rezeptortypen zu verknüpfen, sind diese Methoden Niedrigdurchsatz und nicht für große Bildschirme geeignet. Heterologe Screening-Systeme sind skalierbar und zwei Hauptformen sind in der Literatur gefunden: cAMP-Weg Reportern und Inositol-Triphosphat (IP3)-Weg Reportern. Bei Geruchsstimulation, OPs aktivieren einen G αolf Übertragungssignalkaskade, die in der Produktion von zyklischem AMP (cAMP) 12 führt. Durch Co-Transfektion einer Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des NetzAMP-Response-Element (CRE), kann Luciferase-Produktion als Funktion der Geruchsreaktion gemessen werden, so dass für die Quantifizierung oder Aktivierung. Oder Aktivierung kann auch auf die IP3 Weges durch Coexpression G-Proteine, wie G α15/16 oder G α15-OLF-Chimäre 24,25,34 verbunden werden. Wir haben den Test hier dargestellt anhand von drei Faktoren ausgewählt: (1) die Co-Expression von RTP1 mit Rho-markierten Geruchsrezeptoren verbessert die Expression der olfaktorischen Rezeptoren an der Zelloberfläche 19,27; (2) Verwendung eines cAMP-responsive Reporter-Gen ermöglicht die Messung von OR-Aktivierung durch die kanonischen zweiten Messenger-Pfad; und (3) der Test ist gut geeignet, um Hochdurchsatz-Screens.

Dieser hohe Durchsatz Luciferase Assay auf eine Vielzahl von Studien wertvoll Bereich des Geruchssinns. Erstens kann eine große Anzahl von OR gegen einen einzelnen Geruchsstoff um die Rezeptoraktivierung Muster für ein sp bestimmen gescreent werdenecific Riechstoff. Diese Art der Studie identifizierten OR7D4 als OR für die Reaktion auf die Steroid-Geruchsstoff Androstenon 8 verantwortlich. Umgekehrt können eine oder können gegen eine Reihe von Geruchsstoffen, um die Rezeptorantwort Profil 10 zu bestimmen, untersucht werden. Wenn Kandidaten olfaktorische Geruchs / oder Paaren über diesen Fenstern identifiziert, kann die Interaktion durch die Durchführung einer Dosis-Wirkungs-Experiment der Prüfung der Antwort des ODER steigenden Konzentrationen von Geruchs bestätigt werden. Dosis-Wirkungs-Kurven können auch beurteilen, wie genetische Variation in einem oder in vitro Geruchs Antwort 8,9,11,35 beeinflusst, und diese Untersuchungen kann zu inter ODER Variante erweitert werden, so dass für die Prüfung der Rezeptor Evolution über Arten und kausale Mutationen in der Evolution 36,37 schließlich Dieser Assay kann verwendet werden, um Geruchs Antagonisten, die in der Lage, zu antagonisieren oder die Reaktion auf einen bestimmten Duftstoff für eine bekannte Geruchs / Rezeptor-Paar 38,39 sind zu screenen. Zusammenfassend, diese hohenDurch Luciferase-Assay ist für eine Reihe von Studien, die helfen, zu charakterisieren oder Aktivierungsmuster und ein besseres Verständnis der Duftkodierung im olfaktorischen System.

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Protocol

1. Hana3A Kultur der Zellen

  1. Vorbereitung M10 Medium durch Hinzu Minimum Essential Medium (MEM) mit 10% (v / v) FBS.
  2. Kultur Wartung
    1. Pflegen Zellen in M10-Medien. HINWEIS: Die Expressionsvektoren für RTP1L, RTP2, REEP1 und G αolf verleihen Puromycinresistenz zu Hana3A Zellen, aber die Aufrechterhaltung der Zellen mit diesem Antibiotikum nicht wesentlich beeinflusst Testergebnisse.
    2. Subkultur in einem Verhältnis von 1:8 in 10 cm Schalen alle 2-3 Tage.
    3. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2.

2. Plating Zellen für Transfektion

  1. Saugen Sie Medien aus einer 100% konfluente 10 cm Schüssel mit Hana3A Zellen.
  2. Waschen der Zellen durch Zugabe von 10 ml PBS, wirbeln die Schüssel und Absaugen des PBS.
  3. 3 ml 0,05% Trypsin / EDTA und warten Zellen zu dissoziieren (ca. 1 min).
  4. Trypsin inaktivieren durch Zugabe von 5 ml M10 und brechen Zellklumpen durch Verreiben etwa 10x &# 160, mit einer 10 ml Pipette. Pipette vorsichtig, damit die Einführung von Luftblasen in den Medien.
  5. Für jede Platte mit 96 Vertiefungen, 1 ml der Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen, Zentrifuge bei 200 × g für 5 Minuten und Aspiration des Überstands ohne das Zellpellet zu stören.
  6. Resuspendieren der Zellen in 6 ml M10 pro 1 ml Zellen in Schritt 2.5 überführt.
  7. Je 50 ul der Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen beimpft und über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2.

3. Transfektion von Geruchsrezeptoren

  1. Herstellung von Plasmid-DNA
    1. Bereiten Plasmid-DNA über eine Endotoxin-freies Protokoll. HINWEIS: Verwenden Sie Plasmid-DNA-Präparation Kits als "Endotoxin-frei", oder fügen Sie eine Phenol-Chloroform-Extraktionsschritt an das Plasmid-DNA-Präparation Protokoll.
    2. Verdünnte DNA auf eine Konzentration von 100 ng / ul in TE-Puffer.
  2. Beachten plattierten Zellen (Schritt 2.7), um eine ordnungsgemäße Konfluenz von Nähe gewährleistenTely 30-50% pro Vertiefung und zum Inkubator. ANMERKUNG: Dies Konfluenz nicht optimal für die Lipid-Transfektionsreagenz, eine Konfluenz von 30-50% in diesem Schritt für die Messung optimale Luciferase-Aktivität 24 Stunden nach der Transfektion.
  3. Vorbereitung der Transfektion Mix
    1. Pipette RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc und pSV40-RL Plasmide in MEM-Medium pro den in Tabelle 1 aufgeführt, um die Plasmid-Mix machen Volumen (Volumen sind pro 96-Well-Platte). RTP1S PCI
      Plasmid-Mix
      pro Well pro 96-Well-Platte
      MEM - 500 ul
      5 ng 480 ng
      M3-R-pCI 2,5 ng 240 ng
      pCRE-luc 10 ng 960 ng
      pSV40-RL 5 ng 480 ng

      Tabelle 1. Plasmid-Mix-Komponenten. Per gut und pro 96-Well-Platte Mengen RTP1S-PCI, M3-R-PCI, pCRE-luc und pSV40-RL und MEM.
    2. Für jede 96-Well-Platte, verdünnte 18 ul Lipid-Transfektionsreagenz in 450 ul MEM-Medium.
    3. Pipette Plasmid-Mix (aus Schritt 3.3.1), Rhodopsin-markierten Geruchsrezeptor in den PCI-Plasmid (Rho-oder-PCI) und Lipid Transfektionsmischung (aus Schritt 3.3.2) die Komplexe in detaillierte, um Tabelle 2. HINWEIS: Diese Reaktion ist zeitempfindlich und sollte nicht erlaubt werden, für mehr als 30 Minuten fortsetzen. Die gut + 10% Berechnung ist wichtig, eine ausreichende Lautstärke für nachfolgende Schritte zu gewährleisten. Lipid Transfektionsmischung
      Komplex
      pro Well pro Well + 10%
      Plasmid-Mix 4.2 ul 4,58 ul
      Rho-OR-pCI 0,05 ng 0,06 ng
      4.2 ul 4,58 ul
      M10 41,7 ul 45.83 ul

      Tabelle 2. Komplexe Bauteile. Per gut und pro Well + 10% Volumen von Plasmid-Mix (Tabelle 1), Geruchs-Rezeptor-Plasmid (Rho-oder-PCI) und Lipid-Transfektion Mix. M10 wird zugegeben, um die Reaktion nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur abzuschrecken.
  1. Tippen Sie die Medien auf den Zellplatten.
  2. Je 50 ul komplexer in jede Vertiefung und Inkubation über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2.

4. Geruchsstimulation

  1. Beachten Sie die transfizierten Zellen, um eine ordnungsgemäße Konfluenz von 50-80% pro Vertiefung zu gewährleisten und zum Inkubator. HINWEIS: Wenn Zellen sind weniger als 50% Konfluent, Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase-Messungen können zur Messung der Rezeptoraktivierung zu niedrig sein. Betrachten Sie das Verwerfen der Platte.
  2. Bereiten 1 M Stammlösungen der einzelnen Geruch in DMSO.
  3. Bereiten Duftstimulation Lösungen in CD293 Medium.
    1. Für Screening-Experimenten, verdünnte Stammlösung von Geruch bis 100 um. Auch (nur CD293), um sich für oder Hintergrund Aktivierung steuern bereiten eine no-Geruchskontrolle. HINWEIS: Für die Screening-Experimenten, die jeweils OR / Geruch Paar wird nur einmal pro Experiment getestet. Da einige Geruch Diffusion über Brunnen möglich ist, empfiehlt es sich, mit einem Geruchsstoff für jede Platte zu stimulieren.
    2. Für Dosis-Wirkungs-Experimente, bereiten sieben 10-fach serielle Verdünnungen der Geruch Stammlösung in dreifacher Ausfertigung ab 1 mM für jeden Rezeptor. Auch bereiten die gleichen Geruch Verdünnungen in dreifacher Ausfertigung für Leervektor-transfizierten Zellen, um für die Geruchs Hintergrund Aktivierung steuern. HINWEIS: Für die Dosis-Wirkungs-Experimenten, die jeweils odor Konzentration Behandlung sollte in dreifacher Ausführung durchgeführt werden.
  4. Tippen Sie die Medien auf den Zellplatten.
  5. Je 25 ul der Geruchsstimulationslösung in jede Vertiefung und Inkubation für 4 Stunden.

5. Messen oder Aktivität über Luciferase Assay

  1. Resuspendieren Glühwürmchen-Luciferase Substrat pro Anweisungen des Herstellers und bei -80 ° C
  2. Tauwetter 1 ml Luciferase Substrat pro 96-Well-Platte.
  3. Bereiten Sie frischen Glühwürmchen-Luciferase-Reaktion Quencher und Renilla Luciferase-Substrat-Reagenz (5 ul Luciferase Löscher / Renilla Luciferase Substrat pro 1 ml Puffer). Anmerkung: Etwa 1 ml Reagenz pro Platte mit 96 Vertiefungen benötigt.
  4. Bereiten Sie die lumineszierenden Mikroplatten-Reader. Öffnen Sie den Mikroplatten-Reader-Software. Innerhalb des Systems Symbol:
    1. Unter der "Pre-Heizung" Tab, markieren Sie das Kästchen für "ON" und stellen Sie die Temperatur der Maschine bis 25 °, C.
    2. Unter dem Reiter "Spender", Prime jeder Spender mit 1000 ul von 70% Ethanol, gefolgt von 1.000 ul destilliertem Wasser. HINWEIS: Verwenden Sie separate Teilmengen von Alkohol und Wasser für jeden Spender. Ethanol wird verwendet, um die Spender zu desinfizieren und Wasser entfernt das restliche Ethanol.
    3. Prime jeder Spender mit 1500 ul von Luft (Entfernen von Flüssigkeit Spender). HINWEIS: Grundierung mit Luft sorgt dafür, dass Luciferase-Substrate nicht mit Restwasser verdünnt.
    4. Prime Spender 1 mit 1080 ul von Firefly Luziferase-Substrat (aus Schritt 5.2). Prime Spender 2 mit Renilla-Luciferase-Substrat (aus Schritt 5.3). HINWEIS: Achten Sie darauf, Quer verunreinigen die Luciferase-Substraten. Grundierung mit Luciferase-Substrate füllt den toten Raum in den Reagenz-Spender.
  5. Das folgende Protokoll eingestellt, um sowohl Glühwürmchen-und Renilla-Luciferase Lumineszenz lesen. Innerhalb der mit dem Mikroplatten-Reader, un zugehörige SoftwareDer das Menü "Datei", klicken Sie auf "Neue Aufgabe". Markieren Sie "Protokolle" und klicken Sie auf "Create New". Im nächsten Fenster, sollte der Kreis neben "Standard Protocol" ausgewählt werden. Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie doppelt auf "Vorgehensweise" auf der linken Seite des Bildschirms.
    1. Dispense 10 ul von Firefly Luziferase-Substrat in alle Vertiefungen mit Spender 1. Unter dem Menü "Aktionen" auf "Dispense". Im Fenster "Dispense Step", ein: "Spender", um ein "Priming", um keine "Dispense Volume" auf 10 ul und "Rate" zu 225 ul / Sek. Klicken Sie auf "OK".
    2. Schütteln Sie die Platte für 30 Sekunden. Unter dem Menü "Aktionen" auf "Shake". Im Fenster "Shake-Step", stellen Sie "Intensity" auf Mittel-und "Dauer", um 00.30 Uhr MM: SS. Klicken Sie auf "OK".
    3. Lesen Sie die Lumineszenz von allen Wells für 0,5 Sekunden pro Vertiefung. Unter dem Menüpunkt "Aktionen", klicken Sie auf "Lesen";. Im Fenster "Lesen Step", ein: "Erkennungsmethode", um Lumineszenz "Lesen Type" Endpoint "Integrationszeit" bis 00.00.50 MM: SS: ss "Filter Sets" auf 1 "Emission" Hole, "Optik-Position" zwischen oben, "Gain" auf 135, und "Read Höhe" zu 1,00 mm. Klicken Sie auf "OK".
    4. Dispense 10 ul Renilla Luciferase Substrat in alle Vertiefungen mit 2 Spender. Stellen Sie die Bedingungen wie in Schritt 5.6.1, außer set "Spender" bis 2.
    5. Schütteln Sie Platte für 30 Sekunden. Stellen Sie die Bedingungen wie in Schritt 5.6.2.
    6. Lesen Lumineszenz von allen Wells 0,5 Sekunden pro Vertiefung. Stellen Sie die Bedingungen wie in Schritt 5.6.3.
  6. Nehmen Sie den Deckel von der 96-Well-Platte und legen Sie die Platte in der Mikroplatten-Reader. Starten Sie das Programm in Schritt 5.5 festgelegt, um die Platte Lumineszenz lesen.
  7. Reinigen Sie die Reagenzspender Pumpen. Von der System-Symbol unter der Registerkarte "Spender":
    1. Purge 1000 ul firefly Luciferase Substrat aus der Firefly Luziferase Spender in eine Sammelröhre. HINWEIS: Firefly Luziferase kann bei -80 ° C gelagert und wiederverwendet werden.
    2. Prime jedes Spenders mit 1000 &mgr; l destilliertes Wasser und anschließend mit 1000 &mgr; l 70% Ethanol, und schließlich 1,500 ul Luft (Entfernen von Flüssigkeitsabgabevorrichtungen). HINWEIS: Wasser entfernt Luciferase-Substrate aus der Reagenzienpumpen, Ethanol desinfiziert und Luft trocknet restliche Ethanol.

6. Datenanalyse

  1. Data Export
    1. In der Mikroplatten-Reader-Software, klicken Sie doppelt auf "Report / Export Builders" auf der linken Seite des Bildschirms.
    2. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Neue Export to Excel" und klicken Sie auf "OK".
    3. Markieren Export1 und klicken Sie auf "Bearbeiten".
      1. Unter "Inhalt" check "Systembeschreibung", "Verfahren", "Platten-Beschreibung" und "Plate Layout-Matrix". Include "Rohdaten" einnd "Berechnete Daten".
      2. Unter "Workflow", aktivieren Sie "Automatisch ausführen nach Abschluss des Verfahrens". Unter Exportmodus, aktivieren Sie "Alle Platten in der gleichen Arbeitsmappe" und "Wie ein neues Arbeitsblatt".
      3. Unter "Datei" wählen Sie den Dateinamen Format und Speicherort der Datei, und klicken Sie auf "OK".
      4. Schließen Sie das Fenster "Report / Export Builders".
  2. Um normalisierte Luciferase-Werte zu erhalten, teilen Sie die Glühwürmchen-Luciferase Lumineszenz Lektüre für jeden gut (Schritt 5.6.3) durch die Renilla-Lumineszenz-Lektüre für jeden gut (Schritt 5.6.6).

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Representative Results

Eine primäre Bildschirm getestet OR 328 gegen 26 Gerüche in einer Konzentration von 100 uM. Diese Geruchskonzentration wurde gezeigt, dass ein großer Teil der ORs mit bekannten Liganden 10 effektiv aktivieren. Zunächst wurde normalisierte Luciferase-Aktivität durch Division der Glühwürmchen-Luciferase Lesung des Renilla-Luciferase Lesen berechnet. Als nächstes wurden als Baseline-Werte durch Subtrahieren der normalisierten Messwerte für die Luciferase keine Geruchskontrolle aus den normalisierten Luciferase Ablesungen für jede Vertiefung (1) berechnet. Dosis-Wirkungs-Kurven wurden auf 48 Riechstoffgeführt / oder Paaren zufällig über den Bereich der Baseline-Werte verteilt, wie durch Farbbalken in Fig. 1 angegeben. ORs wurden mit 7 Konzentrationen von Geruchsspannt 1 nM bis 1 mM behandelt, und die resultierenden Reaktionen waren fit zu einer S-förmigen Kurve durch nichtlineare Regression. Ein Geruchsstoff / ODER galt als ein Agonist, wenn sie drei Kriterien erfüllt sind: (1) der Standardfehlerdie logEC 50 weniger als 1 log-Einheit; (2) die 95%-Konfidenzintervalle für den oberen und unteren Parameter der Kurve nicht überlappen; und (3) die zusätzlichen Summen der Quadrate-Test bestätigt, dass der Geruchsstoff aktiviert die ODER-enthaltenden Zellen deutlich mehr als die Kontrollzellen, die mit einem leeren Vektor transfiziert wurden. Dosis-Antwort-Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Diese Daten wurden dann verwendet, um festzustellen, wie gut die Testmessungen in einem primären Bildschirm vorhersagen Ergebnisse der Dosis-Wirkungs-Kurve. Blaue Balken in Abbildung 1 entsprechen, zu Paaren, die als Agonisten in einer vollen Dosis-Wirkungs-Experiment eingestuft wurden, während rote Balken nicht unsere drei oben genannten Kriterien erfüllen. Werte aus dem primären Bildschirm vorhergesagten Ergebnisse von der vollen Dosis-Wirkungs-Experiment (Fläche unter der ROC-Kurve (AUC) = 0,68, p <0,01, Mann-Whitney-U-Test), was darauf hinweist, dass unsere primäre Bildschirm ist eine nützliche Methode für Geruchs / ODER-Paaren, die als Agonisten in einer vollen Dosis-Wirkungs-Experiment (Abbildung 2) eingestuft werden zu bereichern.

Figur 1
Abbildung 1. Häufigkeit der Baseline-Luciferase-Werte für einen Bildschirm mit einem Panel von olfaktorischen Rezeptoren und Geruchsstoffe. Histogramm der Häufigkeit (Count) von Baseline für jeden Duftstoff / ODER Paar in der primären Bildschirm berechnet Luciferase-Werte. Als Riech-/ Rezeptoraktivierung Paare sind spärlich sind die meisten der Werte auf Null zentriert ist und die große zentrale Verteilungs schätzt die Rauschverteilung für diesen Assay. Farbige Balken zeigen Geruchs / Rezeptor-Paare für die Dosis-Wirkungs-Analyse ausgewählt; blauen Balken sind Paare, die als Agonisten auf der Grundlage der vollen Dosis-Wirkungs eingestuft wurden, und rote Balken sind Paare, die nicht als Agonisten eingestuft wurden.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51640/51640fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
Abbildung 2. ROC-Kurve für den Geruchsstoff / Rezeptor-Bildschirm. Geruchs 48 / Rezeptor-Paare wurden als Agonisten oder als nicht-Agonisten eingestuft. Wahr-Positiv-Rate (Sensitivität) wurde dann gegen die falsch positiv Rate (1-Spezifität) mit dem Statistikpaket R 40 aufgetragen. Die Fläche unter der Kurve (AUC) beträgt 0,68, was darauf hinweist, dass Duftstoff / Rezeptor-Paare mit höheren Luciferase Bildschirmwerte sind eher Dosis-Antwort als jene mit niedrigeren Werte zu. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

<tr height = "21"> height: 21px; "> 0,164647156 1 "style =" height: 21px; "> -,109048046
Baseline-Wert Dosis-Antwort
0,051793067 scheitern
0,006376956 scheitern
0,331936398 passieren
0,591006519 passieren
0,049093369 passieren
0,396788976 passieren
-0,013655743 passieren
0,011080217 passieren
0,004203349 scheitern
0,003975049 scheitern
-,077935718 passieren
-,084488317 passieren
0,030236078 scheitern
-0,042963576 scheitern
0,031466406 scheitern
0,025897747 scheitern
-0,030434651 scheitern
-,004122795 scheitern
-,010075533 scheitern
0,028883452 scheitern
0,019402373 scheitern
0,047508749 scheitern
0.00255344 scheitern
0,017221449 scheitern
0,340216655 passieren
-0,026912181 scheitern
0,037140428 scheitern
0,467763017 passieren
0,097665337 scheitern
0,080657267 passieren
0,172819211 passieren
0.05568393 passieren
-0,106721064 passieren
0,136614849 passieren
0,457839849 scheitern
0,211751741 scheitern
0.1581464 passieren
-,62099155 passieren
-,066949491 passieren
-0,78712035 passieren
0,752503007 passieren
1,433407558 passieren
0,475431098 passieren
1,457936815 passieren
0,048652537 scheitern
0,027196782 scheitern
0,129599842 scheitern
-0,069781272 scheitern
0,016450039 scheitern
-0,025639207 scheitern
0,158152141 scheitern
-,032570055 scheitern
0,140139926 scheitern
-0,052030276 scheitern
0,657140133 passieren
1,040410297 passieren
passieren
0,399588712 passieren
0,188094387 passieren
0,039371424 passieren
0,016784352 passieren
0,229959571 passieren
0,238381997 scheitern
0,074118909 scheitern
0,423901128 passieren
0,152621022 passieren
passieren
0,075301806 passieren
0,395233972 passieren
0,261892958 passieren
0,156693306 scheitern
2,163418147 passieren
3,649862104 passieren
0,025716169 passieren
-0,033258008 passieren
-0,026984127 scheitern
-0,338441868 passieren
0.37398618 passieren

Tabelle 3. Riech in Dosis-Wirkungs-Rezeptor getestet / Geruch Paaren. Baseline-Luciferase-Werte und Dosis-Wirkungs-Ergebnisse (bestanden oder nicht bestanden) für 48 OR / Geruch Paare, die aus dem Bildschirm. Für 30 Paare auf dem Bildschirm zweimal getestet, beide mit Baseline-Luciferase-Werte enthalten.

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Discussion

Riechstoffidentität wird von Geruchsrezeptoraktivierungsmuster codiert, sondern Rezeptoraktivierungsmuster, einschließlich der Rezeptoren aktiviert werden und zu welchem ​​Grad, für weniger als 6% der menschlichen Geruchsrezeptoren 1-11 bekannt. Anstrengungen zur Geruchsrezeptoren charakterisiert durch ihre arbeitsintensive Verfahren und Anwendbarkeit auf nur eine Teilmenge des olfaktorischen Rezeptorfamilie 17,23,24,33,34 beschränkt. Die Hana3A heterologe Expressionssystem unterstützt die robuste Expression der meisten getesteten Geruchsrezeptoren, und kann in Verbindung mit einer cAMP-responsive Luciferase-Reportersystem olfaktorischen Rezeptoraktivierung 19,26,27 Überwachung verwendet werden. Die Leistung dieses Assays in einer 96-Well-Format unterstützt eine Reihe von Hochdurchsatz-experimentellen Designs, einschließlich Bildschirme, um Kandidaten für Geruchs / olfaktorischen Rezeptor-Paare und die Dosis-Wirkungs-Kurven zu bestimmen, um Wechselwirkungen zu bestätigen und zu beurteilen, wie Rezeptoraktivierung Ebenen sind afdurch intra-und interspezifische Variationen betroffen. Riechstoff / Rezeptor-Paare mit höheren Aktivitätswerten in einem Bild sind eher eine signifikante Dosis-Antwort zu demonstrieren. Diese Daten legen nahe, dass dieses Screening-Verfahren ist in der Lage, für die Geruchs / Rezeptor-Paare, die Dosis-Wirkungs-geben werden, wodurch die Identifikation der Geruchsstoff-Liganden und Geruchsrezeptoraktivierungsmuster erleichtern bereichern.

Der Erfolg dieser Assay zur Geruchsrezeptor-Analyse optimiert ist von mehreren Faktoren abhängig. Alle Plasmid-DNA muss über eine Endotoxin-freies Protokoll vorbereitet werden. Konsistente olfaktorischen Rezeptorexpression auf der Zelloberfläche ist kritisch. Die Hana3A Zelllinie stabil exprimiert mehrere Hilfsproteine, die in OR-Ausdruck zu unterstützen, aber Co-Transfektion von RTP1S und M3-R erhöht Rezeptor-Expression und Aktivierung bzw. 27. Diese Kombination von Zubehörproteinexpression führt zur zuverlässigen Expression der meisten Geruchsrezeptoren, wodurch der VERGLEICHn der oder die Aktivierung unter Experimente und Rezeptoren. Zusätzlich ist die Überwachung der Zellkonfluenz wichtig, um konsistente Ergebnisse. Unter der Annahme, die Zellen in der ursprünglichen 10 cm 2 Geschirr grob 100% konfluent waren, nach dem hier beschriebenen Protokoll wird in zuverlässiger Zellkonfluenz während des Experiments führt. Wichtig ist, dass ausreichend Zellen plattiert werden, um einen messbaren Luciferaseaktivität Anzeige zu erhalten, aber Zellen nicht überwachsen werden, eine Bedingung, die die Rezeptoraktivierung folgenden Geruchs Stimulation beeinträchtigen können. Normalisieren für die konstitutive Expression Renilla steuert ferner nicht nur die Zelldichte, sondern auch für die Transfektionseffizienz. Eine Renilla-Luciferase Lesen mehr als 2,5 Standardabweichungen unter dem Mittelwert kann darauf hindeuten, Zellverlust. Zellen einheitlich plattiert werden, um dichte Platten, die leichter lösen sich von der Plattenoberfläche als spärlicher Zellen zu vermeiden, und Transfektion und Geruchs Lösungen sollte sanft auf die Seite der Vertiefung gegeben, um Ablösung zu vermeiden cells. Zellverlust könnte auch auf den Zelltod von Riechstoff Toxizität, ein Problem, das durch Absenken Odormittelkonzentration oder übermäßige DMSO, die, indem sie DMSO-Konzentrationen unter 0,5% vermieden werden kann umgangen werden, verursacht werden kann. Schließlich Behandlung jeder Rezeptor-exprimierenden Zellpopulation mit 1 &mgr; M Forskolin, einem Aktivator, der Adenylylcyclase Luciferase-Reporter-Expression von der cAMP-responsive Promotor bewirkt, kann als positive Kontrolle für den Assay dienen.

Obwohl die hierin beschriebene Assay stellt eine Verbesserung gegenüber anderen Methoden, einschließlich einer Hochdurchsatz-Format und allgemeiner Anwendbarkeit an die Säugetiergeruchsrezeptorfamilie, hat es Einschränkungen. Zuerst unseren in vitro-Test fehlen viele Komponenten eines in vivo olfaktorischen Systems, einschließlich Geruchsbindungsproteine, einer Schleimhautschicht, die intrazelluläre Moleküle und Schnüffelverhalten. Zweitens stützt sich diese Methode auf einem Luciferase-Reportersystem zu Geruchsrezeptor messenAktivierung im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die alternative Calcium Imaging zu nutzen. Letzte Arbeit legt nahe, dass diese beiden Methoden können zu widersprüchlichen Ergebnissen führen; in der Tat, nur wenige Geruchsrezeptoren reagieren auf einen bestimmten Duftstoff, wenn sie über Kalzium-Imaging aber nicht Luciferase-Assay 41 untersucht. Ob ein Assay-Typ ist relevanter für Studien der menschlichen Geruchswahrnehmung ist unklar, aber beide Methoden können je nach Kontext und Rezeptor-Typ nützlich sein. Drittens, während diese funktionellen Expressionssystem wurde erfolgreich verwendet, um die Mehrheit der geprüften Säugetiergeruchsrezeptoren exprimieren, einige ORs nicht zugänglich Expression unter Verwendung dieses Systems. Wenn zuvor charakterisierter Rezeptoren nicht zu einer Geruchs reagiert, kann es aufgrund des Fehlens von Expression auf der Zelloberfläche und nicht einem Mangel an Wechselwirkung zwischen Duftstoff und Rezeptor. Rezeptor-Zelloberflächenexpression kann über Immunfluoreszenz, bevor Schlussfolgerungen aus negativen Test untersucht werden, ergibt 27,42 38,39 bestimmen die meisten Rezeptoren müssen zuerst mit einem Geruch, um eine Verringerung der Luciferase-Aktivität zu beobachten stimuliert werden.

Trotz dieser Einschränkungen ist dieses Testsystem die Fähigkeit, Datenerfassung im Bereich der Geruchswahrnehmung deutlich erhöhen. Erstens macht die Hochdurchsatz-96-well Format Groß Rezeptor und / oder Geruch Bildschirme möglich. Zweitens ist die heterologe Expressionssystem für eine Vielzahl von Säugetiergeruchsrezeptoren. Drittens kann die Luciferase-Aktivität verwendet werden, um Geruchsrezeptor-Aktivierung, die bei der Beschreibung der wertvollen Rezeptor Aktivierungsmuster für einen bestimmten Duftstoff ist zu messen. Viertens früheren Ergebnissen von ähnlichen in-vitro-Testsystemen vorherzusagen menschlichen Geruchswahrnehmung 8,11,35. Diese Eigenschaften sind insbesonders wichtig, angesichts der Größe des Säugetiergeruchsrezeptor Familie und unsere begrenzten Kenntnisse über die ODER-Aktivierungsmuster durch bestimmte Gerüche ausgelöst. Breite Anwendung dieses Testsystem für olfaktorische Rezeptor-Analyse optimiert werden, um ein umfassenderes Bild von olfaktorischen Rezeptor / Geruchs Interaktion und die molekularen Grundlagen der Duftkodierung bei.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von DC013339 R01, R03 DC011373 und Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014 unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde mit dem Monell Chemosensorische Receptor Signaling Core unterstützt wird, die zum Teil durch Mittel aus dem NIH-NIDCD Kern Zuschuss P30 DC011735. Die Autoren danken C. Sezille für die Hilfe bei der Datenerhebung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hana3A cells Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
RTP1S-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
M3-R-pCI Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request
pCRE-luc Agilent 219076 LUC
pSV40-RL Promega E2231 RL
Minimum Essential Media, Eagle Sigma Aldrich M4655 MEM
FBS Life Technologies 16000-044 FBS
PBS (without Ca2+ and Mg2+) Cellgro 21-040-CV PBS
Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) Life Technologies 25300 Trypsin
CD293 Life Technologies 11913-019 CD293
96-well PDL white/clear plate BD BioCoat 356693 plates
Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019 Lipofectamine
Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay Promega E2980 dual glo
Synergy S2  BioTek SLAD BioTek S2
Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software BioTek Gen5 Gen5
BIOSTACK BioTek BIOSTACK2WR BioStack
Multiflo BioTek MFP MultiFlo
300 μl GripTips Integra 4433 GripTips
12.5 μl GripTips Integra 4414 GripTips
300 μl GripTips ViaFlo96 Integra 6433 XYZ tips
12.5 μl GripTips 384 XYZ Integra 6403 XYZ tips
384ViaFlo Integra 6030 384ViaFlo
TE buffer Macherey Nagel 740797.1
DMSO Sigma Aldrich D2650-100ML DMSO
Forskolin Enzo Life Sciences BML-CN100-0010 FOR

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