تقنيات إعداد متعددة الخطوات لاسترداد فئات متعددة للمجمع المستقلب في العمق والتحليل Metabolomic الإعلامية

Bioengineering
 

Summary

موثوقية النتائج في التجارب الايض تعتمد على فعالية واستنساخ إعداد العينة. ووصف هو أسلوب دقيق ومتعمق التي تمكن من استخراج نواتج الأيض من السوائل البيولوجية مع خيار تحليل في وقت لاحق تصل إلى الآلاف من المركبات، أو مجرد فصول مجمع المصالح.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cruickshank-Quinn, C., Quinn, K. D., Powell, R., Yang, Y., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51670, doi:10.3791/51670 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الايض هو حقل الناشئة والتي تمكن من التنميط عينات من الكائنات الحية من أجل الحصول على نظرة ثاقبة العمليات البيولوجية. وهناك جانب حيوي من الايض هو إعداد العينات حيث تقنيات توليد تتعارض النتائج لا يمكن الاعتماد عليها. هذا الأسلوب يشمل هطول البروتين، واستخراج السائل السائل، والمرحلة الصلبة استخراج كوسيلة لنواتج الأيض بكسر في أربعة فصول متميزة. يتم الحصول على تحسن تخصيب جزيئات فرة منخفضة مع الزيادة الناتجة في الحساسية، ويؤدي في النهاية إلى تحديد أكثر ثقة من الجزيئات. وقد تم تطبيق هذه التقنية لالبلازما، السائل غسل القصبات، وعينات السائل النخاعي مع انخفاض أحجام مثل 50 ميكرولتر. عينات يمكن استخدامها لتطبيقات المصب متعددة؛ على سبيل المثال، بيليه الناجمة عن هطول البروتين يمكن تخزينها لتحليلها لاحقا. طاف من هذه الخطوة يخضع لاستخراج السائل السائل باستخدامالماء والمذيبات العضوية القوية لفصل المركبات ماء ومسعور. مرة واحدة مجزأة، يمكن معالجة طبقة ماء لتحليلها لاحقا أو التخلص منها إن لم يكن الحاجة. وكذلك التعامل مع جزء مسعور مع سلسلة من المذيبات خلال ثلاث مراحل الصلبة الخطوات استخراج لفصلها إلى الأحماض الدهنية والدهون محايدة، والدهون الفوسفاتية. وهذا يسمح للفني المرونة لاختيار أي ويفضل فئة من المركبات للتحليل. كما أنه يساعد في تحديد المستقلب أكثر موثوقية منذ بعض المعارف من الدرجة الكيميائية موجودا.

Introduction

ردود الفعل البيولوجية توليد نواتج كمنتجات نهاية العمليات الخلوية. الايض هو مجموعة من جميع المركبات الموجودة في الكائن الحي نتيجة لهذه العمليات. أنه يوفر صورة للعلم وظائف الأعضاء من الخلايا ويعكس استجابة الكائن الحي للمؤثرات خارجية أو داخلية 1، 2. مثل هذه المحفزات يمكن أن يكون البيئية، السمية، الدوائية والغذائية والهرمونية، أو ذات الصلة لهذا المرض. العديد من التطبيقات metabolomic لها ويجري حاليا دراستها من قبل الباحثين وتشمل العلامات البيولوجية اكتشاف 3، 4 دراسات التغذية والعلوم الغذائية 5، 6 واختبار المخدرات. بغض النظر عن التطبيق، والاختلافات في البيانات، والتلوث، وجود ايجابيات كاذبة تحتاج إلى خفض أو إزالة يفضل. في اكتشاف العلامات البيولوجية أو في حالة تحديد الاختلافات بين السيطرة ومجموعة أمراض، أو التحقيق في آثار المخدرات على الموضوعات، وو البيولوجيةيتم اختيار luid بناء على الأسئلة التي وأنواع الأيض يجري التحقيق 7. على سبيل المثال، إذا دراسة الآثار المباشرة للدواء استنشاق في الرئتين من المصابين بالربو، ثم استكشاف الأيض في السائل غسل القصبات (BALF) عينات قبل وبعد الإدارة سيكون تفضيلية. لضمان أن لاحظ اختلافات بسبب الاختلاف البيولوجي الفعلي بدلا من أسلوب غير لائق إعداد العينات، وبروتوكول المختبر موحدة ومتسقة ضروري 8. يجب توثيق المعلومات العينة بعناية للتأكد من أن المتغيرات مثل السوائل البيولوجية، سلالة الحيوان، والوقت أخذ العينات، وعمر الموضوع، بين الجنسين، على سبيل المثال لا الحصر، تعتبر كل ويؤخذ في الاعتبار في الدراسة 9. بالإضافة إلى ذلك، للحد من إمكانية تلوث أو ايجابيات كاذبة، فمن المستحسن أن الفراغات المذيبات والفراغات أداة يتم تحليلها 10.

لهذا البروتوكول، فإن مصطلح "METABOالصنعية "سوف تستخدم للإشارة إلى مركبات الفعلية التي تم تحديدها. باستخدام البرمجيات بائع، ويستخدم خوارزمية الذروة النتيجة الأولية للكشف عن القمم الطيفية الشامل. تتماشى هذه القمم على أساس الكتلة إلى تهمة (م / ض) ونسبة الاحتفاظ الوقت. ثم يتم استخدام خوارزمية الثاني على الجمع بين ميزات متعددة في مركب واحد. وهذا يشمل ميزات مثل الصوديوم والبوتاسيوم والأمونيوم أو adducts في وضع التأين إيجابية، وكلوريد في وضع الأيونات السالبة. وتشمل الخيارات الإضافية في البرنامج ميزات مثل dimers وadducts الأخرى. باستخدام الجلوكوز على سبيل المثال، مع وجود قمم في 181.0707 م / ض (M + H)، 198،0972 م / ض (M + NH 4)، و203.05261 م / ض (M + نا)، سيكون هناك ثلاث قمم المقابلة لنفس تفاقم باستخدام خوارزمية الأولى. ولكن عندما الخوارزمية الثانية، والتي تقوم على الصيغة الجزيئية، ويتم تطبيق هذه adducts ثلاثة تصبح تجميعها معا مما أدى إلى مجمع واحد.

يمكن أن تؤدي التدخلات الأيضية داخل عصيدةليه نظرا لتعقيد المركبات الحالية. وجود الآلاف من المركبات في إحدى أسباب عينة إشارة قمع ولا سيما من أقل الأيض وفرة. تنظيف العينة لإزالة التداخل والبروتينات، وفصل لاحق إلى كسور متعددة يقلل من تعقيد العينة وبالتالي تحسين فصل الذروة، وزيادة القرار، والحد من المستقلب coelution. وبالتالي، مطلوب تنظيف العينة وتحسين فصل المركبات. وقد تبين أن هطول البروتين وحده، حتى مع استخدام مختلف المذيبات القطبية، لا يمكن حل هذه المسألة 11، 12. ومع ذلك، من خلال الجمع بين المذيبات العضوية القوية مثل MTBE مع خطوة تجزئة اللاحقة، يتم زيادة التغطية الأيض. يانغ وآخرون 12 عن زيادة في التمثيل الغذائي من 1،851 أو 2،073 مع الميثانول أو هطول الميثانول الإيثانول وحدها على التوالي، ل3،806 الأيضية باستخدام الاستخلاص بالمذيبات MTBE مجتمعةتليها المرحلة الصلبة استخراج (SPE) الخطوات. ولوحظ انخفاض التداخل الأيض، وتحسين فصل الذروة وزيادة وفرة المستقلب مع هذا الأسلوب.

التلوث من غير الأيضية، مثل البوليمرات، يمكن أن تنجم عن جمع العينات، والمذيبات، أو ضوضاء الصك، ويمكن أن يؤدي إلى قمع إشارة من نواتج محتملة كبيرة. فمن المستحسن أن فني (ق) والذين جمع العينات قبل أخذ عينات إعداد باستمرار استخدام نفس العلامة التجارية، ونوع وحجم قارورة جمع العينات، نصائح ماصة وأي الأنابيب الأخرى المستخدمة خلال جمع وإعداد العينات. وهذا يسمح للمحلل البيانات لدينا ثقة كاملة أن التغيرات الملحوظة حقيقية وليست بسبب وجود خلافات أساسية من مصادر أخرى. فعالية العلاج، والاختلافات بين مجموعات من الأمراض ومكافحتها، أو أي التحليلات الأيضية الأخرى ويمكن بعد ذلك يتم التحقيق مع زيادة الثقة.

وميثالتطوير التنظيمي مناقشتها هنا يركز على طرق إعداد العينات مجتمعة 13-15 والتي يمكن تطبيقها على البلازما، BALF، أو السائل النخاعي (CSF) عينات لتحديد ملامح metabolomic غير المستهدفة للاللوني الشامل السائل قياس الطيف (LCMS) التحليل القائم. كلا اللوني السائل (LC) وفائقة الأداء اللوني السائل (UPLC) تقنيات الفصل يمكن أن يقترن إلى MS اللاحقة لهذا الإجراء. إجراء دراسات metabolomic العديد من الباحثين استخدام إما بروتين هطول تقنية و / أو تقنية استخراج السائل السائل 16، 17. في دراساتنا، وهذا أدى إلى عدد أقل من مستقلبات أن يتم اكتشافها. الطريقة الموضحة هنا 12 تمكن الكشف والتعرف على عدد أكبر من المركبات، التي تغطي مجموعة واسعة من metabolome. ويرجع ذلك إلى نقاء أعلى من العينات وتقليل الآثار الناجمة عن الانفصال مصفوفة مسبقة من الطبقات المستقلب هذه الزيادة.

على البروتوكول الاضافي الأوليةيتم تنفيذ عين هطول خطوة باستخدام الميثانول الباردة (MeOH) لإزالة البروتين من العينة. يستخدم استخراج السائل السائل (LLE) باستخدام الميثيل ثالثي بوتيل الأثير (MTBE) والماء لفصل المركبات ماء ومسعور. ثم يتم تنفيذ المرحلة استخراج الصلبة (SPE) على طبقة مسعور لفصل المركبات مسعور الى ثلاث فئات - الأحماض الدهنية، الدهون المحايدة، والدهون الفوسفاتية. وأعيد الكسور مسعور في الميثانول بنسبة 100٪، في حين يتم إعادة تشكيل جزء ماء في 5٪ أسيتونتريل في الماء. يوفر استخراج (SPE) الخطوة المرحلة الصلبة كان مستوى أضاف الثقة في النتائج عن طريق الحد من عدد من المركبات coeluting التي من شأنها أن يكون الأمر خلاف ذلك الحاضر خطوة الانفصال لم يتم تنفيذها.

Protocol

1. اعتبارات الأولية، إعداد أدوات ومعايير

  1. دائما استخدام الزجاج لتخزين (أنابيب الثقافة الزجاج، والزجاج قوارير الاوتوماتيكى) أو نقل (الماصات الزجاج) الدهون والمذيبات العضوية.
  2. تقليل التعرض لجميع عينات الدهن ومعايير للهواء. ختم بولي تترافلوروإيثيلين (PFTE) قبعات بإحكام لتجنب التعرض للهواء والتبخر. في resuspend فورا الدهون تجفف في المذيبات المقبل أو الاحتفاظ بها في دفق مستمر من النيتروجين.
  3. استخدام 100 ميكرولتر من العينة. في الحالات التي تكون فيها أكثر (أو أقل) عينة متاحة، وضبط كميات تبعا لذلك. ولكن خلال تجزئة الدهون على العمود SPE NH صرح يجب أن تظل أحجام كما هو مبين.
  4. تشغيل أجهزة الطرد المركزي وتعيين إلى 0 درجة مئوية قبل البدء في إعداد العينة.
  5. يستخدم هذه التقنية العديد من المذيبات المتطايرة حتى تبقي جميع المذيبات توج أثناء إعداد العينة.
  6. إعداد نوعين من المعايير في التوصية.
  7. إعداد سيطرة سلبية تتألف من ارتفعت في المعايير في كل تركيز ثابت. وارتفعت هذه في جميع العينات وكذلك عينة مجمعة الذي يستخدم بمثابة دفعة QC (ارتفعت عينة مجمعة تستخدم لرصد عينة إعداد استنساخ في أيام منفصلة) وأداة مراقبة الجودة (ارتفعت عينات مجمعة معدة مسبقا، aliquoted الفرعية، وتستخدم ل رصد أداة ظروف / تقلبات خلال التحليل وعلى أيام منفصلة).
    1. إعداد الضوابط الإيجابية في 1X، 2X، 4X والمسامير القياسية. تضاف الضوابط الإيجابية لجميع العينات وكذلك عينة البلازما المجمعة وتستخدم في المركبات لمراقبة الجودة لكل من خطوات إعداد العينات وخطوات التحليل الآلي لتحليل وتحديد الاختلافات تغيير أضعاف خلال تحليل البيانات للتأكد من أن جميع جوانب أجريت إعداد وتحليل دور فعال بشكل صحيح.
  8. مخزن المعايير في -20 درجة مئوية وتخزين العينات في -80 درجة مئوية. بعض موقف الداخليةيجب أن يتم تخزين أردز التي هي عرضة للتدهور التالية تخزين على المدى الطويل في -80 درجة مئوية.
  9. يتطلب هذا الإجراء استخدام المذيبات الخطرة، القابلة للاشتعال أو متقلبة مثل MTBE. تنفيذ كافة الخطوات في غطاء الدخان.

2. المعايير الداخلية

  1. اختيار المعايير الداخلية (ISTD) على أساس المشاريع الفردية والتصميم التجريبي الخاصة. لbiofluids مثل البلازما، BALF، أو البول، ISTDs المسمى isotopically التي تشبه في طبيعتها لتلك التي وجدت في هذه العينات البيولوجية سيكون امرا مثاليا. وتشمل هذه ولكنها لا تقتصر على الأحماض الأمينية، والهرمونات أو الدهون. للعينات النباتية metabolomic، يمكن أن تستخدم المعايير وصفت مثل الفلافونويد، أو الكاروتينات. الأمر نفسه ينطبق على غيرها من حيث الدراسات metabolomic المحقق أن تختار معيار الداخلي الذي هو ممثل نوع العينة التي يجري تحليلها.
  2. تأكد من أن ISTD اختار تغطي مجموعة واسعة من اللوني؛ على سبيل المثال إذا رانه اكتساب الوقت هو 20 دقيقة، يمكن أن تستخدم المعايير التي أزل كل 5 دقائق.
  3. إيجاد حلول الاسهم ماء في 2 ملغ / مل باستخدام مجموعة متنوعة من المعايير المسمى isotopically و / أو مركبات القطبية الأخرى التي هي دخيلة على عينة يتم تحليلها. من كل محلول المخزون، وخلق حل واحد في 01:01 الميثانول: المياه مع جميع المعايير لتركيز النهائي من 25 ميكروغرام / مل الكرياتينين 3-D، و 100 ميكروغرام / مل يسين-D و 200 ميكروغرام / مل حمض أميني أساسي-D 8 .
  4. إيجاد حلول الأسهم مسعور باستخدام مجموعة متنوعة من المعايير المسمى isotopically و / أو المركبات غير القطبية الأخرى التي هي دخيلة على عينة يتم تحليلها؛ تركيزات المخزون من 17:00 الأحماض الدهنية (4 ملغ / مل)، 19:01 الأحماض الدهنية (4 ملغ / مل)، 17:00 سيراميد (2 ملغ / مل)، 17:00 PE (1.75 ملغ / مل)، 15 : 0 PC (2 ملغ / مل)، والتستوستيرون-D 2 (1 ملغ / مل). من كل الأوراق المالية، وخلق حل واحد في 01:01 الكلوروفورم: الميثانول مع جميع المعايير لتركيز النهائي من 50ميكروغرام / مل 17:00 سيراميد، و 100 ميكروغرام / مل 15:00 PC، و 100 ميكروغرام / مل التستوستيرون 2-D، و 200 ميكروغرام / مل 17:00 الأحماض الدهنية، و 200 ميكروغرام / مل 19:01 الأحماض الدهنية، و 200 ميكروغرام / مل 17:00 PE في مزيج القياسية.
  5. اختبار درجة تأين لكل معيار في وقت مبكر باستخدام خمسة على الأقل تركيزات مختلفة لكل معيار لتحديد الحد من الكشف والخطي من الصك لهذه المركبات. فإن تركيز محلول المخزون لكل معيار على حدة تختلف اعتمادا على التصميم التجريبي، وتركيز كل معيار في مستوى ارتفعت مجتمعة قد تتراوح بين 20 ميكروغرام / مل إلى 2 ملغ / مل يتوقف على مدى نجاحها في تأيين.
  6. خلق مزيج من ارتفاع الضوابط الإيجابية وإضافتها إلى عينات في 1X، 2X، 4X أو مستويات التركيز لمراقبة كميا قوة إعداد العينات ودقة البيانات مفيدة. تركيز النهائي من الضوابط الإيجابية يمكنتكون: 2 ملغ / مل مد الجلوكوز، و 100 ميكروغرام / مل ألانين D-3، 200 ميكروغرام / مل حمض الميثيل-D 20 ميكروغرام / مل الدهون الثلاثية الأبعاد و / أو المعايير مسعور وماء غيرها. ضبط تركيزات قياسي على أساس حساسية MS HPLC والأجهزة المستخدمة في التحليل.

3. الهطول البروتين

  1. عينات ذوبان الجليد إلى ارتفاع RT و10 ميكرولتر من كل عينة إلى ISTD كما هو موضح أدناه.
  2. ارتفاع 10 ميكرولتر من كل من الحلول القياسية ماء ومسعور (تم إنشاؤه من الأسهم في الخطوات 2.3 و 2.4) لكل عينة. ضبط تركيزات القياسية عند الضرورة بناء على حساسية MS HPLC والأجهزة المستخدمة في تحليل
    1. ارتفاع 10 ميكرولتر من إما 1X، 2X، 4X أو حل السيطرة الايجابية (التي تم إنشاؤها من الأسهم في الخطوة 2.6) لكل عينة. ضبط تركيزات القياسية عند الضرورة بناء على حساسية MS وHPالأجهزة المستخدمة في تحليل LC
    2. دوامة كل عينة لمدة 10 ثانية قبل هطول البروتين خطوة
  3. إضافة 400 ميكرولتر من الميثانول الجليد الباردة (المخزنة في -20 درجة مئوية) لكل عينة.
  4. دوامة لمدة 10 ثانية لكل أنبوب.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 18،000 ز س.
  6. نقل جميع طاف لثقافة جديدة أنبوب زجاجي، ثم الجافة تحت رقم 2.
  7. إذا تحليل جزء من البروتين بيليه، والمضي قدما إلى الخطوات 3،8-3،11. إن لم يكن بيليه تحليل البروتين، انتقل إلى القسم 4.
    ملاحظة: قد تحتوي على مركبات البروتين بيليه مع للا مائية عالية التي من شأنها أن تكون مفيدة عند تنفيذ الدراسات المخدرات 18 والغذاء تحليلات تنطوي على مركبات الفلافونويد مسعور 19 أو دراسات تتعلق metabolomic الأمراض حيث تتراكم مركبات مسعور جدا، مثل الخلايا العصبية سيرويد-20 lipofuscinoses وتخزين الدهون الليزوزومية الأمراض 21.
  8. إضافة 1 مل من MTBE لرانه الأبيض (أو شبه بيضاء) بيليه البروتين، ودوامة لمدة 30 ثانية لكل أنبوب، ثم الطرد المركزي عند 0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 18،000 ز س. صب طبقة جديدة MTBE إلى أنبوب الثقافة الزجاج.
    هذا هو خطوة حاسمة على أنها أخطاء هنا وسوف تؤثر بشكل كبير النتائج (انظر الشكل 5 في نتائج ممثل).
    1. نضح باستمرار على نفس القدر من MTBE لجميع العينات منذ حجم بيليه سوف تختلف بين العينات. وبالتالي، إذا كان من الممكن يصب فقط 900 ميكرولتر لعينة مع أقل قدر من طاف، ثم صب 900 ميكرولتر لجميع العينات.
  9. كرر الخطوة 3.9، والجمع بين طبقة العضوية على الزجاج نفس الثقافة أنبوب أعدت في الخطوة 3.7.
  10. العينات الجافة التي كتبها N 2 تدفق وresuspend في 200 ميكرولتر 1:1 الكلوروفورم: الميثانول. دوامة لفترة وجيزة.
  11. نقل إلى أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في XG 18،000، ثم نقل إلى طاف الاوتوماتيكى قارورة كأب المسمار استخدام الزجاجالماصات.

4. استخراج السائل السائل

  1. باستخدام ماصة الزجاج، وإضافة 3 مل MTBE إلى الميثانول المجففة المتبقية (من الباب 3، الخطوة 6)، دوامة 30 ثانية، إضافة 750 ميكرولتر من الماء، ثم دوامة 10 ثانية في الأنبوب.
  2. تدور ~ 200 x ج لمدة 10 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي في RT.
  3. نضح 2.5 مل من طبقة MTBE (من دون الحصول على الماء) ونقل إلى أنبوب زجاجي نظيف الثقافة.
    ملاحظة: هذا هو خطوة حاسمة عن الاختلافات هنا سوف تؤثر على النتائج. 2.5 مل من MTBE ينبغي أن يصب بعناية من الطبقة العليا لأنه يسمح حجم ثابت أن يصب دون pipetting لطبقة المائية أدناه. إذا كان حجم العينة في بداية التجربة أقل من 100 ميكرولتر المشار إليه لهذا الأسلوب، قياس حجم MTBE لتعكس بشكل متناسب هذا حجم العينة البداية.
  4. إضافة 3 مل MTBE إلى الجزء المتبقي من العينة المياه، ودوامة 10 ثانية لكل أنبوب.
  5. تدور 200 ~x ج لمدة 10 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي في RT.
  6. نضح 3 مل من MTBE (من دون الحصول على الماء) وتتحد مع أنبوب MTBE.
  7. تركيز الطبقة المائية المتبقية من خلال تجفيف تحت رقم 2.
  8. إعادة تعليق رواسب في 100 ميكرولتر من الماء.
  9. إضافة 400 ميكرولتر من MeOH الباردة الجليد على الزجاج أنبوب الثقافة، ودوامة لفترة وجيزة، ثم نقل إلى أنبوب microcentrifuge.
  10. ترك في -80 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. تدور في 0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 18،000 ز س.
    ملاحظة: من المستحسن أن تضع العينة بأكملها رف في الفريزر -80 درجة مئوية وهذا سوف يسمح أي بروتين المتبقية لتترسب في الميثانول. إذا كان الفريزر -80 درجة مئوية ليست متاحة، والخيارات الأخرى هي: تخزين في -20 درجة مئوية، ووضع العينات في الثلج الجاف، أو الاحتفاظ بها في دلو الجليد. من المهم لتخزين العينات باستمرار في بيئة باردة وعند نفس درجة الحرارة للسماح هطول الأمطار.
  11. نضح 450 ميكرولتر من طاف ونقل إلىأنبوب microcentrifuge نظيفة. يجف تماما في فراغ المكثف الطرد المركزي في ما لا يزيد عن 45 درجة مئوية. (يأخذ حوالي 1-2 ساعة).
  12. في resuspend طاف المجففة في 200 ميكرولتر من 5٪ الأسيتونيتريل / المياه. دوامة لفترة وجيزة. تجميد في -80 درجة مئوية.

5. المرحلة الصلبة استخراج

  1. تجفيف جزء MTBE تحت النيتروجين في 35 درجة مئوية مع تدفق جيد من النيتروجين (يستغرق حوالي 10-15 دقيقة).
  2. عندما تجف تماما، ووقف تدفق النيتروجين وبسرعة resuspend في 1 مل كلوروفورم (CHCL 3) باستخدام ماصة الزجاج. دوامة لفترة وجيزة.
    ملاحظة: المذيبات مثل CHCL 3 ديهم انخفاض اللزوجة. خلال pipetting ل، وانخفاض التوتر السطحي يسبب فقدان المذيبات من ماصة. فمن المستحسن أن يكون غيض ماصة prewet مرتين على الأقل للسماح موازنة بين المذيب يجري pipetted والمساحة في ماصة. ويمكن أيضا حقنة الغاز محكم استخدامها إذا كانت متوفرة.
  3. انشاء فراغ مشعب SPE وNH 2
  4. عينات الحار RT ودائما تبقي معلقة في ظل تدفق مستمر من N 2. وارتفاع درجة حرارة لRT تسمح إعادة تعليق الدهون وسوف النيتروجين منع أكسدة والبلمرة من الدهون.
  5. غسل وحالة SPE 2X خرطوشة مع 400 ميكرولتر الهكسان. تجاهل النفايات وتستبدل بأخرى جديدة أنبوب جمع الزجاج.
  6. إضافة العينة إلى العمود SPE، وجمع تتدفق من خلال أنابيب في الزجاج.
  7. مع الزجاج ماصة إضافة 1 مل 2:1 CHCL 3: IPA، وجمع تتدفق من خلال أنابيب زجاجية في نفس (وهذا هو جزء المحايدة).
  8. تجفيف جزء محايدة تحت رقم 2 لتقليل الأكسدة (يستغرق حوالي 10-15 دقيقة).
  9. مع الزجاج ماصة إضافة 1 مل من حمض الخليك 5٪ في ايثر، وجمع تتدفق من خلال أنابيب زجاجية جديدة في (وهذا هو جزء الأحماض الدهنية).
  10. تجفيف جزء الأحماض الدهنية تحت رقم 2 لتقليل الأكسدة (يستغرق حوالي 10-15 دقيقة).
  11. نصائح استخدام البلاستيك لإضافة 800 و# 181؛ لتر من الميثانول إلى خرطوشة SPE، وجمع من خلال تدفق في 15 مل من البلاستيك أنابيب مخروطية (وهذا هو جزء الفوسفوليبيدية).
  12. نقل جزء فوسفورية إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي. تجفيف العينات مع فراغ المكثف الطرد المركزي عند 45 ° C (يستغرق حوالي 1-1.5 ساعة).
  13. في resuspend كل من العينات من ثلاثة كسور في 200 ميكرولتر من 100٪ والميثانول، ودوامة، ونقل إلى الاوتوماتيكى قارورة المسمار الحد الأقصى للتخزين.

6. عينة شروط التخزين

  1. تخزين جميع العينات في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للتحليل الصك.
    ملاحظة: عينات المستخلصة، أعادت في المذيبات العضوية يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية. ولكن هذا غير مستحسن كما الأيض محتمل في المصالح سوف تتحلل في درجة الحرارة هذه. كما لا ينصح تخزين النتروجين السائل كما ذكرت للمحققين قضايا التلوث، وهناك حاجة إلى قارورة تخزين خاصة، وهناك عدم تجانس في غرفة كاوالغناء التقلبات في درجات الحرارة واسعة.
  2. إذا أحجام عينة صغيرة (<100 ميكرولتر)، استخدم إدراج في قارورة لمنع تبخر المذيبات في فراغ الرأس أثناء التخزين.
  3. تجنب تجميد أذاب من العينات. ذوبان الجليد العينات مرة واحدة فقط، والحق قبل تحليل الصك. تكرار تجميد يذوب يؤدي إلى تدهور العينة.

7. اللوني السائل الشروط

  1. استخدام C-18 2.1 ملم × 50 ملم (1.8 ميكرومتر) عمود التحليلية مع C-18 2.1 ملم × 12.5 ملم (5 ميكرون) العمود حارس لتحليل جزء مسعور.
  2. ضبط درجة الحرارة إلى 4 الاوتوماتيكى   درجة مئوية، ودرجة حرارة العمود إلى 60   درجة مئوية، وحجم الحقن إلى 2 ميكرولتر ومعدل التدفق إلى 0.25 مل / دقيقة.
  3. استخدام حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الماء لمدة الطور المتحرك A، وحمض الفورميك بنسبة 0.1٪ في الأيزوبروبانول: الأسيتونيتريل: المياه (60:36:4) للمرحلة المتنقلة B.
  4. تشغيل الملف الشخصى شطف التدرج التالية: بدء تشغيلر 30٪ B، والزيادة إلى 70٪ B 0-1 دقيقة، ثم تزيد إلى 100٪ B 1-15 دقيقة وعقد لمدة 5 دقائق، تليها 5 دقائق 10٪ B الغسيل وآخر 5 دقائق المدى.
  5. استخدام HILIC 2.1 ملم × 50 ملم (2.6 ميكرومتر) عمود التحليلية مع عمود حارس لتحليل جزء ماء.
  6. ضبط درجة الحرارة إلى 4 الاوتوماتيكى   درجة مئوية، ودرجة حرارة العمود إلى 20   درجة مئوية، وحجم الحقن إلى 2 ميكرولتر ومعدل التدفق إلى 0.5 مل / دقيقة.
  7. استخدام 50٪ في أسيتونتريل خلات الأمونيوم 10 ملم، ودرجة الحموضة 5.8 للمرحلة الأجهزة المحمولة، و 90٪ في أسيتونتريل 10 ملي خلات الأمونيوم درجة الحموضة 5.8 للمرحلة المحمول B.
  8. تشغيل التدرج الشخصي شطف التالية: ابدأ في 100٪ B 0-2 دقيقة، ثم تنخفض إلى 50٪ B 2-15 دقيقة، تليها 5 دقائق 0٪ B الغسيل و 10 دقيقة آخر المدى.

Representative Results

تم إجراء كامل تقنية إعداد العينات كما هو موضح أعلاه ويتم عرض أهم الجوانب و / أو ذات الصلة أدناه. وقد ارتفعت المعايير الداخلية ماء ومسعور في عينات البلازما المجمعة لأداء مقارنات مباشرة من المعايير الداخلية وفرة الأيض الذاتية باستخدام أساليب الاستخراج المختلفة. تم تحليل السائل اللوني الطيف الكتلي (LC-MS) البيانات باستخدام البرامج النوعية والكمية، وأسفرت عن استعادة ممتازة وفصل كل من المركبات والمعايير الذاتية الداخلية. الشكل 1 يوضح فعالية من الأسلوب MTBE-SPE في استخراج كل من المعايير الدهون (A) والمركبات الذاتية (B).

عموما، تم الحصول على أفضل استخراج وتغطية الأيض مقارنة مع أساليب أخرى مثل استخراج الميثانول، أو "MTBE فقط" عندما استخراج عدد سومقارنة الميزات و باستخدام برنامج نوعي وكمي التالية تحليل LC-MS. على سبيل المثال، وذلك باستخدام فقط استخراج الميثانول، وكان الاختلاف عن الكرياتينين 3-D 15.2٪. ومع ذلك، مع MTBE LLE، تم تخفيض هذا إلى 1.04٪ السيرة الذاتية. استخدام MTBE، كانت استنساخ الدهون والمركبات المائية <8٪ و<5٪ على التوالي، مقارنة استخراج الميثانول أبسط مما أدى إلى تباين أكبر من 29٪ و 15٪ على التوالي عن الدهون والمركبات المائية. المعايير الداخلية المستخدمة لرصد المبالغ المستردة الدهون - التستوستيرون 2-D، C17 سيراميد، 15:00 PC، و17:00 PE بنسبة 26٪، 200٪، 100٪، 400٪ على التوالي مقارنة باستخدام الميثانول وحدها. تم الكشف عن زيادات مماثلة للمعايير الداخلية الأحماض الدهنية وphosphotidylcholine ونواتج الأيض الذاتية phosphotidylethanolamine. الأيض الذاتية الأخرى مثل sphingosines، سيراميد، diacylglycerols، زعت عشوائيا إلى ثلاثة، والكولسترول، وسفينغوميالين إما لم يتم الكشف عناستخدام الميثانول أو تم الكشف على مستويات ضئيلة. ولكن هذه الدهون الذاتية تم الكشف بسهولة باستخدام استخراج MTBE.

في تحليلنا مقارنة البروتوكولات القياسية، تم الحصول على النتائج التالية: أدى هطول الميثانول وحدها في 1،851 الأيض، أعطى الميثانول الإيثانول هطول 2،073 الأيض، MTBE مع استخراج السائل السائل أعطى 3،125، ومثيل ثالثي بوتيل الإيثر مع السائل السائلة والصلبة مرحلة الاستخراج استردادها 3،806 الأيض. وبالتالي هذا النهج نتائج في عدد أكبر من المركبات استخراج، على الأرجح بسبب انخفاض قمع ايون وعينات النظيف قبل LC-MS.

يوضح الشكل (2) والكفاءة في فصل نواتج مسعور في فصولهم الدراسية الكيميائية المعنية لتحديد المستقلب أكثر ثقة. هناك الحد الأدنى من التداخل من المركبات التي تم تحديدها في كسور الدهون الثلاثة التالية SPE. في الدعم، ويبين الشكل 3انتعاش المعايير الداخلية مما يدل على أن ومزال في ISTD في جزء المتعلقة بالطبقة الكيميائية.

وتستخدم عينات مراقبة الجودة لتقييم جودة إعداد العينات، لتحديد أي آثار دفعة عندما يتطلب الأمر عدة أيام من تحليل لمجموعة عينة كبيرة، ورصد استنساخ الصك. ويتم فحص الاستشرابية للتأكد من أن المعايير ارتفعت في أكبر من 90٪ تعافى مع الخطأ كتلة أقل من ± 3 جزء في المليون والاحتفاظ نافذة الوقت أقل من ± 5٪. إذا لم يتم استيفاء هذه المعايير، يتم تجاهل النتائج وأعادوا تحليل العينات. في قضية الآثار دفعة حيث لوحظ تحول في الاحتفاظ لدفعة واحدة، يمكن للبرنامج تحليل البيانات تصحيح لهذا. خضع دفعة أعدت مسبقا من عينات البلازما المجمعة إعداد العينات. تم الكسور ثم aliquoted الفرعية في قارورة الاوتوماتيكى وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في رصد كوندي الصكستعقد على مدار كل تحليل العينة. ويبين الجدول 1 النتائج من هذه المعايير في ارتفاع. لم تستخدم الأحماض الدهنية وضع التأين السلبي الكسر (لا تظهر البيانات في الجدول) للتحليل لأن CV٪ من المعايير في ارتفاع للعينة QC كان أكبر من 10٪. وبالتالي تم تجاهل ورقة العمل لهذا الكسر والصك تفتيشها والمحافظة عليها. ويبين الجدول 2 نتائج من نواتج الأيض الذاتية في العينات بعد ثلاثة أيام مختلفة من إعداد العينات والحقن صك ثلاث نسخ. الأيضات الذاتية في إعداد العينات QC العينة كلها قابلة للتكرار، مما يدل على قوة إعداد العينات وكذلك أداة حقن التكاثر.

عندما لم يتم اتباع الخطوات تحضير العينة بشكل صحيح، ومع ذلك، يتم الحصول على نتائج غير موثوق بها وغير متناسقة. ويبين الشكل 4 نتائج عند هطول الأمطار خطوة البروتين من طريقةلم يتبع على النحو المبين. ثلاث شركات، A، B، C وتنفيذ نفس الإجراء إعداد العينات على عينات البلازما المجمعة. مشغل A، بدلا من pipetting لالمبلغ المطلوب من طاف في بروتوكول التجريبية، بدلا pipetted> 1 مل لكل من يغسل مع بعض من بيليه. هذا أدى ليس فقط في عدد أكبر من ايجابيات كاذبة لهذا الكسر، ولكن زيادة تباين البيانات.

يمكن أن ينظر إلى استنساخ الكروماتوغرافي من البيانات في الشكل 7. تم إعداد عينات البلازما المجمعة في ثلاث نسخ في أيام منفصلة باستخدام هطول البروتين، واستخراج السائل السائل، واستخراج المرحلة الصلبة كما هو موضح في هذا البروتوكول. تم تحليل كل جزء باستخدام الفصل الكروماتوغرافي هو موضح في القسم 7 من البروتوكول. ثم تم حقن عينات من ثلاث نسخ على LC-MS لتقييم الصك وعينة إعداد التكاثر. يوضح هذا التداخل يتفق كل من سترينجعشر للاستنساخ من إعداد العينات عندما أعدت على ثلاثة أيام مختلفة، فضلا عن قوة الأسلوب الكروماتوغرافي في تحقيق نتائج قابلة للتكرار. لوحظ زيادة في الضوضاء الكيميائية لوضع التأين السلبي للجزء الأحماض الدهنية. قد يحدث هذا بسبب الملوثات في المذيبات LC-MS ويمكن أن يؤدي إلى نتائج metabolomic الكمية غير متناسقة. لذا تم تحليل فقط الأيض الذي مزال قبل 9 دقيقة.

عند تشغيل worklists طويلة، يمكن أن يحدث فقدان حساسية الجهاز وتغير في تركيزات عازلة مع مرور الوقت مما أدى إلى انخفاض كثافة إشارة وتحول الوقت الاحتفاظ. إذا كان الاختلاف تداخل الوقت الاحتفاظ أقل من 5٪ وتباين كثافة إشارة أقل من 10٪، والبيانات لا تزال ضمن حدود المختبر القياسية. ويمكن استخدام برامج التحليل لمواءمة وتطبيع البيانات لتصحيح الصك والانجراف الوقت الاحتفاظ. ومع ذلك، إذا كان الاختلاف هو لارجنرال الكتريك، ثم السبب لابد من تحديدها. مرة واحدة يتم تصحيح هذا، والعينات ويمكن إعادة تحليلها.

الشكل 1
الشكل 1. وفرة من الدهون ISTDs (A) ونواتج الأيض الذاتية (B) بعد استخراج وعكس المرحلة اللوني (RPC) 12. تم إجراء استخراج وتم فصل العينات الناتجة باستخدام RPC وتحليلها باستخدام LC-MS في وضع التأين الإيجابية والسلبية. تم تعديل هذا الرقم من يانغ وآخرون، مجلة اللوني و1300، 217-226 (2013).

الرقم 2

الشكل 2. مقارنة بين MTBE-SPE الكسور 12. الأيضات المحددة في كل الابوتمت مقارنة عمل لتحديد مقدار التداخل أثناء الجزء SPE من الإعدادية. تعكس الأرقام في الرسم البياني فين عدد من المركبات المكتشفة في كل جزء. ويلاحظ هنا تداخل طفيفة بين ثلاثة كسور، وهو ما يمثل نجاحا استخراج مركب والمستقلب الطبقة الانفصال خلال خطوة SPE. تم تعديل هذا الرقم من يانغ وآخرون، مجلة اللوني و1300، 217-226 (2013).

الرقم 3
الرقم 3. انتعاش ISTDs في الكسور باستخدام طريقة MTBE-SPE 12. تم إجراء استخراج وتم فصل العينات الناتجة باستخدام RPC وتحليلها باستخدام يمكننا تعريف في الوضع الإيجابية والسلبية كما هو موضح في النص. تم تعديل هذا الرقم من يانغ وآخرون، مجلة اللوني و1300، 217-226 (2013). </ ع>

الرقم 4
الشكل 4. النتائج من الكسر بيليه من قبل ثلاث شركات مستعدة. ثلاثة عينة إعداد مشغلي A، B، C وتنفيذ نفس الخطوة إعداد البروتين على عينات البلازما المجمعة. تعكس الأرقام في الرسم البياني فين عدد من مستقلبات الكشف عن كل عامل. مشغلي B و C pipetted حجم المطلوبة لكل بروتوكول إعداد العينات بينما المشغل A pipetted طاف كامل وبعض من بيليه، مما أدى في أكثر من 500 أكثر الأيض، غالبيتهم من ايجابيات كاذبة عن أن نسبة محددة.

الرقم 5
الرقم 5. تشكيل البروتين البروتين بيليه خلال هطول خطوة <. / STRONG> (A) 100 ميكرولتر من البلازما البشرية قبل إعداد عينة، (B) البلازما بعد إضافة الميثانول الجليد الباردة، (ج) البروتين بيليه شكلت على الجزء السفلي من الأنبوب بعد الطرد المركزي في 0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في العاشر 18،000 ز.

الرقم 6
الرقم 6. فصل الطبقات المائية وغير المائية أثناء استخراج السائل السائل (LLE) خطوة. تم استخدام المذيبات العضوية الميثيل الأثير ثالثي بوتيل (MTBE) والماء لفصل نواتج ماء ومسعور. طبقة MTBE قد حلت المركبات غير القطبية وطبقة المياه قد حلت المركبات القطبية (A) طاف البلازما بعد ازالة البروتين؛ (B) البلازما بعد التجفيف تحت النيتروجين، (ج) في البلازما بعد إضافة MTBE؛ أونج> (D) إضافة الماء إلى البلازما ومثيل ثالثي بوتيل الإيثر، (E) طبقة المياه MTBE التي تشكلت بعد الطرد المركزي، (F) إزالة الطبقة العليا MTBE؛ (G) أساسا طبقة ماء المتبقية بعد إزالة MTBE.

الرقم 7
تم حقن الرقم 7. الاستشرابية الكسور من مجموعة بيانات محددة تم تنفيذها. إعداد نموذج على ثلاث عينات مراقبة الجودة البلازما المجمعة منفصلة وكل عينة في ثلاث نسخ على الصك LC-MS. مثلت هي مجموع المخططات الاستشرابية أيون من العينات البلازما المكتسبة باستخدام المعلمات LC-MS مبين في المادة 7 من بروتوكول الأسلوب. فإن التمثيل الكروماتوغرافي للسوائل بيولوجية أخرى تختلف بسبب الاختلافات في تكوين الأيض.ك "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

جزء الوضع التأين ستاندرد الداخلية ن متوسط ​​الذروة المنطقة منطقة ذروة٪ السيرة الذاتية
مائي إيجابي الكرياتينين 3-D 31 2217311 3.8٪
الدهون محايدة إيجابي الدهون الثلاثية الأبعاد 5 31 4837032 9.9٪
C17 سيراميد 31 12736707 7.9٪
فوسفورية إيجابي 15:00 PC 32 1248929 9.3٪
17:00 PE 32 517234 7.9٪

نتائج الجدول 1. مراقبة الجودة من المعايير الداخلية ارتفعت. وقد تم تحليل العينات المجمعة البلازما من مجموعة البيانات انتفاخ الرئة نموذج الفأر لمراقبة ظروف الصك على أساس يومي لهذه الدراسة لعدة أسابيع. تم استخدام برنامج التحليل الكمي لتحديد مناطق ذروة المعايير الداخلية، (ن = عدد أداة الحقن QC).

جزء الوضع التأين الأيض الذاتية متوسط ​​الذروة المنطقة منطقة ذروة٪ السيرة الذاتية
مائي إيجابي الكرياتينين 2554574 2.3٪
فالين 3712151 3.3٪
جلوكوز 2669190 6.9٪
الدهون محايدة إيجابي 3 Dehydrosphinganine 226644 3.9٪
11301 8.2٪
DG (P-14: 0/18: 1) 364119 1.9٪
فوسفورية إيجابي PC (24:0 / 0:0) 27599 0.9٪
PC16: 0/22: 6) 2873326 4.5٪
PI (16:00 / 18:01) 112998 4.4٪
حامض دهني إيجابي 10-5-أوكسو حمض ،8-decadienoic 1363284 2.3٪
16 أوكسو heptadecanoic حمض 83700
2 ميثيل حمض بنتانويك 285782 5.7٪
حامض دهني سلبي حمض هيدروكسي 10-8-octadecenoic 10042 4.9٪
(R) laballenic حمض 173929 6.5٪
2-كيتوني حمض بنتانويك 35488 6.0٪

نتائج الجدول 2. مراقبة الجودة من نواتج الأيض الذاتية. تم تحليل عينات البلازما المجمعة من مجموعة بيانات المرض الإنسان لرصد عينة إعداد استنساخ في أيام منفصلة. تم إعداد العينات في ثلاث نسخ على مدى ثلاثة أيام، (ن = 9 الإعدادية الحقن QC).

Discussion

هدف واحد من الدراسات السريرية metabolomic هو تحديد التغيرات في metabolome المتعلقة المرض أو العلاج. لذا تقنيات تحضير العينات تحتاج إلى أن تكون قوية ومتسقة وقابلة للتحويل من فني لفني ومختبر من المختبرات إلى 22. يحتاج البيانات الناتجة لتكون ممثلة للعينة، والتغييرات التي تم تحديدها يجب أن تعكس العينة تعيين بدلا من أخطاء إعداد العينات. لذا pipetting لدقيقة، درجة الحرارة الصحيحة، الصب كفاءة طبقات إمتزاج، والتجفيف تحت النيتروجين، واستخدام نفس العلامات التجارية وأحجام مختلفة من الأواني الزجاجية ونصائح ضرورية.

خلال البروتين هطول الخطوة، فمن الأهمية بمكان أن نفس القدر من الحل هو يصب كل من بيليه. هذا يقلل من التباين في الحجم وعلى هذا النحو يقلل من التباين في بيانات العينة. هذه الخطوة هطول البروتين ضروري لدراسات metabolomic ولا يمكن تخطي لأنه يزيل البروتين منالعينات قبل جزيء صغير التنميط التحليل على مطياف الكتلة. أنه يزيل مسببات الأمراض والجزيئات الكبيرة، والنشرات ملزمة الأيض من البروتينات 7. عدم وجود تراكم البروتين في عينات يوسع العمود عمر HPLC ويزيد من دقة وجودة النتائج. الرقم 5 هو تصوير بيليه البروتين شكلت عند تنفيذ هذه التقنية على عينات البلازما. وهذا يسمح للكشف عن جزيئات صغيرة، ويعزز فرة أيون، ويقلل من الآثار مصفوفة من البروتينات في العينة. بالإضافة إلى ذلك، منذ يفترض أن تتم إزالة جميع البروتينات في هذه الخطوة، فإن الأحماض الأمينية التي يتم الكشف عنها خلال تحليل LC-MS تنبع من التغيرات الأيضية بدلا من انهيار البروتين.

الخطوة استخراج السائل السائل أمر بالغ الأهمية لأنه يفصل بين نواتج ماء ومسعور إلى طبقتين إمتزاج. الشكل 6 يبين الإجراء LLE ومندوبresentation طبقة LLE. على فصل غير لائق من طبقتين النتائج في الأيض إما الضياع أو يجري مزال في كل من الكسور. التطبيق الدقيق لهذه الخطوة يقلل من عدد من المركبات المائية التي تظهر في جزء مسعور. نتائج هذه المركبات أصبحت لا يمكن الاعتماد عليها لأنه لا يمكن تحديد جزء الذي يحتوي على نتائج ممثلة. عند القيام به بشكل صحيح، هو انخفاض الأيض التداخل.

لمنع تدهور التأكسدي، وخاصة في الدهون ولكن أيضا في الجزيئات الصغيرة التي قد تحتوي على مجموعات ثيول على سبيل المثال، والتعرض للأكسجين يجب أن تبقى إلى أدنى حد ممكن. لذلك، يتم تنفيذ هذا الإجراء دائما تحت النيتروجين للحد من / منع أكسدة الدهون أو التي تحتوي على مركبات ثيول. بالإضافة إلى ذلك، نقل عينة و / أو حل سريع (في غضون الدقيقة الاولى) للحد من التعرض الأكسجين، ثم توضع العينات بسرعة تحت دفق مستمر من النيتروجين لتجف أسفل. مرة واحدة المجففة، فهي immediمعلق ately في الميثانول بنسبة 100٪ للأسباب التي ذكرناها آنفا.

يمكن الاستفادة من مختبرات هذه الطريقة شاملة في عدد من الطرق؛ يمكن للباحثين تبحث لعزل فئة واحدة من المركبات اختيار جزء من الطريقة التي تناسب احتياجاتهم. أولئك الذين يسعون لأداء سوى هطول البروتين للحصول على مجموعة من نواتج الأيض قد تفعل ذلك. إذا كنت تريد ماء الأيض، مثل العديد من العقاقير الصيدلانية، والأحماض الأمينية، والسكريات، أو إذا كنت تريد فقط الأيض مسعور، مثل الدهون الثلاثية، الكحول، الفيتامينات القابلة للذوبان الدهون، والدهون الفوسفاتية وعلى سبيل المثال، ثم يمكن للباحثين إجراء استخراج السائل السائل الخطوة التالية البروتين هطول الأمطار وتجاهل جزء غير مرغوب فيها. المحققين الذين يحتاجون إلى مزيد من التصنيف الفرعي للمركبات مسعور (الدهون محايدة، والأحماض الدهنية، والدهون الفوسفاتية) قد انتقل إلى الخطوة تجزئة.

اعتبارات هامة في التخزين maintainiنانوغرام صلاحية عينات لتحليلها لاحقا. إذا تم تخزين العينات بشكل غير صحيح، يمكن أن يحدث تدهور أو التحلل. من الناحية المثالية، يجب أن يتم تخزين العينات في سقف المسمار قارورة العنبر بعيدا عن الضوء لمنع تدهور الأنواع الحساسة للضوء. وينبغي أيضا أن تبقى العينات المجمدة في -80 درجة مئوية لمنع تدهور الأيض 23-25. على الرغم من عدم مناقشته في التفاصيل هنا، وتحفظ العينات دائما في 4 درجات مئوية في علبة الاوتوماتيكى خلال تحليل LC-MS. هذا يضمن أن جميع العينات وتحفظ في درجة حرارة ثابتة وأن التغيرات في درجة الحرارة المحيطة لا تؤثر على اللزوجة، والذوبان، أو الاستقرار في العينات. فمن المستحسن أن الجوانب دليل من هذا الإجراء، مثل LLE وSPE، أن تمارس من أجل كسب الثقة والراحة مع الخطوات المتبعة.

وجود عدد قليل من القيود لهذه التقنية. ليست مضمونة فصل سرية من نواتج الأيض مسعور وماء كما سيتم بعض المركبات inherتقسيم مستديم في كل من الكسور بسبب التركيب الكيميائي ورسوم دولتهم. بالإضافة كما هو مبين في الشكل (4)، وتقنية غير لائق أثناء الخطوة استخراج البروتين بيليه يمكن أن يؤدي ذلك إلى ضعف التكاثر الأيض في كل من العينات ومراقبة الجودة. هذا يؤثر على الإحصاءات، وخصوصا في مجموعات البيانات الصغيرة بسبب قوة إحصائية غير متوفر. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن هذه الخطوة أن يؤديها بالضبط نفس كل مرة عن كل عينة. قيود أخرى هو الوقت. على الرغم من أن هناك نقطة توقف في جميع أنحاء هذا البروتوكول حيث يمكن تجميد العينات واصل الإعدادية في اليوم التالي، يجب تعيين يوم كامل جانبا لتنفيذ هذا الإجراء. ثالثا، ليس كل مركب ضمن عينة بيولوجية يمكن تقييمها لايون القمع. لأنه ليس من الممكن تحديد كيف يمكن للمصفوفة يؤثر كل أيض الفردية، والخيار الحالي هو تقييم المعايير الداخلية التي تحاكي نظريا بعض فئات endogenouق الأيض. أخيرا، تحديد الهوية المطلقة لا يمكن أن يؤديها فقط مع هذا الأسلوب. مطلوبة جنبا إلى جنب MS بالتعاون مع عمليات البحث ومعايير قاعدة البيانات لتحديد المستقلب المطلقة.

جزءا هاما من الايض هو تحديد المركبات. على الرغم من عدم مناقشته في التفاصيل هنا، وقد تم تحليل عينات مراقبة الجودة باستخدام LC-MS. تم إعداد الفراغات إعداد العينات متعددة والفراغات أداة لاستخدامها بوصفها خلفية الطرح لخفض معدل من ايجابيات كاذبة من الملوثات، مما يؤدي إلى الفعالية المستقلب أكثر موثوقية. بعد هذه الخطوة، تم تجميع عدد من "الميزات الجزيئية" معا على أساس م / ض، الوقت الاحتفاظ، نسبة النظائر، وadducts لإنتاج قائمة من المركبات الفعلية. على الرغم من أن قائمة من المركبات وتقلص إلى حد كبير، وكانت النتائج أكثر موثوقية لأنها لا تستند إلى adducts متعددة من نفس المجمع. طريقة كاملة شاملة ويسمح isolatioن من نواتج الأيض مسعور مثل الدهون محايدة، الدهون الفوسفاتية والأحماض الدهنية والدهون الثلاثية، والمنشطات، وعزل أيضا الطبقات المائية في جزء مائي، منها eicosanoids، وقد تم تحديد السكريات، الفلافونويد، والأحماض الأمينية 12، 26.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

تم تنفيذ البرنامج التعليمي قدمت وطورت في إطار مرفق كور الطيف الكتلي في الصحة القومي اليهودي. ويدعم مرفق NJH MS في جزء من CCSTI UL1 TR000154. التمويل من المنح NIH P20 كما دعمت HL-113445 وR01 HL-095432 هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Fisher Scientific A955-4
Methanol Fisher Scientific L-6815
Chloroform Fisher Scientific C606-1
Hexane Sigma Aldrich 34859
Acetic acid Sigma Aldrich 49199-50ML-F
Methyl tert-butyl ether J.T. Baker 9042-03
Isopropyl alcohol Sigma Aldrich 34965-2.5L
Water Honeywell Burdick Jackson 365-4
OA-SYS heating system Organomation Associates, Inc Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35 °C
12-position vacuum manifold Phenomenex
Strata NH2 (55 µM, 70Å) 100 mg/ml SPE cartridges Phenomenex 8B-S009-EAK
Glass pipette tips Fisher Scientific 13-678-20C Used to transfer sample to SPE column
Plastic pipette tips USA Scientific 1182-1830 Used when glass tips are not necessary
Microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
Graduated glass pipets Fisher Scientific 13-678-27B Used to transfer organic solvents during sample prep
Pyrex glass culture tubes Corning Incorporated 99499-16X Used to store aqueous and lipid fractions until the next step
Autosampler vials Agilent Technologies 5182-0545
Snap cap vials for autosampler vials Agilent Technologies 5182-0541
Glass inserts Agilent Technologies 5183-2085 Used for small sample volumes
Mass Hunter Qualitative Analysis software Agilent Technologies Version B.06.00 Used to monitor retention times and pressure curves
Mass Hunter Quantitative Analysis software Agilent Technologies Version B.05.02 Used to analyze quality control and sample data
Mass Profiler Professional software Agilent Technologies Version B.12.50 Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2, 2692-2703 (2007).
  2. Clarke, C. J., Haselden, J. N. Metabolic Profiling as a Tool for Understanding Mechanisms of Toxicity. Toxicologic Pathology. 36, 140-147 (2008).
  3. Wang, X., Zhang, A., Sun, H. Power of Metabolomics in Diagnosis and Biomarker Discovery of Hepatocellular Carcinoma. Hepatology. 57, 2072-2077 (2013).
  4. Collino, S., Martin, F. -P. J., Kochhar, S., Rezzi, S. Monitoring Healthy Metabolic Trajectories with Nutritional Metabonomics. Nutrients. 1, 101-110 (2009).
  5. Cevallos-Cevallos, J. M., Reyes-De-Corcuera, J. I., Etxeberria, E., Danyluk, M. D., Rodrick, G. E. Metabolomic analysis in food science: a review. Trends in Food Scienc., & Technology. 20, 557-566 (2009).
  6. Nicholson, J. K., Connelly, J., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics: a platform for studying drug toxicity and gene function. Nature reviews. Drug Discovery. 1, 153-161 (2002).
  7. Wishart, D., et al. Metabolome Analysis: An Introduction. John Wile., & Sons, Inc. 253-288 (2006).
  8. Vuckovic, D. Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography–mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403, 1523-1548 (2012).
  9. Bollard, M. E., Stanley, E. G., Lindon, J. C., Nicholson, J. K., Holmes, E. NMR-based metabonomic approaches for evaluating physiological influences on biofluid composition. NMR in Biomedicine. 18, 143-162 (2005).
  10. Dong, M. W. Modern HPLC for Practicing Scientists. John Wile., & Sons, Inc. (2006).
  11. Want, E. J., et al. Solvent-dependent metabolite distribution, clustering, and protein extraction for serum profiling with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 78, 743-752 (2006).
  12. Yang, Y., et al. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. Journal of Chromatography A. 1300, 217-226 (2013).
  13. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  14. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49, 1137-1146 (2008).
  15. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, 911-917 (1957).
  16. Ferreiro-Vera, C., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Comparison of sample preparation approaches for phospholipids profiling in human serum by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1240, 21-28 (2012).
  17. Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. UPLC-MS-Based Analysis of Human Plasma for Metabonomics Using Solvent Precipitation or Solid Phase Extraction. Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).
  18. Kerns, E. H., Di, L. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to toxicity optimization. First edn. Elsevier Academic Press. (2008).
  19. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., Jiménez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. American Journal of Clinical Nutrition. 79, 727-747 (2004).
  20. Weimer, J. M., Kriscenski-Perry, E., Elshatory, Y., Pearce, D. A. The neuronal ceroid lipofuscinoses. Mutations in different proteins result in similar disease. NeuroMolecular Medicine. 1, 111-124 (2002).
  21. Schulze, H., Sandhoff, K. Lysosomal lipid storage diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  22. Kuhn, E., et al. Interlaboratory evaluation of automated, multiplexed peptide immunoaffinity enrichment coupled to multiple reaction monitoring mass spectrometry for quantifying proteins in plasma. Molecular and Cellular Proteomics. 11, (2012).
  23. Rist, M. J., et al. Influence of Freezing and Storage Procedure on Human Urine Samples in NMR-Based Metabolomics. Metabolites. 3, 243-258 (2013).
  24. Boomsma, F., Alberts, G., van Eijk, L., Manin‘t Veld, A. J., Schalekamp, M. A. Optimal Collection and Storage Conditions for Catecholamine Measurements in Human Plasma and Urine. Clinical Chemistry. 39, 2503-2508 (1993).
  25. Wood, J. T., et al. Comprehensive profiling of the human circulating endocannabinoid metabolome: clinical sampling and sample storage parameters. Clinical Chemistry and Laboratory. 46, 1289-1295 (2008).
  26. Bahr, T. M., et al. Peripheral blood mononuclear cell gene expression in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 316-323 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics