Modellierung Schlaganfall bei Mäusen: Permanent Koagulation der distalen A. cerebri media

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Medicine
 

Summary

Verschiedene Mausmodellen der mittleren Hirnarterie (MCAO) sind weit verbreitet in der experimentellen Hirnforschung. Hier zeigen wir das Modell der transkraniellen Dauer distalen MCAO, die im Einklang kortikalen Infarkt von einer Größe, die von der Mehrheit der menschlichen ischämische Schlaganfälle auferlegt Schaden produziert.

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Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (89), e51729, doi:10.3791/51729 (2014).

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Abstract

Der Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und die Hauptursache für erworbene Invalidität bei Erwachsenen in entwickelten Ländern. Nur sehr begrenzte Therapieoptionen sind für einen kleinen Teil der Schlaganfall-Patienten in der Akutphase zur Verfügung. Die aktuelle Forschung ist intensiv auf der Suche nach neuen therapeutischen Strategien und konzentriert sich zunehmend auf die Unter akuten und chronischen Phase nach Schlaganfall, weil mehr Patienten könnte die für therapeutische Interventionen in einem längeren Zeitfenster sein. Diese verzögerten Mechanismen gehören wichtige pathophysiologische Vorgänge wie zB nach Schlaganfall Entzündung, Angiogenese, neuronale Plastizität und Regeneration. Um diese Mechanismen zu analysieren und anschließend zu bewerten neuartiger Medikamente werden experimentelle Taktmodelle mit klinischer Relevanz, niedrige Sterblichkeit und hohe Reproduzierbarkeit gefragt. Außerdem Mäusen sind die kleinsten Säugetiere, in dem ein Brenn Schlaganfallläsion induziert werden und für die ein breites Spektrum von transgenen Modellenzur Verfügung. Deshalb beschreiben wir hier das Maus-Modell der transkraniellen, permanent Koagulation der mittleren Hirnarterie über Elektrokoagulation distalen lenticulostriatal der Arterien, die so genannte "Gerinnungsmodell". Das resultierende Infarkt in diesem Modell ist hauptsächlich in der Rinde liegt; die relative Infarktvolumen im Verhältnis zur Größe des Gehirns entspricht der Mehrheit der menschlichen Schlägen. Darüber hinaus wird das Modell erfüllt die genannten Kriterien Reproduzierbarkeit und geringer Mortalität. In diesem Video zeigen wir die chirurgischen Methoden der Schlaganfallinduktion in der "Gerinnungsmodell" und berichten histologische und funktionelle Analyse-Tools.

Introduction

Der Schlaganfall ist die dritthäufigste Todesursache und eine der Hauptgründe für erworbene Invalidität bei Erwachsenen in den Industrieländern ein. Etwa 80% dieser akuten neurologischen Erkrankung wird durch Ischämie Gehirn von einer Behinderung der Hirndurchblutung verursacht wird, während resultierenden etwa 15% werden durch eine Hirnblutung 2 verursacht. Trotz der anhaltenden Forschung ist die intravenöse Verabreichung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator die einzige zugelassene pharmakologische Behandlung von ischämischen Schlaganfalls so weit und nur für eine Minderheit der Schlaganfall-Patienten aufgrund der kurzen Zeitfenster genehmigt von 4,5 Stunden nach Symptombeginn 3,4. Da es keine in vitro-Modelle, die richtig zu modellieren können die komplexen Wechselwirkungen zwischen dem Gehirn, Gefäße und systemische pathophysiologischen Mechanismen bei Schlaganfall, sind Tiermodelle unerlässlich für die präklinische Schlaganfallforschung.

Deshalb haben mehrere ischämischen Schlaganfall Modelle in einer Variablen entwickeltschaft der Arten. Eines der am häufigsten verwendeten Taktmodelle ist die "Filament-Modell", wo ein Nahtmaterialfaden wird transient in die innere Halsschlagader eingeführt und weitergeleitet, bis die Spitze verschließt den Ursprung der mittleren Hirnarterie (MCA), was zu einem Stopp des Blutflusses und anschließende Hirninfarkt subkortikaler und im Falle einer längeren Verschluss auch kortikalen Regionen 5,6. In photothrombotic Modelle von ischämischen Schlaganfall wird ein photo Okklusion des bestrahlten kortikalen Gefäß nach Injektion eines Photosensibilisators was zu kleinen, örtlich umschriebene Läsionen 7 gelöst. Die permanente Okklusion der MCA distalen lenticulostriatal der Arterien durch eine Ligation der Arterie, seine vorübergehende Kompression oder durch dauerhafte Koagulation 8,9 erreicht werden. Die daraus resultierende Infarkt in diesem Modell betrifft vor allem die Neocortex 10, weil der Verschluss der MCA in diesem Modell ist distal der lenticulostriatal Arterien, die die Basalganglien liefern.

Da die Mehrheit der menschlichen Schlaganfall Läsionen im Gebiet der mittleren Hirnarterie befindet, alle gängigen Taktmodelle ähneln Verschlüsse der MCA oder einer ihrer Äste 11. Die MCA ist einer der großen Arterien, die Blut zum Gehirn liefert; es ergibt sich aus der A. carotis interna, Routen entlang des Sulcus lateralis, wo es dann Niederlassungen und Projekten in die Basalganglien und den Seitenflächen der Stirn-, Scheitel-und Schläfenlappen, einschließlich des primären motorischen und sensorischen Kortex. Die rechten und linken MCA an der vorderen Hirnarterien verbunden ist und der hintere Kommunikation Arterien, die den posterioren cerebralen Arterien zu verbinden, wodurch der Kreis von Willis (Abbildung 1).

Wie bereits von Carmichael et al. Berichtet 11, Infarkte durch das distale Middle Cerebral Ar modelliertBatterie Occlusion (MCAO)-Modell bei Mäusen umfassen etwa 10-15% der Hemisphäre, wodurch ein Großteil der menschlichen Schlaganfall Läsionen, die in der Rinden MCA Gebiet befinden 11,12 imitiert. Im Jahr 1981 Tamura et al. Beschrieben eine permanente, transkranielle MCAO Gerinnungsmodell bei Ratten 8. Aber die von Tamura beschriebenen Modell einbezogen einen proximalen Verschluß der MCA um die weitere distale Gabelung der Arterie zu umgehen. Somit wird die ursprüngliche "Tamura Modell" induziert nicht nur kortikalen Läsionen im Striatum als auch, ähnlich wie die von der "Filament-Modell" 6 erhaltenen Läsionen. Hier beschreiben wir die permanente distalen MCAO-Modell durch transkranielle Elektrokoagulation bei Mäusen. Ähnliche histologische und funktionelle Methoden Außerdem berichten wir, um den Hub Ergebnis in diesem Modell zu analysieren. Alle Methoden sind auf entwickelt und in unseren Labors verwendet Standard-Betriebsverfahren.

Protocol

Ethik-Erklärung

Die in diesem Video berichtet Experimente wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Richtlinien für den Einsatz von Versuchstieren und der Protokolle wurden von den deutschen Regierungs Ausschüsse (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) zugelassen durchgeführt. 10 Wochen alten, männlichen C57BL/6J-Mäuse werden in dieser Studie verwendet. Die Tiere wurden unter kontrollierter Temperatur (22 ± 2 ° C) untergebracht ist, mit einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus-Periode und den Zugang zu pelletierten Futter und Wasser ad libitum. Analgesie und Sedierung Protokolle beschrieben wurden von den lokalen Regierungsausschuss genehmigt, aber vielleicht unterscheiden von Protokollen in anderen Laboratorien.

1. Herstellung des Materials und Instrumente

  1. Schließen Sie die Heizdecke, um den Arbeitsbereich zu halten warm und die Maus, die Körpertemperatur während der Narkose (37 ° C) zu halten.
  2. Bereiten autoklaviert Scheren, Pinzetten und Baumwolle, dexpanthEnol-Augensalbe und Nahtmaterial. Bereiten Sie eine Spritze mit Kochsalzlösung (ohne Nadel), um den Arbeitsbereich mit Feuchtigkeit zu halten. Bereiten Sie das Anästhesiegas (70% N 2 O + 30% O 2 + Isofluran).
  3. Injizieren Analgetika intraperitoneal: Metamizol 200 mg / kg, Carprofen 4 mg / kg und Buprenorphin 0,1 mg / kg.
  4. Platzieren Sie die Maus in die Induktionskammer mit einem Isofluran Flussrate von 4%, um es zu betäuben, bis spontane Bewegung von Körper und Tasthaare stoppt.
  5. Übertragen Sie die Maus in Seitenlage mit der Nase in die Narkosemaske und halten Isofluran-Konzentration von 4% für ca. eine Minute, dann reduzieren und es bei ca. 1,5%, geeignete Anästhesie zu halten.
  6. Bewerben Dexpanthenol Augensalbe auf beiden Augen.

2. Distal MCAO Modell

  1. Machen Sie eine 1 cm Hautschnitt zwischen dem Ohr und Auge mit wenig Betrieb Schere nach aseptischen Herstellung der Operationsstelle using Hautdesinfektionsmittel.
  2. Trennen Sie die Haut und die Lokalisierung der Schläfenmuskel.
  3. Wählen Sie in der Hochfrequenzgenerator die Gerinnungsfunktion, bipolare Modus 12 W und verbinden Sie die Elektrokoagulation Zange mit dem Kabel.
  4. Fügen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung und benutzen Sie die Zange, um den Schläfenmuskel aus dem Schädel in der apikalen und Rückenteil lösen und dadurch, so dass ein Muskellappen völlig ohne Entfernung des Muskels.
  5. Identifizieren Sie die MCA unter der transparenten Schädel, im rostralen Teil des Schläfenbereich, dorsal der retro-orbitalen Sinus (Abbildung 2A). Wenn der MCA Bifurkation nicht sichtbar ist (aufgrund einer anatomischen Normvariante) identifizieren das Schiff meisten rostral.
  6. Fügen Sie etwas Kochsalzlösung auf dem Schädel und dünn aus den Knochen mit dem Bohrer rechts oberhalb der MCA Zweig, bis es eine dünne und durchscheinende Textur (2B) hat.
  7. Den Knochen vorsichtig zurückziehen über der Arterie mit einem sehr dünnen Pinzette.
  8. Wählen bipolaren Modus in der Hochfrequenzgenerator 7 W. Coagulate die Arterie mit der Elektrokoagulations Zange proximal und distal zu der Bifurkation (Fig. 2C). Wenn der Bifurkation nicht sichtbar ist aufgrund einer anatomischen Variante, gerinnen die korrekt identifiziert MCA Zweig (siehe oben) an zwei Standorten von rd. 1 mm Abstand. Es ist nicht notwendig, um die Arterie mit der Pinzette zur Koagulation zu erreichen, berührt die Arterie genau mit der Zange auf beiden Seiten von oben ist ausreichend und verursacht weniger mechanische Schäden.
  9. Warten Sie 30 Sekunden und sanft berühren die Arterie mit einer stumpfen Pinzette für jeden Blutfluss durch spontane Rekanalisation zu überprüfen. Im Falle der Rekanalisation einmal wiederholen Elektrokoagulation.
  10. Stellen Sie den Schläfenmuskel, um seine Position, für den Bohrloch.
  11. Naht der Wunde und legen Sie das Tier in einem Pflegefeld bei 32 ° C aus der Narkose zu erholen und wieder in den Käfig. In der Regel dauert es 5-10 min für das Tier vom Anesth erholenESIA.
  12. Postoperative Analgesie Inject (ip) nach 24 h und dann täglich bis zum fünften postoperativen Tag: Carprofen 4 mg / kg.

3. Sham Betrieb

Führen Sie alle identisch zu dem oben beschriebenen Betrieb - auch Ausdünnung des Schädels und ihre Entfernung - bis auf nicht Koagulieren der Arterie freigelegt.

4. Zylinder-Test 13

  1. Legen Sie das Tier in einem transparenten Acrylglaszylinder (Durchmesser: 8 cm, Höhe: 25 cm) vor zwei Spiegel und Video 5 min. Einstellen der Kamera mittig vor den beiden Spiegeln und dem Zylinder, um eine optimale Video (3A) zu erhalten.
  2. Für die Beurteilung der unabhängigen forelimb Gebrauch Punktzahl (1) Kontakt der Zylinderwand mit einem Vorderbein bei Voll hinten und (2) Landung mit nur einem Vorderbein auf dem Boden nach der vollständigen hinten. Graf mindestens 20 Kontakte für ein Vorderbein mit Zeitlupe oder Bild-für-frame Funktion des Video Lan Client (VLC) Freeware-Software ( http://www.videolan.org/vlc ).
  3. Für Baseline-Analyse vor der Operation: führen Sie den Test zweimal pro Maus, mit einem 1 Stunde Pause zwischen den Studien. Vorderbein Nutzung wird als Verhältnis der rechts / links-seitig, unabhängig forelimb Verwendung ausgedrückt.
  4. Nach der Koagulation MCA: zweimal wieder den Test durchführen pro Maus, mit einem 1 Stunde Pause zwischen den Studien wie oben angegeben.

5. Perfusion

  1. Betäuben der Tiere (z. B. durch Ketamin und Xylazin 120/16 mg / kg Körpergewicht, jeweils).
  2. Befestigen Sie das Tier in Rückenlage und öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem medianen Schnitt. Rippen und Brustbein entfernen. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof. Legen Sie eine Perfusionskanüle in der linken Herzkammer und langsam mit 20 ml Kochsalzlösung durchströmen.
  3. Enthaupten, das Tier, öffnen Sie die Schädeldecke und sanft lösen das Gehirn aus der Schädelbasis.

6. Infarktvolumetrie

  1. Kryoschneiden: Schneiden Sie die Gehirne seriell auf einem Kryostaten bis 20 um dicke Schnitte jede 400 um auf Folien und Dias lagern bei -20 ° C
  2. Kresylviolett (CV)-Färbung:
    1. Bereiten Sie die Farblösung: Mischen Sie 0,5 g CV-Acetat in 500 ml H 2 O. Rühren und Hitze (60 ° C), bis sich Kristalle gelöst sind. Lassen Sie die Lösung kühl und speichern in einer dunklen Flasche. Aufwärm bis 60 ° C und Filter vor jedem Gebrauch.
    2. Trocknen der Objektträger bei Raumtemperatur 30 min. Danach legen sie in 95% Ethanol für 15 min und dann in 70% Ethanol für 1 Minute und danach in 50% Ethanol für 1 min.
    3. Objektträger in destilliertem Wasser für 2 min, aktualisieren destilliertem Wasser und legen Sie sie in 1 min. Danach legen Sie die Folien in Färbelösung (60 ° C) foder 10 Minuten und waschen Sie sie zweimal in destilliertem Wasser für 1 min.
    4. Objektträger in 95% igem Ethanol für 2 min. Dann legen Sie sie in 100% Ethanol für 5 min, aktualisieren Sie die 100% Ethanol und legen Sie sie in 2 min. Danach decken die Objektträger mit Montagemedium.
    5. Analyse:
      Scannen Sie die Folien und analysieren die indirekte Infarktvolumen durch das Verfahren Swanson 14 für Ödeme zu beseitigen:
      (Ischämische Gebiet) = (Cortex Bereich der kontralateralen Seite) - (Nicht-ischämischen Kortex Bereich der ipsilateralen Seite) (Abbildung 4A).

Representative Results

Aufgrund der kurzen Zeit der Anästhesie und moderate Schädigung des Gehirns, etwa 10 min nach der Überführung in ihre Käfige alle Tiere wach waren, frei in den Käfig und die Interaktion mit Wurfgeschwister. Die Mortalität während der MCAO Operation war weniger als 5%, vor allem aufgrund des zufälligen Subarachnoidalblutung oder falsche Narkose. Die Mortalität während der 7-tägigen Beobachtungszeit nach Schlaganfall Induktion tritt nur sehr selten in etwa 1-2% der Tiere. Bei dem Betrieb Serie von 10 Tieren für diesen Bericht alle Tiere überlebten die Operation und das 7 Tage Beobachtungszeitraum, keiner von ihnen musste wegen Ausschlusskriterien ausgeschlossen werden.

Behavioral Defizite nach MCA Koagulation wurden von der Testzylinder 13 Analyse Vorderpfote Verwendung Asymmetrie bewertet. In diesem Test wird das Verhältnis der unabhängigen linken und rechten Vorderpfote Verwendung zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Induktion Takt gemessen und mit 24 erhaltenen Ausgangswerteh vor MCAO (3B). Die Tiere präsentiert eine wesentliche Änderung in den Extremitäten Verwendung Asymmetrie für kombinierte Wand Exploration in der Testzylinder 24 h (1,72 ± 0,326, p <0,05) und 3 Tage (1,36 ± 0,17, p <0,05) nach MCAO. Obwohl das Verhältnis im 1. wöchigen Beobachtungszeit verbessert war Motors Asymmetrie noch erhebliche 7 Tage nach MCAO (1,35 ± 0,29, p <0,05) im Vergleich zu den Ausgangswerten.

Wir führten Infarktvolumetrie mit Kresylviolett gefärbten Serien koronalen Hirnschnitten von 7 Tagen nach Schlaganfall Induktion (4B). Die mittlere Infarktvolumen betrug 15,4 mm 3, wobei aus 12% einer Gehirnhälfte (4C). Die Variabilität dieses Schlaganfallmodell ist mit einer Standardabweichung von etwa 10% außergewöhnlich niedrig. Die Läsion Bereich umfasst den somatosensorischen und motorischen Kortex mit nur geringen Neigung von subkortikalen Strukturen. Darüber hinaus Lokalisation des InfarktesGebiet ist in hohem Maße vorhersehbar mit minimaler Variabilität als in der schematischen Verteilungsdiagramm (Fig. 4D) gezeigt.

Figur 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Circle of Willis. Die arterielle Kreis von Willis wird von den mittleren Hirnarterien (MCA) und der vorderen Hirnarterien (ACA), die Abzweigung von der A. carotis interna (ICA), als auch durch die gebildete posterioren Hirnarterien (PCA) und die hintere Kommunikation Arterien (PComA). Die MCA läuft in die seitliche Sulcus wo es sich zur Großhirnrinde. Die dominierende MCA Zweig liefert den größten Teil des motorischen Kortex und ein Teil des somatosensorischen Kortex wird permanent durch die nachgewiesene Modell (Acoma = Anterior Kommunikation Arterie verschlossen, BA = Basilararterie; Suca = Superior-Kleinhirnlar Arterie).

Figur 2
2. Transcranial Ansicht nach Entfernen der Schläfenmuskel und schematische Ansicht der MCA-Okklusion. (A) Nach dem Entfernen der Schläfenmuskel die kortikalen Arterien durch die teilweise durchscheinend Maus Schädel (in 8-12 Wochen alte Mäuse) betrachtet werden. Die dominierende MCA Zweig kann im rostralen Teil der zeitliche Sicht sowie weitere kortikale Arterien Verzweigung von der MCA und der PCA in der Schwanzteil identifiziert werden. (B) Schematische Darstellung auf der Dominante MCA Zweig im vorherrschende Variante mit einer Verzweigung auf der seitlichen temporalen Cortex nach dem Bohren ein Bohrloch und Entfernen des Schädels. (C) schwarze Quadrate die MCA Koagulation Stellen an den proximalen und distalen Seiten der Verzweigung.


3. Analyse von Verhaltensdefiziten. (A) Zylinder-Versuchsaufbau: Die Maus ist in einem vertikalen Zylinder gelegt und Spiegel sind zurück, um alle Bewegungen mit einer Videokamera registrieren sich (B) Vorderbein Verwendung Asymmetrie wurde mit der Zylinder Test analysiert.. Links / rechts-Verhältnisse von unabhängigen forelimb Verwendung wurden 24 Stunden vor der MCAO und zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Induktion Takt berechnet. N = 10, * p <0,05 zwischen den angegebenen Zeitpunkt und Baseline (Kontroll-) Wert.

Fig. 4
Abbildung 4. Volumen Infarkt-Analyse und der Infarkt Ergebnis nach distal MCAO. (A) Repräsentatives Bild einer Kresylviolett gefärbt koronalen BHin Abschnitt 7 Tage nach MCAO. Die gelbe Linie ist die Auswahl der kontralateralen (rechts) Kortex Anzeige-und die rote Linie ist die Auswahl der nicht-Infarkt (gebeizt) Kortex der ipsilateralen Gehirn. Der blasse Bereich in der linken Hemisphäre zeigt die Infarktgewebebereich. (B) Infarktvolumen Analyse von 10 Gehirnen (jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Gehirn) 24 Stunden, 3 Tage und 7 Tage nach distal MCA Koagulation. Die horizontale rote Linie stellt die mittlere, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. (C) Vertreter Kresylviolett gefärbt koronalen Hirnschnitten alle 400 um 7 Tage nach MCA Koagulation. (D) Schematische Verteilung der Infarkthirngewebe von 7 Tagen nach MCAO. Jede Seite zeigt die gesammelten Informationen der Infarktverteilung (Farbkodierung wie angegeben) bei der gegebenen Abschnitt in Bezug auf Bregma (modifizierte Bild aus:. Liesz A et al, Gehirn, 2011, mit Genehmigung von Oxford University Press). <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt die experimentellen Schlaganfallmodell der distalen, permanent MCAO durch transkranielle Elektrokoagulation - die so genannte "Gerinnungsmodell". Dieses Modell hat sich inzwischen zu einem der am häufigsten verwendeten Tiermodelle in der experimentellen Schlaganfallforschung 12. Im Vergleich zu anderen Brenn Gehirn Ischämie-Modellen, die Gerinnungs Modell wie in diesem Video vorgestellt hat den Vorteil einer sehr kurzen Betriebszeit von ca. 10 min, wenn sie von einem ausgebildeten Wissenschaftler durchgeführt. Daher kann kurze Narkose mal in diesem Modell, das eine günstige Eigenschaft eines experimentellen Schlaganfallmodell ist, weil die Auswirkungen von Anästhetika auf die Neuroprotektion und Schlaganfall Ergebnis ist bekannt, 15 erreicht werden. Außerdem ist, wie zuvor von Carmichael et al. 11 beschrieben, wir bestätigen, daß die resultierende Infarktvolumen und Lokalisierung nach distal Permanent MCA Koagulation entspricht ischämische Hirnläsionen in den meisten menschlichenSchläge im Verhältnis zur Größe des Gehirns. Menschen Schlaganfall ist vor allem klein mit Läsionen von ca. 5-15% der Halbkugel, auf der Grundlage früherer Bevölkerungsstudien und klinische Bildgebung Studien 16-18, im Gegensatz zu den umfangreichen Schlaganfall Läsionen mit Druck Hirnödem, die in weniger als 10% auftreten klinischen streicht 19. Dadurch kann Schlaganfall Läsionen in der MCA-Gebiet von rund 12% des von dem vorgestellten Modell erreicht Hemisphäre als translatorisch relevanten Schlagvolumen betrachtet werden. Es hat jedoch zu berücksichtigen, dass verschiedene Mausstämme verwendet oder Anästhesie-Protokolle könnte die daraus resultierende Läsion Volumen 20 zu beeinflussen.

Die Sterblichkeit im Beobachtungszeitraum nach Schlaganfall Induktion in diesem Modell ist praktisch nicht vorhanden. Die Gesamtmortalität von weniger als 5% besteht hauptsächlich aus Todesfälle während des Betriebs aufgrund von Narkosekomplikationen oder Opfer wegen Erreichen der Ausschlusskriterien. Um die niedrigen v rechtfertigenariability dieses Modell und seine hervorragende Reproduzierbarkeit, empfehlen wir die folgenden Ausschlusskriterien: 1) Eine Subarachnoidalblutung während der Operation. 2) Betriebszeit länger als 15 min. 3) Rekanalisation des MCA nach zwei Versuchen für Elektrokoagulation mit nur vorübergehenden MCAO. Darüber hinaus müssen die Tiere täglich nach MCAO (Grund physiologische Verhalten, Pelz Aussehen und Körpergewicht), für Schmerzen, Beschwerden oder Krankheit Verhalten steuern sucht werden.

Verschiedene Maßnahmen können zur Analyse von Schlaganfall Ergebnis wie Laser-Speckle-Messung, Magnetresonanztomographie, Verhaltenstests oder histologische Analyse durchgeführt werden. In diesem Protokoll stellen wir beispielhafte Verfahren zur Verhaltensanalyse und Infarktvolumen-Analyse. Mehrere Test zur Verhaltensanalyse nach fokaler Hirnischämie wurden entwickelt und in experimentellen Schlaganfallforschung. Geeignete Tests für sensomotorischen Dysfunktion zuvor von unserer Gruppe in diesem Schlaganfallmodell 21,22 verwendeten wirre der Rotarod Test 23, Sticky-Label-Test 24, Ecke Test 25 und der Zylinder Test 13, die in diesem Video gezeigt wird. Der Zylinder stellt konsequent Testmotor Asymmetrie in der akuten Phase nach distal permanenten MCAO und erkennt in Folge wieder der motorischen Funktion auch.

Trotz der offensichtlichen Vorteile, haben einige Einschränkungen dieser Schlaganfallmodell berücksichtigt werden. Zuerst wird eine Trepanation des Schädels, um die Arterie zu koagulieren benötigt, wodurch eine potentielle Zugangs für peri-operative Infektionen des Gehirns, auch von bakteriellen Infektionen der Operationswunde, Schläfenmuskel oder das Gehirn selbst nie von uns festgestellt oder von anderen mit diesem Modell dokumentiert. Außerdem können mechanische Schäden an der Rinde während der Herstellung und Koagulation nicht ausgeschlossen, sondern kann durch sorgfältige Bohren und Entfernen des Schädels, konstanten Befeuchtung der Operationsstelle und minimale ne begrenzt cessary Elektrokoagulation (siehe Ausschlusskriterien). Obwohl der Verlauf der MCA wie in Fig. 2 dargestellt ist, in der Mehrzahl von C57BL / 6 Mäusen, beschreiben wir in dem Protokoll, wie in der normalen Schwankungen des Behälters natürlich fortfahren Modell Variabilität zu minimieren. Darüber hinaus empfehlen wir die Verwendung von mehreren (3 im Falle der Bifurkation; 2 ohne Bifurkation der MCA) Okklusion Websites, um das Risiko von Teil Rekanalisation des MCA, die in unserer Erfahrung ist ein wichtiger Faktor für die Variabilität dieses Modells zu minimieren.

Hinsichtlich der Verhaltenstests können nur geringfügige Verhaltensdefizite in der oben genannten Verhaltenstests nachgewiesen werden, und funktionelle Regeneration innerhalb der ersten Woche nach dem Schlaganfall beobachtet. So könnte fortgeschrittenen Testsysteme mit höherer Empfindlichkeit und qualitativen Testparameter wie dem Fach Erreichen Test 27 besser geeignet, um langfristige funktionelle Ergebnis in diesem Modell zu erkennen.

NHALT "> Schließlich wird ein zuvor beschriebenen thromboembolischen Schlaganfall-Modell 26 sieht jedoch aufgrund der permanenten Koagulation des MCA keine Reperfusion erhalten werden, die eine in einem wesentlichen Anteil von Schlaganfallpatienten durch spontane oder Gerinnsel-Lyse-Therapie 28 beobachtet Merkmal ist. die Möglichkeit für eine kostenlose Schlaganfall-Modell mit Reperfusion der kortikalen Gehirn Ischämie. Zusammengenommen ist die hohe Reproduzierbarkeit, die mögliche Langzeitbeobachtung durch minimale Sterblichkeit und dem vergleichbaren relativen Infarktvolumen und Lokalisierung in Bezug auf die Menschen Schlaganfall unterscheiden die "Gerinnungsmodell" als ein wertvolles Modell für die Grundlagen-und translationalen Schlaganfallforschung.

Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den Exzellenzcluster der Deutschen Forschungsgemeinschaft "Munich Cluster for Systems Neurology (Synergie)" und von der Daimler-Benz-Stiftung, AL finanziert

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Canon Eos 500D Canon Optics: 18-55 mm; 30 fps; 640 x 480 video function
Mirror Kristallform 2677089 30 x 30 cm 
Transparent acrylic glass cylinder H&S Kunststofftechnik Diameter: 8 cm,  height: 25 cm
Heating blanket FHC DC Temperature Controller
Fine Scissors FST 15000-00
Mayo Scissors FST 1410-15
Forceps FST 11616-15
Cottons NOBA Verbondmitel Danz 974116
Saline solution Braun 131321
Bepanthen pommade Bayer
Isoflurane Abbot B506
Anesthesia system for isoflurane Drager
Stereomikroskop  Zeiss Stemi DV4
Electrosurgical device ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgiegerät
Drill Proxxon D-34343
Ketamine Inresa Arzneimittel GmbH
Xylacine Albrecht
5ml Syringe  Braun
Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 Apotheke Innestadt Uni Munchen P32799
Isopentane Fluka 59070
Cryostat Thermo Scientific CryoStarNX70
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Cresyl violet Sigma Life Science C5042-10G
Acetic acid Sigma Life Science 695092
Ethanol 70% CLN Chemikalien Laborbedorf 521005
Ethanol 96% CLN Chemikalien Laborbedorf 522078
Ethanol 99% CLN Chemikalien Laborbedorf ETO-5000-99-1
Roti-Histokit mounting medium Roth 6638.1
C57Bl/6J mice Charles River 000664

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