Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

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Neuroscience

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Zhang, P., Xia, N., Reijo Pera, R. A. Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (91), e51737, doi:10.3791/51737 (2014).

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Abstract

Introduction

Dopaminergica (DA), i neuroni possono essere trovati in diverse regioni del cervello, tra cui il mesencefalo, l'ipotalamo, retina, e bulbi olfattivi. I neuroni A9 DA nella pars compacta della substantia nigra (SNPC) comportamento di controllo e il movimento proiettando alla striato nel proencefalo e formare il sistema motorio extrapiramidale. La degenerazione dei neuroni A9 DA conduce alla malattia di Parkinson (PD), che è la seconda malattia neurodegenerativa umana più comune e attualmente incurabile. Terapia di sostituzione cellulare è una delle strategie più promettenti per il trattamento della malattia di Parkinson 1, quindi, c'è stato un grande interesse derivante neuroni A9 DA da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs), includendo sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e il recenti cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs).

Molta ricerca ha cercato di ricavare neuroni A9 DA da hPSCs utilizzando vari metodi. Le prime relazioni di tutti i neuroni DA generati attraverso una neuralefase progenitore rosetta. In co-coltura con MS5 2 o PA6 3-5 cellule stromali con o senza fattori di crescita esterna per 2-4 settimane, L. Studer e colleghi e di altri tre gruppi indotte con successo hESC per produrre rosette neurali. Hanno poi arricchito queste rosette di dissezione meccanica o digestione enzimatica per un'ulteriore differenziazione. In altri rapporti, i ricercatori hanno generato rosette neurali attraverso il corpo embrioide (EB) galleggianti cultura differenziazione 6-9. In seguito, i ricercatori hanno stabilito un monostrato basato metodo differenziazione 10,11, dove si placcati hESC e hiPSCs sulla matrice extracellulare, aggiunti diversi fattori di crescita nella cultura di indurre la differenziazione di hPSCs di neuroni DA, che imita il vivo DA sviluppo embrionale dei neuroni in . Anche se tutti questi studi ottenuti tirosina idrossilasi (TH) cellule esprimente con alcune caratteristiche di neuroni DA, l'intero processo di differenziazione è il tempo e il lavoro consumo,generalmente inefficiente, e, soprattutto, l'identità A9 di questi neuroni non sono state dimostrate nella maggior parte degli studi, eccetto quella con Lmx1a espressione ectopica 12. Recentemente, un piatto nuovo piano (FP) basata su protocollo è stato sviluppato 13-16, in cui i precursori FP con DA potenziale del neurone sono stati generati dall'attivazione del riccio Sonic e canoniche vie di segnalazione Wnt durante la fase iniziale della differenziazione, e quindi queste cellule FP sono stati ulteriormente specificati per neuroni DA. Anche se questo protocollo è più efficiente, ci sono ancora alcuni problemi; per esempio, l'intero processo di differenziazione richiede molto tempo (almeno 35 giorni) ed è dipendente cella alimentatore 15, o è dipendente EB 16 o l'identità A9 non è stato dimostrato 14.

Qui, sulla base delle conoscenze di sviluppo embrionale in vivo DA neurone e risultati pubblicati di altri ricercatori, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per l'effgenerazione icient di DA neuroni da entrambi hESC e hiPSCs. In primo luogo abbiamo generato cellule FP precursori dalla attivazione del segnale Wnt canonica con piccola molecola CHIR99021 e sonic hedgehog segnalazione con piccole molecole SAG e purmorphamine. Queste cellule esprimono FP Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestina. Abbiamo poi specificato queste cellule FP a neuroni DA con fattori di crescita, tra cui BDNF, GDNF, ecc. I neuroni DA generati sono di tipo cellulare A9 come sono positivi per GIRK2 mentre negativo per calbindin 17. Questo protocollo è cella alimentatore o EB indipendente, altamente efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo, si può ricavare neuroni DA in meno di 4 settimane dalla hESC o hiPSCs di persone normali per lo studio trapianto di cellule, o da hiPSCs di pazienti PD per la modellazione in vitro di PD o testare potenziali agenti terapeutici per il PD.

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Protocol

1 Preparazione della Cultura media

  1. Preparare topo fibroblasti embrionali (MEF) medium combinando il seguente: 445 ml di DMEM, 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 14 giorni.
  2. Preparare siero contenente HPSC terreno di coltura combinando il seguente: 385 ml DMEM / F12, 100 ml di siero sostituzione knockout (KSR), 5 ml di 100x non essenziali aminoacidi soluzione madre, 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione madre, 5 ml di 100x -mercaptoethanol soluzione stock, e 10 ng / ml bFGF. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni.
  3. Preparare mTeSR1 terreno privo di siero combinando il seguente: 400 ml mTeSR1 medio basale, 100 ml 5x supplemento, e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Mantenere il substrato a 4 ° C per non più di 10 giorni.
  4. Preparare IV soluzione madre 10x collagenasi: pesare 0,5 g potere collagenasi IV, esciogliere con 50 ml di DMEM / F12 e filtro sterilizzare. Preparare delle aliquote e li scorta a -20 ° C per mesi.
  5. Preparare la soluzione di gelatina allo 0,1%: pesare 0,5 g di gelatina (da pelle bovina, di tipo B), il potere e scioglierlo con acqua deionizzata. Mantenere soluzione sterilizzata in autoclave a temperatura ambiente per settimane.
  6. Preparare KSR medio differenziazione combinando il seguente: 410 ml di DMEM, 75 ml KSR, 5 ml di soluzione 100X non essenziali aminoacidi magazzino, 5 ml 100x penicillina / soluzione madre ampicillina, 5 ml di soluzione madre 100X -mercaptoethanol. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni.
    NOTA: KSR varia da lotto a lotto, che possono influenzare l'efficienza di differenziazione. E 'quindi meglio provare diversi lotti di KSR per trovare quello migliore per la differenziazione.
  7. Preparare N2 medio differenziazione combinando il seguente: 98 ml di DMEM, 1 ml 100x supplemento N2 e 1 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4° C per non più di 10 giorni.
  8. Preparare B27 medio differenziazione combinando il seguente: 480 ml di mezzo Neurobasal, 10 ml 50x B27 supplemento, 5 ml di 100x Glutamax soluzione madre, e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni.

2. Cultura di hESC e hiPSCs su cellule di alimentatore MEF

Le hESC H9 sono stati ottenuti da WiCell Research Institute e hiPSCs sono stati stabiliti in laboratorio Reijo Pera attraverso retrovirus-mediata trasduzione di Yamanaka fattori Oct3 / 4, SOX2, Klf4, e c-MYC 18.

  1. Almeno un giorno prima del passaggio delle cellule, preparare alcuni piatti gelatina aggiungendo 1 ml di 0,1% di gelatina a 1 pozzetto di piastre da 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C per almeno 30 min.
  2. Dopo l'incubazione, aspirare gelatina dalle piastre e sementi irradiazione inattivato cellule MEF sulle piastre alla densità di 1,6 x 10 5 cellule/ Pozzetto in mezzo MEF utilizzando un emocitometro per contare le cellule.
    NOTA: In alternativa preparare alimentatori MEF fin da 3 giorni prima del passaggio delle cellule.
  3. Cellule Passage Un giorno, dopo la placcatura alimentatori MEF: media aspirato da hPSCs, aggiungere 1 mg / ml di collagenasi IV a celle a 1 ml / pozzetto e incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora.
  4. Durante questa incubazione, lavare alimentatori MEF una volta con PBS, e quindi aggiungere calda (37 ° C) siero contenente HPSC terreno di coltura a 1,5 ml / pozzetto.
  5. Dopo 1 ora, toccare la piastra di coltura un paio di volte in modo che la maggior parte delle colonie indifferenziate si staccherà dalle piastre, mentre le colonie differenziate rimangono attaccati. Raccogliere accuratamente le colonie galleggianti, e trasferirli in provetta 15 ml.
  6. Lavare delicatamente la piastra una volta con acqua calda (37 ° C) DMEM / F12 e trasferire DMEM / F12 nello stesso tubo da 15 ml.
  7. Centrifugare le provette a 179 xg per 3 min.
  8. Aspirare il terreno dai tubi, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungi guerram HPSC terreno di coltura, le cellule pipettare su e giù più volte per romperli in piccoli gruppi e mescolare bene.
  9. Trasferire le cellule su nuovi alimentatori MEF a 1: 3-1: 6 rapporto.
  10. Cambiare la media ogni giorno e il passaggio delle cellule ogni 5-6 giorni.

3 Preparazione di cellule di Differenziazione

  1. Almeno un giorno prima della preparazione delle cellule, preparare alcuni piatti Matrigel (tipicamente 3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti). Diluire il Matrigel con il freddo (4 ° C) DMEM / F12 a 01:40 e aggiungere 1 ml di Matrigel per pozzetto di 6 pozzetti. Incubare le piastre Matrigel a 4 ° C durante la notte. NOTA: Si può sigillare le piastre Matrigel con Parafilm e scorta a 4 ° C per tutto il tempo una settimana.
  2. Utilizzare cellule (vedi punto 2) 4 giorni dopo il passaggio. Rimuovere tutte le colonie differenziate dalle piastre. Aspirare il terreno dalla piastra di coltura, aggiungere 1 ml accutase per pozzetto e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
  3. Durante l'incubazione, preparare alcuni gelAtin piatti con l'aggiunta di 1 ml di gelatina a 1 pozzetto di 6 pozzetti. Posizionare questi piatti e le Matrigel piastre preparate il giorno prima in incubatrice.
  4. Dopo 5 min di incubazione o quando le cellule sono diventati semi-flottante, le cellule pipetta su e giù più volte per farli in cellule singole.
  5. Raccogliere singole cellule in provette da 15 ml e centrifugare a 258 xg per 3 min.
  6. Risospendere le cellule con un'adeguata quantità di siero contenente HPSC mezzo di coltura, e aggiungere Thiazovivin alla concentrazione finale di 2 micron.
  7. Trasferire le cellule su piastre di gelatina rivestite in rapporto 1: 1, e incubare le cellule a 37 ° C per 30 minuti per rimuovere alimentatori MEF.
  8. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, aggiungere siero appropriato contenente HPSC medio e contare le cellule con un emocitometro.
  9. Centrifugare le cellule a 258 xg per 3 min.
  10. Durante centrifuga, aggiungere Thiazovivin appropriarsi mTeSR1 mezzo per effettuare una concentrazione di 2 mM.
  11. Dopo centrifuga, unaspirano medio e aggiungere mezzo appropriato mTeSR1 con Thiazovivin modo che ci sono 1,8 x 10 5 cellule / ml medie.
  12. Estrarre le piastre Matrigel dal termostato, aspirare il Matrigel e aggiungere 2 ml di cellule miste su 1 bene dei 6 pozzetti.
    NOTA: La densità delle cellule dovrebbe essere 3,6 x 10 4 cellule / cm 2 di superficie.
  13. Riportare le piastre torna l'incubatrice, e lasciare che le cellule attaccano per 24 ore.
  14. 24 ore dopo la placcatura le cellule, aspirare vecchio medio e aggiungere 2 ml nuovo mezzo mTeSR1 per pozzetto e lasciare le cellule crescono per un altro 24 ore prima di iniziare la differenziazione.

Differenziazione cellulare

  1. Inizia differenziazione 48 ore dopo replating le cellule su piastre Matrigel.
  2. Aspirare il terreno di coltura dalla piastra, lavare le cellule una volta con PBS, e aggiungere 2 ml della seguente mezzo di differenziazione per pozzetto: medio differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542 e 100 nM LDN-193189. Segna questo giorno come D0 di differenziazione.
  3. Modificare media ogni giorno da D0 a D20.
    NOTA: Si può preparare mezzo per uso non più di 2 giorni alla volta.
  4. Utilizzare il seguente mezzo per D1 e D2: media differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, e 50 ng / ml FGF8b.
  5. Utilizzare il seguente mezzo per D3 e D4: media differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 mM CHIR99021.
  6. Utilizzare il seguente mezzo per D5 e D6: 75% KSR terreno di differenziamento più il 25% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 mM CHIR99021.
  7. Utilizzare il seguente mezzo per D7 e D8: 50% KSR terreno di differenziamento più il 50% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189 e 3 micron CHIR99021.
  8. Utilizzare il seguente mezzo per D9 e D10: 25% KSR terreno di differenziamento più il 75% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189 e 3 micron CHIR99021.
  9. Utilizzare il seguente mezzo per D11 e D12: media B27 differenziazione integrato con 3 mM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, acido ascorbico 0,2 mM e 0,1 mM cAMP.
  10. Utilizzare il seguente mezzo per il resto della differenziazione: B27 medio differenziazione supplementato con 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, acido ascorbico 0,2 mM e 0,1 mM cAMP.
  11. A circa D16 di differenziazione, preparare alcuni piatti / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Diluire Poly-L-ornitina soluzione madre con il freddo (4 ° C) PBS a 15 mcg / ml, aggiungere 1 ml a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
  12. Aspirare la soluzione di poli-L-ornitina, lavare i piatti 3 volte con acqua sterile e poi asciugare le piastre.
  13. Diluire laminina magazzino solution con il freddo (4 ° C) PBS a 1 mcg / ml, aggiungere 1 ml di un pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
  14. Aspirare la soluzione laminina, lavare i piatti 3 volte con acqua sterile e poi asciugare i piatti.
  15. Diluire la soluzione fibronectina magazzino con il freddo (4 ° C) PBS per 2 mcg / ml, aggiungere 1 ml a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
  16. Chiudere le piastre con parafilm e metterli a 4 ° C per la durata di due settimane.
  17. Dopo 20 giorni di differenziamento, le cellule replate alle piastre / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Aspirare il terreno di differenziazione, aggiungere 1 ml di acqua calda (37 ° C) Accutase a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
  18. Durante l'incubazione, posizionare le piastre / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina nell'incubatrice.
  19. Dopo 5 min di incubazione o quando le cellule sono diventati semi-flottante, delicatamente le cellule pipetta su e giù diverse volte pertrasformarli in cellule singole.
  20. Raccogliere le singole cellule in 15 ml tubi conici, e aggiungere la giusta quantità di mezzo Neurobasal per il conteggio delle cellule, che variano a seconda espansione (dopo 11 giorni di differenziamento, le cellule possono espandersi 15-20 volte). Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  21. Centrifugare le cellule a 258 xg per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con terreno di differenziamento B27 in modo che la concentrazione cellulare è di 1 x 10 6 cellule / ml medie.
  22. Aspirare fibronectina dalle piastre, lavare due volte con PBS e aggiungere 2 ml di cellule di 1 pozzo di 6 pozzetti.
    NOTA: La densità delle cellule per replating dovrebbe essere 2 x 10 5 cellule / cm 2 di superficie.
  23. Modificare media 24 ore più tardi per rimuovere tutte le cellule morte senza legami.
  24. Modificare media ogni giorno fino a quando i punti di tempo desiderati per un dato esperimento.

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Representative Results

Una panoramica del protocollo differenziazione è mostrato in Figura 1. L'efficienza del protocollo differenziazione presentato qui invoca lo stato delle celle di partenza. Pertanto, è fondamentale fare in modo che, prima rimuove tutte le colonie differenziate prima di dissociare hPSCs in celle singole per la differenziazione, e la seconda, una esaurisce la maggior parte, se non tutte, le cellule di alimentazione MEF incubando le cellule su piastre di gelatina rivestite per 30 minuti, e il terzo, uno dei piatti HPSC singole cellule alla densità appropriata sul piatto Matrigel. Come illustrato in figura 2, ripiastrate singole cellule HPSC espanderanno come cluster durante la 48 ore prima differenziazione, formando circa il 70% di confluenza in piastre. Poi, dopo la differenziazione, queste cellule raggiungere la piena confluenza nel più breve di 3-4 giorni, e partendo da circa D16-D17, queste cellule confluenti iniziare a fare alcuni spazi nei piatti, e alcuni assoni / neuriti potrebbe giàessere osservata in questi spazi e sotto gli strati cellulari. Dopo essere ripiastrate a D20, le cellule differenziate attaccati e sono cresciuti come piccoli grumi. Poi, durante i prossimi 5 giorni, gli assoni molto più intensi e morfologicamente intatte / neuriti escono dai ciuffi, e assoni / neuriti di diversi grumi formano alcune connessioni. Durante cultura a lungo termine, i neuroni in un ciuffo generare più estensioni, ottenere più maturo e avere più connessioni con i neuroni in gruppi vicini.

Dopo 11 giorni di differenziazione, hPSCs potrebbero essere efficacemente convertiti in precursori FP, e come illustrato in figura 3, quasi tutte le cellule esprimono la FP marcatori di cellule precursori nestina e Foxa2, e oltre il 90% delle cellule esprimono altri tre marcatori CORIN, OTX2 , e Lmx1a. Poi, dopo più giorni di differenziamento, le cellule precursori FP sono specificati a neuroni DA in quanto esprimono TUJ1 e TH (Figura 4A). Questi neuroni DA sono di A9 identità che Express GIRK2 mentre sono negativi per calbindin (Figura 4B). Esperimenti di immunoistochimica mostrano anche che non ci sono GFAP + astrociti e molto pochi neuroni GABAergici (Figura 4c), indicando che la differenziazione è specificato esclusivamente verso il neurone lignaggio DA.

Figura 1
Figura 1 Panoramica del protocollo di differenziazione, con fattori di crescita / piccole molecole e terreno di coltura utilizzato per ogni giorno. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2 morfologicaal cambia durante il differenziamento. hESC H9 sono stati placcati come singole cellule nella densità cellulare appropriata come descritto, e 48 ore dopo che, queste cellule raggiungono circa il 70% di confluenza nella piastra come colonie (D0). Durante i primi pochi giorni di differenziamento, le cellule si espandono rapidamente, raggiungendo oltre il 90% di confluenza, dopo 24 ore di differenziazione (D1), e poi diventano confluenza dopo 48 ore di più (D3). Tuttavia, la maggior parte di queste cellule ancora esibiscono tipica morfologia hESC con elevato rapporto nucleo citoplasma (D3). Come differenziazione va avanti, le cellule si espandono sempre di perdono gradualmente hESC morfologia. Alla fine del D11 di differenziazione, ci sono più di uno strato di cellule in molte parti della piastra, come dimostra colore più scuro di cellule in alcune zone degli altri (D11). A partire da circa D17 a D20, alcune cellule morte, lasciando alcuni spazi nel piatto, e alcune proiezioni dei neuroni potrebbero già essere osservati in questi spazi unnd volte sotto lo strato di cellule (D20). Dopo replating cella alla fine del D20 per rendere più spazi per le cellule a crescere e la differenziazione, le cellule si aggregano in piccoli gruppi, molto di più assoni / neuriti emergono da questi cluster, e assoni / neuriti provenienti da diversi gruppi formano alcuni collegamenti nel più breve 4-5 giorni (D25). Barra della scala, 200 micron.

Figura 3
Figura 3 Immunostaining per i marcatori FP in fase precoce di differenziazione hESC. H9 sono stati differenziati per 11 giorni utilizzando il protocollo descritto qui. Le cellule sono state poi fissate con paraformaldeide al 4%, permeabilizzate con Triton X-100, bloccato con siero asino e poi colorate per FP marcatori di cellule precursore. Come mostrato qui, quasi tutte le cellule esprimono Foxa2 e nestina, e oltre il 90% delle cellule esprimono Lmx1a, CORIN, eOTX2, indicando una conversione molto alta efficienza da hESC alle cellule FP. Barra della scala, 200 micron.

Figura 4
Figura 4 Immunostaining per i marcatori di neuroni DA in fasi tardive del differenziamento. (A) hESC H9 sono stati differenziati per 25 giorni, e le cellule sono state oggetto di immunoistochimica per il marcatore TUJ1 pan-neurone e comunemente usato DA marcatore neuroni TH. Come mostrato qui, anche se ci sono cellule positive più TUJ1 di cellule positive TH, tutte le cellule TH-esprimono residui nelle cellule-TUJ1 esprimere, e le cellule TH-esprimono rappresentino almeno la metà di tutte le cellule. (B). Le hESC H9 sono stati ulteriormente differenziati per altri 25 giorni (totalmente 50 giorni) e poi le cellule sono state oggetto di immunocolorazione. I risultati hanno mostrato che non vi è più alta la percentuale di TH-esprimenti cellule Thuna che a D25. Quasi tutte queste cellule TH-esprimono anche esprimere GIRK2 mentre la maggior parte di loro sono negativi per calbindin, indicando il sottotipo identità A9 dei neuroni DA generati, che è il tipo di cellula che si perde nel PD. (C) immunocolorazione per celle a D25 di differenziazione mostrato che non ci sono cellule che esprimono GFAP, e pochissime cellule esprimono GABA. Barra della scala, 200 micron.

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Discussion

Le cellule staminali pluripotenti umane (inclusi sia hESC e hiPSCs) possono essere differenziate in vitro per generare la maggior parte, se non tutti, i tipi di cellule del nostro corpo tra cui neuroni DA, che è stata dimostrata in studi precedenti 19. Qui, sulla base delle conoscenze da dopaminergici embrionale neurone sviluppo 20 e protocolli pubblicati da altri laboratori 14,15, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per la generazione di neuroni DA provenienti da hESC e hiPSCs. Questo protocollo è efficiente, riproducibile e abbiamo applicato con successo questo protocollo descritto qui per linee H1 e H9 hESC e alle linee hiPSC da entrambi i pazienti PD e controlli non affetti.

Nel nostro protocollo, ci sono tre passaggi fondamentali per ottenere l'alta efficienza di differenziazione: In primo luogo, non ci dovrebbero essere differenziati colonie HPSC nella differenziazione delle cellule prima regia. Differenziazione spontanea a tutti e tre i foglietti embrionali è spesso visto in hCultura PSC, è importante rimuovere queste colonie differenziate prima di dissociare questi hPSCs in cellule singole. In secondo luogo, alimentatori MEF dovrebbero essere esaurite dai hPSCs dissociati, i rapporti precedenti hanno dimostrato che le cellule MEF can fattori segreti che promuovono l'auto-rinnovamento e inibiscono la differenziazione 21. A tal fine, incubando le miscele HPSC e cellule MEF su piastre rivestite di gelatina per 30 minuti dovrebbe essere sufficiente ad eliminare quasi tutte le cellule MEF. In terzo luogo, i singoli hPSCs dovrebbero essere placcato nella densità cellulare adatto per la differenziazione. Aumentando la densità cellulare porterà alla morte della maggior parte delle cellule intorno D11 di differenziazione, riducendo la densità cellulare provocherà il distacco e la morte delle cellule al centro della piastra a più breve meno di 7 giorni, sebbene le cellule sulla il bordo differenzierà ben (dati non mostrati). Se si osserva tutti questi tre criteri, è facile da ottenere in modo efficiente neuroni DA dal hPSCs con il nostro protocollo graduale.

Il protocollo qui presentata si basa principalmente su una precedente relazione di L. Studer e colleghi 14 con alcune modifiche. In primo luogo, la differenziazione qui è iniziata 48 ore dopo la placcatura singola cella quando le cellule raggiungono solo circa il 70% di confluenza, mentre nella loro relazione, la differenziazione è stato avviato quando le cellule raggiungono la piena confluenza (3 o più giorni di coltura dopo placcatura singola cella). Nella nostra esperienza, a partire differenziazione da cellule confluenti, senza un passaggio cella fino al giorno 20 porta alla morte delle cellule grave durante il processo di differenziazione. In secondo luogo, sostituiamo la proteina SHH costoso nel loro studio con SAG, una piccola molecola agonista-chlorobenzothiophene contenente per HH percorso 22. Pertanto, rispetto ai protocolli precedentemente pubblicati, questa qui descritta è la cellula di alimentazione e rosone neurale indipendente e basata principalmente su piccole molecole per la specifica FP; è quindi meno costosa e meno tempo e di manodopera consumano. Naturalmente, la Limitation di questo protocollo è l'uso di KSR per i primi giorni di differenziazione. KSR varia da lotto a lotto, che possono influenzare l'efficienza di differenziazione. Pertanto, si dovrebbe testare diversi lotti di KSR per ottenere quello che funziona meglio per indurre precursori FP dopo 11 giorni di differenziazione.

In sintesi, il protocollo di differenziazione descried qui dovrebbe facilitare: (1) la generazione di neuroni DA provenienti da hESC o hiPSCs di persone normali per la terapia di sostituzione cellulare per il PD; (2) la generazione di neuroni DA provenienti da iPSCs pazienti PD per la modellazione e la sperimentazione potenziali farmaci terapeutici per il PD in vitro; (3) lo studio dei geni / vie di segnalazione che regolano lo sviluppo dei neuroni DA umano.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 10569-010
FBS Life Technologies 26140
penicillin/ampicillin Life Technologies 15140-122
DMEM/F12 Life Technologies 10565-018
KSR Life Technologies 10828-028
Non-essential amino acid Life Technologies 11140-050
b-mercaptoethanol Millipore ES-007-E
bFGF R&D Systems 233-FB-025
mTesR1 STEMCELL Technologies 5850
Collagenase IV Life Technologies 17104-019
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
N2 supplement Life Technologies 17502-048
B27 supplement Life Technologies 17504-044
Neurobasal Life Technologies 21103-049
Glutamax Life Technologies 35050-061
PBS Life Technologies 10010-023
Growth factor reduced matrigel BD Biosciences 354230
Accutase MP Biomedicals 1000449
Thiazovivin Santa Cruz Biotechnology sc-361380
SB431542 Tocris Bioscience 1614
LDN-193189 Stemgent 04-0074
SAG EMD Millipore 566660-1MG
Purmorphamine Santa Cruz Biotechnology sc-202785
FGF8b R&D Systems 423-F8-025
CHIR99021 Cellagen Technology C2447-2s
BDNF R&D Systems 248-BD-025
GDNF R&D Systems 212-GD-010
TGF-beta3 R&D Systems 243-B3-002
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4034
cAMP Sigma-Aldrich D0627
Mouse anti human NESTIN antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23927 1/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibody Millipore AB9566 1/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibody R&D Systems AF2400 1/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibody Millipore AB10533 1/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibody Pel Freez P40101 1/500 dilution
Chicken anti human TH antibody Millipore AB9702 1/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibody Covance MMS-435P 1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibody Abcam ab30738 1/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibody Abcam ab25085 1/400 dilution
Centrifuge Eppendorf 5804

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References

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