Flat Mount Imaging de ratón de la piel y su aplicación al análisis del folículo del pelo Patrones y sensorial Axon Morfología

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Piel de los mamíferos contiene una amplia gama de estructuras - tales como los folículos pilosos y las terminaciones nerviosas - que exhiben patrones distintivos de organización espacial. El análisis de la piel como montura plana se aprovecha de la geometría de 2 dimensiones de este tejido para producir de espesor total de imágenes de alta resolución de las estructuras de la piel.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology. J. Vis. Exp. (88), e51749, doi:10.3791/51749 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La piel es un tejido altamente heterogénea. Estructuras intra-dérmica incluyen los folículos pilosos, músculos erectores del pelo, especializaciones epidérmicas (tales como grupos de células de Merkel), glándulas sebáceas, nervios y terminaciones nerviosas y capilares. La disposición espacial de estas estructuras está estrechamente controlada en una escala microscópica - como se ve, por ejemplo, en la disposición ordenada de tipos de células dentro de un único folículo piloso - y en una escala macroscópica - como se ve por las orientaciones casi idénticas de miles de pelo folículos dentro de una región local de la piel. La visualización de estas estructuras sin seccionar físicamente la piel es posible debido a la geometría de 2 dimensiones de este órgano. En este protocolo, se muestra que la piel del ratón puede ser diseccionado, fijo, permeabilized, se tiñe y se aclaró como un objeto tridimensional intacta dos, un soporte plano. El protocolo permite la fácil visualización de las estructuras de la piel en su totalidad a través del grosor completo de grandes áreas de la piel por OPTseccionamiento y reconstrucción ical. Las imágenes de estas estructuras también se pueden integrar con la información acerca de la posición y orientación relativa a los ejes del cuerpo.

Introduction

La piel es uno de los órganos más grandes del cuerpo, con funciones importantes en somato-sensación, aislamiento / termorregulación, y la defensa inmune 1. La comprensión de las bases moleculares y celulares del desarrollo y función de la piel le ha interesado desde hace mucho tiempo debido a la importancia fundamental de la piel como un sistema biológico y su importancia para la dermatología. Piel de los mamíferos contiene una variedad de estructuras multicelulares, incluyendo capas estratificadas de queratinocitos, tejido conectivo dérmico, varios tipos de folículos pilosos, glándulas sebáceas, músculos erectores del pelo, vasos sanguíneos, y al menos una docena de distintas clases de aferentes (sensoriales) y el nervio eferente fibras (Figura 1). Diferentes regiones del cuerpo se asocian con característicamente diferentes tipos de piel. En la mayoría de los mamíferos, casi toda la superficie del cuerpo está cubierta de piel que está densamente poblada por los folículos pilosos. [Los seres humanos y las ratas topo desnudas constituyen excepciones a thes patrón.] Hair no se encuentra en las superficies palmar de las manos y los pies, que también están asociados con patrones especializados epidérmicos (dermatoglifos), glándulas exocrinas, y las terminaciones nerviosas sensoriales. Los eventos celulares y moleculares que controlan el crecimiento, la diferenciación, y la disposición espacial de las células dentro del folículo piloso son de especial interés como cada folículo exposiciones, en miniatura, muchas de las características centrales de la organogénesis 2. Estas características incluyen la existencia de células madre y un nicho de células madre, las migraciones celulares precisamente coreografía, y el montaje de estructuras multicelulares de componentes embrionarias diferenciadas.

Este artículo describe métodos para la disección, la fijación, el etiquetado, y la piel de imágenes de ratón como una lámina bidimensional intacto, a que se refiere como una preparación de "todo el montaje" o "plano de montaje". Dado que la piel del ratón es relativamente delgada, es posible a la imagen a través del espesor completo de esquí aplanadaN utilizando microscopía confocal convencional. El enfoque plana de montaje de formación de imágenes la piel de mamíferos es técnicamente ventajoso porque evita la necesidad de seccionamiento física, permitiendo así que las estructuras a ser reconstruidas en su totalidad por seccionamiento óptico. Puesto que casi toda la piel se procesa como un único objeto, el plano de montaje enfoque también facilita la obtención de imágenes de múltiples regiones de la superficie del cuerpo, mientras que la preservación de la información acerca de la posición y orientación relativa a los ejes del cuerpo. Por último, las estructuras dentro de la piel están típicamente presentes en patrones que se repiten a intervalos regulares, facilitando de este modo la colección de imágenes de múltiples representantes de una estructura dada. Estas características son familiares para los neurobiólogos que trabajan en la retina, una parte de dos dimensiones del sistema nervioso central que goza de ventajas análogas para los estudios de la morfología neuronal 3.

El enfoque plana de montaje se describe aquí es de utilit especialy para el estudio de las estructuras que exhiben organización espacial en una escala relativamente grande en el plano de dos dimensiones de la piel. Un ejemplo de organización espacial a gran escala es la polaridad coordinada de los folículos pilosos y las estructuras del folículo asociada el cabello - grupos de células de Merkel, los músculos erectores del pelo, glándulas sebáceas y terminaciones nerviosas 4. Los folículos pilosos se orientan en un ángulo con respecto al plano de la piel, y la componente del vector folículo que se encuentra dentro del plano 2-dimensional de la piel generalmente exhibe una orientación con respecto a los ejes del cuerpo que es determinado con precisión para cada posición en el cuerpo. Por ejemplo, los folículos del pelo en el punto de vuelta de rostral a caudal y el pelo en la superficie dorsal de los pies apuntan de proximal a distal. Orientación del folículo del pelo es controlada por la polaridad celular planar de señalización (PCP, también llamada la polaridad del tejido 5). Este sistema de señalización se descubrió en Drosophila donde una pequeñafue encontrado conjunto de genes de PCP centrales para controlar la orientación de los pelos y cerdas cuticulares. Tres ortólogos de mamíferos de genes de PCP centrales - homólogos frizzled 6 (Fzd6, también conocida como Fz6), cadherina EGF LAG de siete pasadas tipo G del receptor 1 (Celsr1), y-vang como 2 (Vangl2) - desempeñan funciones análogas en los mamíferos la piel, la coordinación de las orientaciones de los folículos del pelo con los ejes corporales. Los estudios de ratones knockout FZ6 (Fzd6 tm1Nat, denominado en lo sucesivo Fz6 - / -) muestran que el defecto primario en la ausencia de la señalización de PCP es una aleatorización inicial o la desorganización de la orientación del folículo piloso, con ningún efecto sobre la estructura intrínseca de los folículos 6-8. Un segundo sistema no PCP actúa después para promover la adaptación local de los folículos cercanos, lo que conduce a la producción de patrones de pelo a gran escala, tales como espirales y mechones.

Un segundo ejemplo de gran escalaorganización espacial dentro de la piel se ve en las morfologías de cenadores axones sensoriales. Las neuronas sensoriales que inervan la piel tienen sus cuerpos celulares en la raíz dorsal y los ganglios del trigémino. Estas neuronas detectan la temperatura, el dolor, picor, y varios tipos de deformaciones mecánicas que inciden en la piel y el cabello 9. Se pueden dividir en subtipos sobre la base de diámetro del axón y la velocidad de conducción, la estructura final del nervio terminal, y los patrones de expresión de los receptores, canales, y otras moléculas. Debido a la alta densidad de inervación dentro de la piel, los análisis que implican la visualización de todos los axones (por ejemplo, la inmunotinción anti-neurofilamentos) o incluso todos los axones de una sola clase (como se ve cuando un solo tipo de células se caracteriza por la expresión de un informador fluorescente) generalmente revela una superposición densa de axones que hace que sea imposible definir la morfología de un árbol individual. Para evitar este problema, hemos utilizado extremadamente escasa L genéticamente dirigidoAbeling para producir muestras dorsales de la piel en la que los cenadores axón bien aisladas individuales se visualizaron mediante la expresión de un reportero histoquímica, fosfatasa alcalina placentaria humana 10. Este enfoque permite la visualización sin ambigüedades de morfologías cenador axón individuales y una definición de tipos de neuronas somatosensoriales basadas en criterios morfológicos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los animales fueron manejados de acuerdo a la atención de los animales institucional y el empleo aprobado (IACUC) Protocolo MO11M29 de las Instituciones Médicas Johns Hopkins. Consulte las pautas locales del Comité de Cuidado de Animales e Institucional para los métodos de eutanasia aprobados. Usar guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad al manipular fijadores aldehído o disolventes orgánicos.

1. Preparación de Materiales

  1. Verter Placas SYLGARD
    1. Siga las instrucciones del fabricante, se mezcla el agente de curado con la base, y remover con una varilla de plástico.
    2. Pipetear ~ 35 ml Sylgard líquido por 10 cm de diámetro placa de cultivo de tejidos. Placas de cultivo de tejidos son más profundos que los platos bacterianas estándar; esto proporciona espacio libre vertical para los pasadores de insectos.
    3. Coloque el dishes en una superficie horizontal a temperatura ambiente durante la noche. Burbujas formadas durante la mezcla desaparecerán.
    4. Después de la polimerización, almacenar las placas de Sylgard a temperatura ambiente.
      NOTA: placas de Sylgard se pueden almacenar a temperatura ambiente durante años y volver a utilizar varias veces hasta que el Sylgard se separa de la placa.
  2. Soluciones
    1. Benzoato de bencilo y alcohol bencílico (BBBA). Mezclar 2 volúmenes de benzoato de bencilo y 1 volumen de alcohol de bencilo. Almacenar en la oscuridad en una botella de vidrio con un tapón de vidrio o teflón superior.
      PRECAUCIÓN: Se utiliza BBBA debe ser manejado adecuadamente como residuo solvente orgánico. No permita que BBBA contactar plástico.
    2. Salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 4 g PFA a 80 ml de agua, añadir 0,1 ml de NaOH 1 N, se agita en una placa caliente a ~ 70 º C durante aproximadamente 5 min hasta que la PFA se disuelva por completo, y luego añadir 10 ml de 10x PBS y llevar el volumen a 100 ml con agua.
      PRECAUCIÓN: La inhalación de formaldehído / PFA y BBBA vapores debe serminimizado al mantener estas soluciones en un recipiente tapado. Formaldehído / PFA es un carcinógeno.
    3. Aceite Rojo O. Prepare un 0,5% stock en isopropanol. Inmediatamente antes de su uso diluir con agua a una concentración final de 0,3% Oil Red O, y luego filtrado a través de un filtro de 0,2 micras.

2. Disección de la piel, Fijación y Compensación

  1. Dorsal de la piel para inmunotinción y Melanina Imaging
    1. Para los ratones muy jóvenes (por ejemplo, los fetos y el día postnatal (PUP P) 0-P3), la eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano. La eutanasia a los ratones de más edad por inhalación de isoflurano o por inyección de ketamina / xilazina seguido por dislocación cervical.
    2. Quite el pelo con una maquinilla de afeitar eléctrica y el gel de depilación. Para los ratones más jóvenes que P8, este paso se puede omitir.
    3. Utilice una hoja de afeitar para hacer un corte horizontal de la base de la cola a lo largo de cada flanco, que pasa en el lado dorsal de la base de cada extremidad, de proceder lateral a los oídos y finalesción en la nariz.
    4. Pele suavemente la piel del procedimiento el tejido subyacente de posterior a anterior mediante la celebración de la piel entre los dedos enguantados de manera que no queden dañados por fórceps. Cuando el pelado de la piel a nivel de los oídos, primero cortar los oídos con un par de tijeras y proceder especialmente lentamente a medida que la piel se puede desgarrar en esta ubicación.
    5. Desde este punto en adelante, orientar la piel con la parte interna hacia arriba. Pin de la piel para Sylgard con ~ 20 pins de insectos uniformemente espaciados alrededor de la periferia; No sobre-estirar la piel (Figura 2B). Cubrir la piel con 10-20 ml de PBS.
    6. Diseccionar la grasa asociado a la piel y el tejido conectivo utilizando pinzas en ángulo o curvados con el extremo en punta de las pinzas que se enfrentan horizontalmente para minimizar el riesgo de que las pinzas se penetrar en la piel. Extruir las burbujas de aire que hayan quedado atrapados debajo de la piel tirando suavemente un aplicador con punta de algodón sobre la superficie de la piel.
      NOTA: Si la piel se vaque se utilizará para la inmunotinción montaje plano o histoquímica, eliminar la mayor cantidad de tejido conectivo como sea posible; Si la piel se va a utilizar para visualizar los folículos del pelo basado en la pigmentación de melanina, la eliminación menos completa de tejido conectivo es satisfactoria. Piel prenatal requiere "limpieza" mínima de tejido conectivo adherente.
    7. Fijar la piel cubrió mediante la adición de 20 ml de recién preparada PFA al 4% / PBS o 10% de formalina tamponada por placa de 10 cm Sylgard (si la piel se utiliza para la formación de imágenes de melanina o fosfatasa alcalina (AP) histoquímica) o 20 ml de recién preparada 2% de PFA / PBS (si la piel se utiliza para inmunotinción o transgénico visualización de queratina (KRT) 17-GFP 11), y gire suavemente durante la noche en una habitación fría. El día siguiente, lavar en PBS durante> 10 min.
      NOTA: formalina estándar es del 37% de formaldehído; por lo tanto, "el 10% de formalina" es de 3,7% de formaldehído.
    8. Para la tinción de AP y la inmunotinción, continúe en la sección 3. Para imag melaninaING, deshidratar la piel a través de una serie de etanol (70%, 95%, 100%), un día por cada paso, con rotación horizontal suave a temperatura ambiente. Quite los tejidos conectivos residuales.
    9. Con la piel en etanol al 100%, eliminar las clavijas de insectos y, si se desea, recortar la piel con tijeras para quitar la mayor parte periférica de 1-2 mm de la piel con los orificios de pasador.
    10. Transfiera la piel para un plato de cristal 10 cm de diámetro, colocar dos portaobjetos de vidrio en la piel para evitar que se curve, y agregar 20 ml de BBBA. BBBA endurece rápidamente el tejido por lo que es importante para la piel para ser aplanada bajo el peso de los portaobjetos de vidrio antes de añadir el BBBA.
    11. Durante las próximas horas, levante las diapositivas de la piel durante unos segundos para permitir que el BBBA a arrastrarse sobre la piel.
      NOTA: Usar guantes cuando se trabaja con BBBA. Dependiendo de la edad y la ubicación de la piel no puede ser tanto como 30% de contracción en BBBA.
  2. Piel Pie de Análisis para el folículo del pelo Patterning
    NOTA: El rango de edades normalmente examinados es P1-P8.
    1. Después de la eutanasia, cortar los pies por encima de la articulación del tobillo y hacer un solo corte recto a lo largo de la superficie ventral a través de las plantas de los pies.
    2. Tienes que despegar la piel del tejido subyacente, procediendo en dirección proximal a distal.
    3. Cortar los dígitos para liberar la piel y el pin SYLGARD con la superficie interior hacia arriba (Figura 2C). No es tejido conectivo mínimo en la piel del pie.
    4. Piel transgénica KRT17-GFP ya está listo para la imagen. Para imágenes de melanina proceder a la fijación, deshidratación y BBBA claro como se describe en la sección 2.1.
  3. Piel Pie para la visualización de las glándulas sebáceas
    1. Después de la eutanasia, quitar el pelo por el roce de gel removedor de pelo sobre la superficie de la piel con un dedo enguantado y el pulgar; esperar 10 min.
      NOTA: No utilice una máquina de afeitar eléctrica, que puede dañar la delicada piel del pie.
    2. Wcenizas de la superficie de la piel con agua del grifo, diseccionar y el pin de la piel para Sylgard como se describe en el apartado 2.2.
    3. Fijar con 1% de PFA / PBS durante 30 min a temperatura ambiente y después lavar en PBS.
      NOTA: Para la visualización de las glándulas sebáceas en los pies, que se desarrollan después de la primera semana después del parto, la edad óptima para el análisis con Oil Red O es P21, ya que esto marca el punto más bajo de la pigmentación del pelo durante el primer ciclo del pelo 12, y por tanto las glándulas sebáceas puede ser visto más fácilmente. Con ratones albinos este análisis se puede realizar a cualquier edad. Para obtener albino progenie cruzada ratones mutantes pigmentada a una línea mutante de tirosinasa como C57BL/6J-Tyr c-2J.
  4. Preparación de la cola de la piel para el Análisis de la melanina Distribución, folículo de cabello Orientación y glándulas sebáceas Visualización
    1. Después de la eutanasia, hacer un corte circular alrededor de la base de la cola, y luego una hendidura longitudinal que recorre toda la longitud de la cola a lo largo de la cara ventral.
    2. <li> Retire la piel de la cola a partir de la punta sujetando firmemente la punta de la cola-hueso y / o tejido conjuntivo con un par de pinzas y la piel con un segundo par de pinzas. Pin de la piel de la cola de Sylgard.
    3. Para el análisis de la distribución de la melanina y la orientación del folículo piloso, fijar y procesar la piel como se describe en la sección 2.1. Para el análisis de las glándulas sebáceas, cortar la piel de la cola en una serie de segmentos de ~ 0,5 a 1 cm de longitud antes de la fijación e incubar las piezas de piel en PBS con EDTA / 5 mM durante la noche a 37 ° C para debilitar la adhesión de la dermis-epidermis 13.
    4. Tienes que despegar la epidermis de la dermis, la epidermis para fijar Sylgard (cara interior hacia arriba), y fijarlo en el 4% PFA / PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar con PBS, y manchar con Oil Red O como se describe a continuación.
      NOTA: Una máquina de afeitar eléctrica y / o gel de depilación se pueden usar antes de la disección de más edad de la piel de la cola (por ejemplo, P21), pero este tratamiento es opcional ya que el pelo de la cola no estan densa como en otros lugares en el cuerpo.

3. Las reacciones de tinción

  1. Placenta humana fosfatasa alcalina (AP) Histoquímica visualizar genéticamente marcado Axon Arbors 10,14,15 (Figuras 3A, B)
    1. Después de PFA fijación en Sylgard, colocar pieles fijos en un plato de vidrio de 10 cm y sumergir bajo PBS / 1 mM MgCl 2. Gire suavemente el plato en un baño de agua a 70 ° C durante 90 minutos para destruir la actividad fosfatasa endógena.
    2. Visualizar la actividad reportero de la AP histoquímicamente con una incubación de 4-48 horas a temperatura ambiente en Tris 0,1 M, pH 9,5, NaCl 0,1 M, 50 mM de MgCl 2, 0,34 g / ml de NBT, y 0,175 g / ml de BCIP, típicamente usando 10-15 ml de solución de tinción por piel dorsal P21. Monitorear la reacción bajo el microscopio de disección, teniendo cuidado de no dejar que se siga más allá del momento óptimo, a juzgar por la inspección visual de la tinción axón intensidad relativa a inespecífica deposición NBT. Se detiene la reacción mediante lavado con tres cambios de PBS/0.1% de Tween-20 en el transcurso de 1 hora, re-pin las pieles a Sylgard, deshidratar la piel a través de una serie de etanol, y luego transferir las pieles a una placa de 10 cm con BBBA.
      NOTA: BBBA se disuelve lentamente el precipitado NBT. Durante las primeras horas de BBBA, una multa de fondo de precipitado NBT se disolverá; como resultado, la solución BBBA se oscurece, y la piel se aclarará. Cambie a BBBA fresco después de unas horas.
    3. Después de obtener imágenes de la piel manchada de AP, transferirlo al etanol durante> 1 hora a temperatura ambiente y luego guárdelo en etanol nuevo a -20 ° C. Pieles teñidas con AP se pueden almacenar de esta manera durante muchos meses sin pérdida de señal.
  2. Oil Red O tinción para visualizar las glándulas sebáceas 4 (Figuras 3C-F)
    1. Retire los pasadores de insectos y transferir el pie ligeramente fijo o pieles de la cola de la placa Sylgard a los pocillos de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos, conhasta dos muestras de piel por pocillo. Lavar con 60:40 isopropanol: agua durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    2. Teñir en 2 ml de 0,3% Oil Red O en 60:40 isopropanol: agua (ver sección 1.2) a temperatura ambiente durante 2 horas.
    3. Lavar con 60:40 de isopropanol: agua durante 5 min a temperatura ambiente, seguido por un lavado con agua. Recortar cuidadosamente de distancia de los bordes de la piel, incluyendo los orificios de pasador, con tijeras finas de manera que la superficie de la piel se puede hacer lo más plana posible.
    4. Colocar la piel sobre un portaobjetos con la superficie exterior hacia arriba, añadir unas gotas de agua o medio de montaje acuoso, cubrir la piel con una platina, y luego la cinta suavemente el cubreobjetos al portaobjetos para aplanar aún más la piel.
  3. Monte Piso Inmunoticción 4,16,17 (Figuras 3G, H)
    1. Cortar un rectángulo de piel PFA fijo (por ejemplo, 1 cm x 0,5 cm), que marca su orientación con un corte asimétrico (por ejemplo, cortar la esquina anterior derecha). Realice la incubación yetapas de lavado con una rotación suave sobre una plataforma horizontal que gira. En los pocillos de una 6 - o 12-así placa de cultivo tisular, se lava varias veces con PBS para eliminar PFA residual, lavar con ~ 10 cambios de PBS con 0,3% de Triton X-100 (0,3% de PBST) durante 5-8 horas a temperatura ambiente para permeabilizar la piel.
    2. Incubar con el anticuerpo primario en 0,3% de PBST con 5% de suero de cabra y 20% de DMSO durante cinco días a temperatura ambiente. Cubrir los pocillos de la placa con cinta adhesiva transparente o de plástico adhesivo para eliminar las pérdidas por evaporación.
    3. Lavar con 10-15 cambios de 0,3% de PBST durante 5-8 horas y se incuba con el anticuerpo secundario en 0,3% de PBST con 5% de suero de cabra y 20% de DMSO durante 3 días a temperatura ambiente.
    4. Lavar con 10-15 cambios de 0,3% PBST más de 5-8 horas.
    5. Deshidratar en 25%, 50%, y 75% de metanol durante 5 min cada uno y luego 3 veces en 100% de metanol durante 20 min cada uno.
    6. Claro en BBBA durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: mount Flat inmunotinción de la piel más joven que~ P1 se puede realizar como se describe anteriormente pero con incubación más corto y tiempos de lavado. Por ejemplo, la piel P1 puede inmunotiñó con una noche de incubación en el anticuerpo primario y una incubación de varias horas en el anticuerpo secundario, y con la intervención de lavados de sólo 2-3 horas en el 0,3% PBST. Como se señaló anteriormente, las pieles jóvenes también son suficientemente delgadas que se pueden obtener imágenes sin BBBA claro.
  4. Visualización de grupos de células de Merkel con los nervios Fluorescente Terminal absorción de colorante (Figuras 3I-L)
    IAM-43 (verde) y AM4-65 (rojo) son los tintes fluorescentes que se pueden fijar que entran en las células a través del canal de cationes no selectivo 18. En la piel viva estos tintes se toman selectivamente y se concentraron en las células de Merkel.
    1. Disolver 1 mg AM1-43 o AM4-65 en 2 ml de PBS y almacenar en alícuotas a -80 ° C.
    2. Inyectar cachorros recién nacidos por vía subcutánea con 2-10 mg de colorante por gramo de peso corporal utilizando una aguja de 29.
    3. Un día después, la eutanasia a los ratones y Dissect las pieles dorsales.
    4. Fijar las pieles en el 4% PFA / PBS a 4 ° C durante la noche, lavar con PBS, y monte la piel como se describe en la sección 3.2.

4. Imagen y Análisis de Imágenes

  1. Imaging folículo del pelo Orientación (Figura 4)
    1. Utilice un microscopio de disección para dorsal imagen, el pie o pieles de cola que se sumerge en BBBA, aplastado debajo de un portaobjetos de vidrio, y todavía en el plato de cristal - este enfoque minimiza la contaminación BBBA del microscopio.
    2. Ilumine el plato de abajo. Para minimizar la variación espacial de la intensidad de la luz a través del campo de visión, elevar el plato de cristal con una altura ~ 10 cm por encima de la superficie de trabajo estándar del microscopio de disección y colocar un plástico difusor o placa de vidrio sobre la fuente de luz.
    3. Volver a la piel a etanol al 100% para el almacenamiento a largo plazo a -20 ° C.
      NOTA: Dejar la piel en BBBA durante más de un día hace que los gránulos de melanina para romper unparte. Una vez que la piel ha sido tratada BBBA se endurecerá y permanecer plana a partir de ese punto en adelante. Diferentes pieles pueden ser codificados con una serie de muescas en su anterior y / o posterior termina, de manera que se pueden almacenar junto, para ahorrar espacio en el congelador.
  2. Imaging and Tracing Axon Arbors (Figuras 3A, B)
    1. Coloque AP manchada piel (sección 3.1.3) entre dos placas de vidrio del tipo utilizado para pequeños geles de proteínas. Evitar la introducción de burbujas de aire entre las placas y la piel, y luego absorber cuidadosamente cualquier exceso BBBA con una toalla de papel. Coloque el sándwich de placa de piel plato sobre una platina del microscopio (Figura 2D).
    2. Use de campo brillante o iluminación DIC con un objetivo de 10X y 2 micras o 5 micras Z-pasos. Utilice una etapa XY mecanizada para capturar un montaje de imágenes XY que se cosen juntos para crear un conjunto de datos de escala de grises en tres dimensiones.
      NOTA: Para un solo gran cenador axón, este conjunto de datos puede ser uns grande que 5 GB.
    3. Realice manual, automatizado o semi-automatizado de rastreo de cenadores axón con cualquiera de una variedad de paquetes de software.
      NOTA: El software como Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) es una herramienta de reconstrucción neuronal gratuito que se ejecuta en un entorno de PC y es relativamente fácil de dominar 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De imágenes de campo claro de flatmounts piel se puede utilizar para imagen aferentes cutáneos sensoriales (Figura 3 A 10) y los patrones de folículos capilares a base de melanina pigmentación (Figura 4). De formación de imágenes confocal de flatmounts de la piel se puede utilizar para definir la geometría de (1) grupos de células de Merkel, visualizadas con anti-citoqueratina-6 o con la absorción de colorante AM (figuras 3I-L), (2) los músculos erectores del pelo, visualizado con anti- actina de músculo liso (Figuras 3G, H), (3) glándulas sebáceas, visualizadas con (4) folículos pilosos, visualizadas con un transgén KRT17-GFP o por tinción con anticuerpos anti-KRT17 Oil Red O (Figuras 3C-F), y 4 (Figuras 3E-G, K, L). Es sencillo para anotar manualmente las orientaciones y disposiciones espaciales de las estructuras de este tipo de imágenes mediante la colocación de los vectores de orientación conocida en las estructuras con Adobe Photoshop o Illustrator, y luego quantifying las poblaciones de vectores resultantes. Si bien este enfoque es suficiente para una escala de varios cientos de vectores, sería prohibitivamente tedioso en un 10 - o 100 veces mayor escala.

Figura 1
Figura 1. Esquema del cuero cabelludo de los mamíferos que muestra las principales estructuras. (Derecho de Autor, Terese Winslow.)

Figura 2
Figura 2. Disección de la piel y del manejo de la muestra. A) herramientas de disección. B) A P5 piel dorsal clavado en un plato Sylgard. C) Un P5 dorsal posterior de la piel del pie clavado en un plato Sylgard. D) Una piel dorsal montado entre 2 placas de gel de cristal para la imagen won un objetivo de 10X y DIC o iluminación de campo claro.

Figura 3
Figura 3. Estructuras de la piel en plano de montaje vistas. A, B) Un único cenador cutánea sensorial (izquierda) y su imagen de trazado (derecha) de una piel dorsal P21 de un Brn3a CKOAP / +;. NFL-CREER / + ratón expuestos a dosis bajas de tamoxifeno en el día gestacional 17 resultados Este protocolo en la recombinación mediada por Cre del reportero en una fracción muy pequeña de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal, y por lo tanto una pequeña fracción de cenadores sensoriales cutáneas están etiquetados con el de la fosfatasa alcalina (AP) reportero de la placenta humana. Los axones marcados se visualizaron con NBT / BCIP histoquímica. Brn3a se denomina de forma equivalente a como Pou4f1. C, D) de la piel de la cola se tiñeron con Oil Red O para visualizar las glándulas sebáceas a partirWT (izquierda) y Fz6 - / - (derecha) ratones a P21. La Fz6 - / - estructuras son desorganizados. P, proximal; . D, distal E, F) dorsal del pie de la piel de WT (izquierda) y Fz6 - / - (derecha) ratones portadores KRT17-GFP. La piel fue cosechado a P21 y se tiñó con Aceite Rojo O. La Fz6 - / - de la piel tiene un espiral de pelo en su centro. P, proximal; . D, distal G, H) Dorsal piel de un ratón WT en los folículos pilosos (P21 mostrando visualizados con un transgén KRT17-GFP y anti-GFP inmunotinción; panel de G) y los músculos erectores del pelo [visualizados con la actina anti-músculo liso (SMA ) inmunotinción; Panel H]. Profundidad en la imagen Z-pila confocal es un código de color. A, anterior; P, posterior. IL) Un grupo de células de Merkel (visualizado con inmunotinción cytokeratin8 o AM11-43 la absorción de colorante) y su folículo piloso central (visualizadas en los paneles de K y L con KRT17-GFP). Las imágenes se obtuvieron a partir de P1 piel dorsal de los genotipos indicados. La Fz6 - / - grupo de células Merkel forma un círculo cerrado, mientras que el grupo de células PESO Merkel está abierta hacia la parte anterior. A, anterior; P, posterior. Las barras de escala: A y B, 300 micras; C y D, 500 m; E y F, 500 m; G y H, 200 m; IL, 50 micras. (Paneles A y B se reproducen a partir elife y Proc. Natl. Acad. Sci.. EE.UU., con el permiso 4,10) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Pelo y los folículos pilosos de la piel dorsal en P1 y P7 visualizaron con la pigmentación de melanina. A, B) de la piel P1 de WT y Fz6 - / -. ratones C, D) de la piel P7 de FZ6 - / - ratones. Las barras de escala: A y B, de 500 micras; C y D, 1 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El dominio de los métodos de disección descritos anteriormente sólo requiere paciencia, una mano firme, y algunas buenas herramientas de disección. La disección de la piel dorsal es relativamente fácil, pero los de la cola y de la piel del pie disecciones - especialmente en las edades postnatales tempranas - son más difíciles. A edades tempranas prenatales (por ejemplo, antes de E15), la piel es difícil de quitar sin romperlo. Convenientemente, para muchos estudios sobre el crecimiento y el patrón de las estructuras de la piel en ratones, los eventos de interés se producen después del nacimiento, como se ve por ejemplo en los estudios sobre el crecimiento de los músculos erectores del pelo 19.

Imaging profundamente en la piel en una configuración plana de montaje es un reto porque la piel es un tejido relativamente refractantes. Este desafío se hace mayor ya que la piel madura, debido a la diferenciación y aumento del grosor de las capas constituyentes. Una solución parcial a este problema es separar la dermis y la epidermis y analizar la epidermises como una estructura separada ("epidérmicas montajes completos"). Este enfoque es útil para la visualización de los folículos pilosos y sus estructuras asociadas, especialmente para la piel de la cola del ratón. Sin embargo, la obtención de epidermis montajes enteros de alta calidad de la piel dorsal del ratón es difícil, presumiblemente debido a (1) la alta densidad de los folículos pilosos que se extienden profundamente en la dermis y (2) la delgadez de la epidermis interfolicular 13.

En nuestra experiencia, el tratamiento BBBA es un método altamente eficaz para la representación de la piel ópticamente transparente mientras que la preservación de las señales de inmunofluorescencia y sin la necesidad de separar las capas epidérmicas y dérmicas. Bencil-benzoato ha sido utilizada para eliminar los tejidos durante décadas 20 y es ampliamente utilizada para eliminar las ranas y peces embriones. Sin embargo, BBBA tiene la desventaja de que desnaturaliza GFP y otras proteínas fluorescentes, se disuelve Oil Red O, y que puede contaminar el equipo (por ejemplo, microscopios). Sería de interest para comparar sistemáticamente tratamiento BBBA de la piel con otros métodos de clarificación como SeeDB 21, ClearT 22, Escala 23, 3DISCO 24 y CLARITY 25, algunos de los cuales son compatibles con las proteínas fluorescentes. Si BBBA muestras tratadas son a ser fotografiado usando un microscopio de disección, un / microscopio convencional de luz fluorescente, o un microscopio confocal, las muestras deben ser colocados en un plato de vidrio o entre dos placas de vidrio grandes para minimizar la contaminación BBBA.

No hemos discutido el análisis de datos en detalle, ya que esto es más idiosincrásica a la cuestión biológica que se investiga. Sin embargo, como se señaló en la introducción, la presencia de muchas estructuras casi idénticas, como los folículos pilosos, las agrupaciones de células de Merkel, y las terminaciones nerviosas, y la exhaustividad con la que estas estructuras se pueden obtener imágenes en soportes planos proporciona una oportunidad para medir los parámetros estructurales o morfológicas en una ma estadísticamente rigurosanner, como se ve por ejemplo en los estudios recientes sobre cutáneas morfologías axones sensoriales 10 y de los folículos pilosos y las estructuras del folículo asociada en el tipo salvaje y ratones mutantes Fz6 4,8. Con el desarrollo de herramientas de análisis de imagen más sofisticadas, puede ser posible automatizar o semi-automatizar algunos de los análisis que, en la actualidad, se realizan de forma manual, lo que facilita un uso más amplio de la piel plana montar imágenes como un método de investigación de los principios subyacentes organización multicelular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) Roche 11383221001
AM1-43 Biotium 70024
AM4-65 Biotium 70039
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma  B-6630
Confocal microscope Zeiss LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody Sigma  C6198 1:400
Cytokeratin-8  Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-c 1:500
Dissecting microscope
Dissection tools  Fine Science Tools scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G EM Sciences 17984-25
Formalin Sigma HT501320
Glass dishes Pyrex  6 cm and 10 cm diameter
Glass plates Amersham Biosciences SE202P-10 10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover  Nair
Horizontal rotating platform  Hoefer PR250 Orbital shaker
Insect pins Fine Science Tools  26002-20
Ketamine/xylazine Sigma K113
Nitroblue tetrazolium (NBT) Roche  11383213001
Oil Red O Sigma O0625
Paraformaldehyde Sigma  P6148
Razor Blades VWR 55411-055
Secondary antibodies  Invitrogen Alexa-dye conjugated 
Sylgard-184 Fisher Scientific NC9020938
Tissue culture plastic dishes 10 cm diameter
Tissue culture plates 6- and 12-well 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rook's Textbook of Dermatology. 8th ed. Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. Wiley Blackwell. (2010).
  2. Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
  3. Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
  4. Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
  5. Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
  6. Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
  7. Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
  8. Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
  9. Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
  10. Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
  11. Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
  12. Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
  13. Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
  14. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  15. Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
  16. Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
  17. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
  18. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
  19. Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
  20. Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
  21. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  22. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  24. Aal Ertürk,, et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  25. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics