Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

Neuroscience

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Summary

Pele de mamíferos contém um diversificado leque de estruturas - como os folículos capilares e terminações nervosas - que apresentam padrões distintos de organização espacial. Analisando a pele como uma montagem plana aproveita a geometria 2-dimensional deste tecido para produzir de espessura total imagens de alta resolução de estruturas da pele.

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Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology. J. Vis. Exp. (88), e51749, doi:10.3791/51749 (2014).

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Abstract

A pele é um tecido altamente heterogêneo. Estruturas intra-dérmica incluem folículos pilosos, músculo eretor de pêlos, especializações epidérmicas (como aglomerados de células de Merkel), glândulas sebáceas, nervos e terminações nervosas e capilares. O arranjo espacial destas estruturas é rigidamente controlado numa escala microscópica - como pode ser visto, por exemplo, no arranjo ordenado de tipos de células dentro de um único folículo de cabelo - e numa escala macroscópica - como pode ser visto pelas orientações quase idênticas de milhares de cabelo folículos dentro de uma região local de pele. A visualização destas estruturas, sem seccionamento fisicamente a pele é possível por causa da geometria 2-dimensional deste órgão. Neste protocolo, que mostram que a pele do rato pode ser dissecado, fixo, permeabilizadas, manchado, e esclareceu como um objeto dimensional dois intactos, uma montagem plana. O protocolo permite a fácil visualização das estruturas da pele na sua totalidade, através de toda a espessura de grandes áreas da pele por optseccionamento iCal e reconstrução. Imagens dessas estruturas também podem ser integrados com a informação sobre a posição e orientação em relação aos eixos do corpo.

Introduction

A pele é um dos maiores órgãos do corpo, com funções importantes no somato-sensação, isolamento / termorregulação e defesa imunológica 1. Compreender a base molecular e celular do desenvolvimento da pele e função tem sido de interesse de longa data por causa da importância fundamental da pele como um sistema biológico e sua relevância para a dermatologia. Pele de mamíferos contém uma variedade de estruturas multicelulares, incluindo camadas estratificadas de queratinócitos, tecido conjuntivo dérmico, vários tipos de folículos capilares, glândulas sebáceas, músculo eretor de pêlos, vasos sanguíneos, e pelo menos uma dúzia de classes distintas de aferentes (sensoriais) e nervo eferente fibras (Figura 1). Diferentes regiões do corpo estão associadas com caracteristicamente diferentes tipos de pele. Na maioria dos mamíferos, quase toda a superfície corporal é coberta com pele que é densamente com folículos pilosos. [Os seres humanos e os ratos-toupeira pelados constituem exceções ao thé padrão.] cabelo está ausente das superfícies palmar das mãos e dos pés, que também estão associados a padrões especializados epidérmico (dermatoglyphs), as glândulas exócrinas, e terminações nervosas sensoriais. Os eventos celulares e moleculares que controlam o crescimento, diferenciação e arranjo espacial das células dentro do folículo piloso são de especial interesse como cada exposições do folículo, em miniatura, muitas das características centrais da organogênese 2. Esses recursos incluem a existência de células-tronco e um nicho de células-tronco, as migrações celulares precisamente coreografadas, ea montagem de estruturas multicelulares a partir de componentes embriologicamente distintas.

Este artigo descreve métodos para dissecar, fixação, rotulagem, e pele do rato de imagem como uma folha bidimensional intacto, referido como um "todo monte" ou "flat montar" preparação. Desde que a pele do rato é relativamente fina, é possível para a imagem em toda a espessura de esqui achatadan, usando microscopia confocal convencional. A abordagem plana de montagem para imagiologia pele de mamíferos é tecnicamente vantajosa, pois evita a necessidade de seccionamento físico, permitindo assim que as estruturas de ser reconstruído inteiramente por seccionamento óptico. Uma vez que quase toda a pele é processado como um único objecto, o plano de montagem abordagem também facilita a criação da imagem de várias regiões da superfície do corpo, enquanto preserva as informações sobre a posição e orientação em relação aos eixos do corpo. Finalmente, as estruturas dentro da pele estão tipicamente presentes em padrões que são repetidos em intervalos regulares, facilitando assim a obtenção de imagens a partir de vários representantes de uma dada estrutura. Estas características são familiares para neurobiologists que trabalham na retina, uma peça de duas dimensões do sistema nervoso central, que goza de vantagens análogas para estudos de morfologia neuronal 3.

A abordagem plana montar aqui descrito é de utilit especialy para o estudo das estruturas que exibem organização espacial numa escala relativamente grande dentro do plano bidimensional da pele. Um exemplo de organização espacial em larga escala é a polaridade coordenada dos folículos pilosos e as estruturas associadas ao folículo piloso - grupos de células de Merkel, músculos eretor do pêlo, glândulas sebáceas, e terminações nervosas 4. Os folículos do cabelo são orientados com um ângulo em relação ao plano da pele, e o componente do vector de folículo, que se situa dentro do plano da 2-dimensional da pele exibe geralmente uma orientação em relação aos eixos do corpo que é determinada com precisão para cada posição sobre o corpo. Por exemplo, os folículos pilosos no ponto de volta da rostral para caudal e cabelo na superfície dorsal dos pés apontam de proximal para distal. Orientação folículo de cabelo é controlado por planar sinalização polaridade celular (PCP, também chamado de polaridade de tecido 5). Este sistema de sinalização foi descoberto em Drosophila, onde um pequenoconjunto de genes de PCP núcleo foi encontrada para controlar a orientação dos cabelos cuticulares e cerdas. Três ortólogos de genes de mamíferos PCP fundamentais - homólogos frisado 6 (Fzd6, também conhecido como Fz6), caderina EGF LAG sete-pass G-receptor tipo 1 (Celsr1) e burro-like 2 (Vangl2) - exercer funções análogas em mamíferos pele, coordenando as orientações dos folículos pilosos com os eixos do corpo. Os estudos de camundongos knockout Fz6 (Fzd6 tm1Nat, doravante referida como Fz6 - / -) mostram que o defeito primário na ausência de sinalização PCP é uma randomização inicial ou desorganização da orientação folículo piloso, com nenhum efeito sobre a estrutura intrínseca dos folículos 6-8. Um segundo sistema não-PCP age mais tarde para promover alinhamento local de folículos próximos, o que leva à produção de padrões de cabelo em grande escala, tais como espirais e tufos.

Um segundo exemplo de grande escalaorganização espacial dentro da pele é visto nas morfologias de mandris axônios sensoriais. Neurônios sensoriais que inervam a pele têm seus corpos celulares na raiz dorsal e gânglios trigeminal. Estes neurônios detectar a temperatura, dor, prurido, e vários tipos de deformações mecânicas que incidem sobre a pele e cabelo 9. Eles podem ser divididos em subtipos baseados nas diâmetro e velocidade de condução axonal, a estrutura final do nervo terminal, e os padrões de expressão dos receptores, canais e outras moléculas. Devido à elevada densidade de inervação dentro da pele, as análises que envolvem a visualização de todos os axónios (por exemplo, a imunocoloração anti-neurofilamento) ou mesmo todos os axónios de uma classe única (como se vê quando um único tipo de célula está marcada pela expressão de um repórter fluorescente) geralmente revela uma sobreposição densa de axônios que faz com que seja impossível definir a morfologia de um mandril individual. Para contornar esse problema, temos utilizado extremamente escassa l geneticamente dirigidoAbeling para produzir amostras de pele dorsal, em que os mandris de axónios individuais bem isoladas são visualizadas através da expressão de um repórter histoquímica, fosfatase alcalina da placenta humana 10. Esta abordagem permite a visualização não ambígua de morfologias axônio mandril individuais e uma definição de tipos de neurônios somatossensorial com base em critérios morfológicos.

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Protocol

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os animais foram tratados de acordo com cuidados com os animais institucional e uso comitê aprovou (IACUC) protocolo MO11M29 das Instituições Médicas de Johns Hopkins. Consulte as diretrizes do Comitê Animal Care e Use Institucional locais para métodos aprovados de eutanásia. Use luvas, jaleco e óculos de segurança ao manusear fixadores aldeído ou solventes orgânicos.

1. Preparação de Materiais

  1. Derramando Placas Sylgard
    1. Seguir as instruções do fabricante, misturar o agente de cura com a base, e agita-se com uma vareta de plástico.
    2. Pipeta ~ 35 ml Sylgard líquido por 10 cm de diâmetro de cultura de tecidos prato. Placas de cultura de tecido são mais profundos do que os pratos bacterianos padrão; isso proporciona folga vertical para os pinos de insetos.
    3. Coloque o diela está numa superfície horizontal, à temperatura ambiente durante a noite. As bolhas formadas durante a mistura irá desaparecer.
    4. Após a polimerização, armazenar as placas de Sylgard à temperatura ambiente.
      NOTA: placas Sylgard pode ser armazenada à temperatura ambiente durante anos e re-utilizada várias vezes até que o Sylgard destaca do prato.
  2. Soluções
    1. Benzoato de benzilo e álcool benzílico (BBBA). Misturar 2 volumes de benzoato de benzilo e 1 volume de álcool benzílico. Loja no escuro em um frasco de vidro com tampa de vidro ou Teflon superior.
      CUIDADO: Usado BBBA devem ser adequadamente tratados como resíduos de solventes orgânicos. Não permita que BBBA entrar em contato com plástico.
    2. Salina tamponada com fosfato (PBS). Adiciona-se 4 g de PFA a 80 ml de água, adicionar 0,1 ml de NaOH 1 N, agita-se em uma placa quente a ~ 70 ° C durante ~ 5 min, até a PFA esteja completamente dissolvido, e depois adicionar 10 ml de 10x PBS e levar o volume até 100 ml com água.
      ATENÇÃO: A inalação de formaldeído / PFA e BBBA vapores deve serminimizado, mantendo estas soluções em recipientes cobertos. Formaldeído / PFA é uma substância cancerígena.
    3. Oil Red O. Prepare um estoque de 0,5% em isopropanol. Imediatamente antes da utilização diluída com água para uma concentração final de 0,3% de óleo Vermelho O, e depois filtrar através de um filtro de 0,2 um.

2. Dissecção da pele, fixação e Clearing

  1. Dorsais pele para Imunocoloração e Melanina Imagem
    1. Por muito jovem camundongos (por exemplo, os fetos e dia pós-natal (filhotes P) 0-P3), eutanásia os ratos por inalação de isoflurano. Eutanásia ratinhos mais velhos por inalação de isoflurano ou por injecção de cetamina / xilazina, seguido por deslocação cervical.
    2. Remova o cabelo com um barbeador elétrico e remoção gel de cabelo. Para ratos mais jovens do que P8, esta etapa pode ser ignorada.
    3. Use uma lâmina de barbear para fazer um corte horizontal da base da cauda, ​​ao longo de cada um dos flancos, que passa no lado dorsal da base de cada membro, procedendo lateral aos ouvidos e finalção no nariz.
    4. Descascar delicadamente a pele do tecido subjacente processo de posterior para anterior, mantendo a pele entre os dedos enluvados para que ele não fique prensado por fórceps. Ao descolar da pele ao nível das orelhas, primeiro cortar as orelhas com um par de tesouras e de proceder especialmente lentamente como a pele pode rasgar neste local.
    5. Deste ponto em diante, orientar a pele com o interior voltado para cima. Pin a pele para Sylgard com ~ 20 pinos de insetos uniformemente espaçados em torno da periferia; não o excesso de esticar a pele (Figura 2B). Cobrir a pele com 10-20 ml de PBS.
    6. Dissecar a gordura associada à pele e do tecido conjuntivo, utilizando um fórceps angulares ou curvadas, com a ponta do fórceps enfrentam horizontalmente para minimizar o risco de que a pinça irá penetrar a pele. Extrude as bolhas de ar que foram presos sob a pele delicadamente rolando um aplicador com ponta de algodão sobre a superfície da pele.
      NOTA: Se a pele está acontecendopara ser utilizado para a imunocoloração plana de montagem ou histoquímica, remover tanto do tecido conjuntivo que possível; se a pele que vai ser usado para visualizar os folículos capilares com base na pigmentação de melanina, a remoção de menos completa do tecido conjuntivo é satisfatória. Pele pré-natal requer o mínimo de "limpeza" de tecido conjuntivo aderente.
    7. Fixar a pele presa através da adição de 20 ml de preparado de fresco a 4% PFA / PBS ou 10% de formalina tamponada por placa de 10 cm Sylgard (se a pele vai ser utilizado para imagiologia de melanina ou fosfatase alcalina (AP) histoquímica) ou 20 ml de preparado de fresco 2% PFA / PBS (se a pele vai ser utilizado para a imunocoloração ou visualizar transgénico queratina (Krt) 17-GFP 11) e rode suavemente durante a noite num quarto frio. No dia seguinte, lava-PBS durante> 10 min.
      NOTA: formalina padrão é de 37% de formaldeído; portanto, "10% de formalina" é de 3,7% de formaldeído.
    8. Para a coloração AP e imunocoloração, continue na Seção 3. Para melanina imagção, desidratar a pele por meio de uma série de etanol graduada (70%, 95%, 100%), de um dia para cada passo, com rotação horizontal suave à temperatura ambiente. Remover tecidos conjuntivos residuais.
    9. Com a pele em etanol a 100%, remover os pinos de insectos e, se desejado, cortar a pele, com uma tesoura para remover a maior parte periférica de 1-2 mm da pele com os furos de pino.
    10. Transferir a pele de 10 cm de diâmetro prato de vidro, colocar duas lâminas de vidro sobre a pele para evitar que se enrolem, e adiciona-se 20 ml de BBBA. BBBA endurece rapidamente o tecido de modo que é importante para a pele a ser achatada sob o peso das placas de vidro antes da adição da BBBA.
    11. Durante as próximas horas, levante os slides fora da pele por alguns segundos para permitir que o BBBA para lavar a pele.
      NOTA: Usar luvas ao trabalhar com BBBA. Dependendo da idade e do local da pele que podem ser tanto quanto 30% de encolhimento em BBBA.
  2. Pé de pele de Análise de folículo piloso Patterning
    NOTA: O intervalo de idades normalmente examinados é P1-P8.
    1. Após a eutanásia, cortar os pés acima da articulação do tornozelo e fazer um único corte reto ao longo da superfície ventral através das solas dos pés.
    2. Suavemente tirar a pele a partir do tecido subjacente, Procedendo de proximal para distal.
    3. Cortar os dígitos para libertar a pele e fixá-lo ao Sylgard com a superfície interior voltada para cima (Figura 2C). Há tecido conjuntivo mínimo na pele do pé.
    4. Transgênicos Krt17-GFP pele já está pronto para a imagem latente. Para imagens melanina prosseguir com a fixação, desidratação e BBBA compensação conforme descrito na seção 2.1.
  3. Pé de pele para visualizar Glândulas sebáceas
    1. Após a eutanásia, remova o cabelo esfregando cabelo removedor de gel sobre a superfície da pele com um dedo de luva e polegar; esperar por 10 min.
      NOTA: Não use um barbeador elétrico, que irá danificar a delicada pele do pé.
    2. Wcinzas da superfície da pele com água da torneira, dissecar e fixar a pele para Sylgard como descrito na seção 2.2.
    3. Fixar com 1% PFA / PBS durante 30 min à temperatura ambiente e depois lavar com PBS.
      NOTA: Para visualizar as glândulas sebáceas nos pés, que se desenvolvem após a primeira semana pós-parto, a idade ideal para a análise com Oil Red O P21 é, porque isso marca o nadir da pigmentação do cabelo durante o primeiro ciclo do cabelo 12, e, portanto, as glândulas sebáceas pode ser visto mais facilmente. Com camundongos albino esta análise pode ser realizada em qualquer idade. Para obter albino progênie cruzada ratos mutantes pigmentada a uma linha mutante tirosinase como C57BL/6J-Tyr c-2J.
  4. Preparação da pele da cauda para a Análise da Distribuição melanina, folículo piloso Orientação e glândula sebácea Visualization
    1. Após a eutanásia, fazer um corte circular em volta da base da cauda, ​​e, em seguida, uma fenda longitudinal que atravessa o comprimento da cauda ao longo da sua face ventral.
    2. <li> Retire a pele da cauda a partir de ponta de agarrar firmemente a ponta da cauda, ​​osso e / ou tecido conjuntivo com um par de pinças e com a pele de um segundo par de fórceps. Pin a pele da cauda para Sylgard.
    3. Para a análise da distribuição da melanina e orientação folículo piloso, corrigir e processar a pele como descrito na seção 2.1. Para a análise das glândulas sebáceas, a pele da cauda cortada em uma série de segmentos de ~ 0,5 a 1 cm de comprimento, antes da fixação e incubar os pedaços de pele em mM EDTA PBS / 5 durante a noite a 37 ° C para enfraquecer a derme-epiderme adesão 13.
    4. Descascar delicadamente a epiderme da derme, o pino da epiderme para Sylgard (face up interior), e corrigi-lo em 4% PFA / PBS por 1 hora em temperatura ambiente. Lava-se com PBS, e são coradas com Oil Red O, tal como descrito abaixo.
      Observação: Uma máquina de barbear eléctrica e / ou remoção de gel para o cabelo pode ser usado antes da dissecação mais velhos pele da cauda (por exemplo, P21), mas este tratamento é opcional uma vez que o cabelo na cauda não étão densa como em qualquer outra parte do corpo.

3. Reações de Coloração

  1. Placenta humana de fosfatase alcalina (AP) histoquímica para Visualizar geneticamente marcado Axon mandris 10,14,15 (Figuras 3A, B)
    1. Após fixação em PFA Sylgard, coloque peles fixados em de 10 cm prato de vidro e submergir sob PBS / 1 mM MgCl2. Suavemente rodar o prato em um banho de água a 70 ° C durante 90 minutos para destruir a actividade de fosfatase endógena.
    2. Visualizar a actividade repórter AP histoquimicamente com 4-48 horas de incubação à temperatura ambiente, em 0,1 M de Tris, pH 9,5, 0,1 M de NaCl, 50 mM de MgCl2, 0,34 mg / ml de NBT, e 0,175 ug / ml BCIP, tipicamente usando 10-15 ml de solução de coloração por pele dorsal P21. Monitorar a reação sob o microscópio de dissecação, tomando cuidado para não deixá-lo prosseguir para além do tempo ideal, a julgar por inspeção visual da coloração axônio intensidade relativa à deposição de NBT inespecífica. Parar a reacção de lavagem com três mudanças de PBS/0.1% Tween-20 ao longo de 1 hora, re-pin as peles para Sylgard, desidratar as peles através de uma série de etanol, em seguida, transferir os skins para uma placa de 10 cm com BBBA.
      NOTA: BBBA dissolve lentamente o precipitado NBT. Durante as primeiras horas em BBBA, um fundo multa de precipitado NBT irá dissolver; como resultado, a solução BBBA vai escurecer, ea pele vai clarear. Mude para BBBA fresco depois de algumas horas.
    3. Depois de imagens do AP-pele manchada, transferi-lo para o etanol para> de 1 hora à temperatura ambiente e, em seguida, armazená-lo em etanol fresco à temperatura de -20 ° C. Peles AP-coradas pode ser armazenado nesta forma durante meses sem qualquer perda de sinal.
  2. Oil Red O Coloração para Visualize Glândulas sebáceas 4 (Figuras 3C-F)
    1. Retirar os pinos de insetos e transferir o pé levemente fixado ou peles cauda a partir da placa Sylgard para os poços de uma placa de 6 poços de cultura de tecidos, com a-se a duas amostras de pele por poço. Lava-se com 60:40 de isopropanol: água, durante 5 minutos à temperatura ambiente.
    2. Mancha em 2 ml de 0,3% Oil Red O em 60:40 isopropanol: água (ver secção 1.2) à temperatura ambiente por 2 horas.
    3. Lava-se com 60:40 de isopropanol: água, durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido por uma lavagem com água. Aparar cuidadosamente as arestas da pele, incluindo os furos de pino, com uma tesoura fina de modo a que a superfície da pele pode ser feita tão plana quanto possível.
    4. Coloque a pele em um slide com a superfície externa voltada para cima, adicione algumas gotas de água ou meio de montagem aquoso, cobrir a pele com uma lamela, e depois gravá suavemente a lamela para o slide para achatar ainda mais a pele.
  3. Monte Plano Imunocoloração 4,16,17 (Figura 3G, H)
    1. Corte um retângulo de pele PFA fixo (por exemplo, um centímetro x 0,5 cm), marcando a sua orientação com um corte assimétrico (por exemplo, o clipe de canto anterior direito). Realizar a incubação elavar passos com a rotação suave em uma plataforma horizontal de rotação. Nos poços de uma 6 - ou 12 poços da placa de cultura de tecidos, lavar várias vezes com PBS para remover o PFA residual, lavou-se com ~ 10 mudanças de PBS com 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBST) durante 5-8 horas a temperatura ambiente, para permeabilizar a pele.
    2. Incubar com anticorpo primário em PBST 0,3% com 5% de soro de cabra e 20% de DMSO, durante cinco dias à temperatura ambiente. Cubra os poços da placa com fita adesiva transparente ou plástico adesivo para eliminar perdas por evaporação.
    3. Lava-se com 10-15 mudanças de 0,3% PBST durante 5-8 hr e incubar com o anticorpo secundário em PBST 0,3% com 5% de soro de cabra e 20% de DMSO durante 3 dias à temperatura ambiente.
    4. Lava-se com 10-15 mudanças de 0,3% PBST mais 5-8 horas.
    5. Desidratar em 25%, 50%, e 75% de metanol durante 5 minutos cada e depois 3x em metanol a 100% durante 20 min cada.
    6. Limpar em BBBA noite à temperatura ambiente.
      NOTA: Plano de montagem imunocoloração de pele mais jovem do que~ P1 pode ser executada como descrito acima, mas com mais curto de incubação e lavagem vezes. Por exemplo, P1 pele pode ser imunocoradas com uma incubação durante a noite no anticorpo primário e um várias horas de incubação em anticorpo secundário, e com a intervenção de lavagens apenas 2-3 h em 0,3% de PBST. Como observado acima, as peles jovens são também suficientemente finas que podem ser visualizados sem BBBA compensação.
  4. Visualizando Merkel grupos de células com Nerve fluorescente Terminal Dye Captação (Figuras 3I-L)
    AMI-43 (verde) e AM4-65 (vermelho) são corantes fluorescentes solucionáveis ​​que entram as células via não-seletivo do canal de cátions 18. Na pele viva estes corantes são tomados selectivamente se e concentrou-se em células de Merkel.
    1. Dissolve-se 1 mg AM1-43 ou AM4-65 em 2 ml de PBS e armazenar-se em aliquotas a -80 ° C.
    2. Injetar filhotes recém-nascidos por via subcutânea com 2-10 mg de corante por grama de peso corporal usando uma agulha G 29.
    3. Um dia depois, a eutanásia os ratos e divulCT peles dorsais.
    4. Corrigir as peles em PFA 4% / PBS a 4 ° C durante a noite, lavar com PBS, e montar a pele como descrito na seção 3.2.

4. Imagem e Análise de Imagem

  1. Imagiologia Orientação folículo piloso (Figura 4)
    1. Use de um microscópio de dissecação para dorsal da imagem, pé, ou peles de cauda que estão submersos em BBBA, achatada sob uma lâmina de vidro, e ainda no prato de vidro - esta abordagem minimiza a contaminação BBBA do microscópio.
    2. Iluminar o prato abaixo. Para minimizar a variação espacial da intensidade de luz em todo o campo de visão, elevar o prato de vidro para uma altura de ~ 10 cm acima da superfície de trabalho normal do microscópio de dissecação e colocar um difusor de plástico ou chapa de vidro ao longo da fonte de luz.
    3. E volta a pele de etanol a 100% para o armazenamento a longo prazo a -20 ° C.
      NOTA: Deixar a pele em BBBA por mais de um dia faz com que os grânulos de melanina para quebrar umparte. Uma vez que a pele foi tratada BBBA ele vai endurecer e permanecer estáveis ​​a partir desse ponto em diante. Diferentes peles pode ser codificada com uma série de entalhes na sua anterior e / ou posterior termina, de modo a que possam ser juntos armazenar, para economizar espaço no congelador.
  2. Imagem e Rastreamento Axon mandris (Figuras 3A, B)
    1. Coloque AP manchado da pele (seção 3.1.3) entre duas placas de vidro, do tipo usado para pequenas géis de proteína. Evite a introdução de bolhas de ar entre as placas e da pele, e, então, cuidadosamente pavio fora qualquer excesso BBBA com uma toalha de papel. Colocar a placa de sanduíche de pele de placa em um estágio de microscópio (Figura 2D).
    2. Use de campo claro ou DIC iluminação com uma objetiva de 10X e 2 m ou 5 m Z-passos. Use um estágio XY mecanizada para capturar uma montagem de imagens XY que são costuradas juntas para criar um único conjunto de dados tridimensional em escala de cinza.
      NOTA: Para uma única grande caramanchão axônio, este conjunto de dados pode ser umé maior do que 5 GB.
    3. Realize manual, automático ou semi-automático de rastreamento de pavilhões axônio com qualquer um de uma variedade de pacotes de software.
      ATENÇÃO: Software como Neuromantic (http://www.reading.ac.uk/neuromantic/) é uma ferramenta de reconstrução neuronal gratuito que é executado em um ambiente de PC e é relativamente fácil de dominar 10.

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Representative Results

Brightfield imagiologia de flatmounts de pele pode ser utilizado para imagem aferentes sensoriais cutâneas (Figura 3A) e 10 padrões de folículos de cabelo com base na pigmentação de melanina (Figura 4). Imagem confocal de flatmounts pele pode ser utilizada para definir a geometria da (1) de agregados de células de Merkel, visualizadas com anticorpos anti-citoqueratina-6 ou com a absorção do corante AM (Figuras 3I-l), (2) os músculos arrector pili, visualizadas com anti- actina do músculo liso (Figuras 3G, H), (3) das glândulas sebáceas, visualizadas com Oil Red O (Figuras 3C-F), e (4) os folículos pilosos, visualizadas com um transgene Krt17-GFP ou através de coloração com anticorpos anti-Krt17 4 (Figuras 3E-G, K, L). É simples de marcar manualmente as orientações e arranjos espaciais de estruturas em tais imagens, colocando vetores de orientação conhecido sobre as estruturas usando o Adobe Photoshop ou Illustrator, e depois quantifying as populações de vetores resultantes. Enquanto esta abordagem é suficiente para uma escala de várias centenas de vectores, seria proibitivamente tedioso em 10 -, ou 100 vezes maior escala.

Figura 1
Figura 1. Esquema de pele aveludada de mamíferos, mostrando as principais estruturas. (Copyright, Terese Winslow.)

Figura 2
Figura 2. Dissecção da pele e manuseio da amostra. A) ferramentas de dissecação. B) A P5 pele dorsal preso a uma placa Sylgard. C) A P5 dorsal posterior pele do pé preso a uma placa Sylgard. D) A pele dorsal montada entre duas placas de gel de vidro para imagens wom uma objetiva de 10X e DIC ou iluminação de campo claro.

Figura 3
Estruturas Figura 3. Pele em plana montar pontos de vista. A, B) Um único caramanchão cutânea sensorial (à esquerda) e sua imagem traçada (à direita) de uma pele P21 dorsal de um Brn3a CKOAP / +;. NFL-creer / + rato expostos a baixas doses de tamoxifeno no dia gestacional 17 resultados deste protocolo na recombinação Cre-mediada da repórter em uma fração muito pequena de neurônios do gânglio da raiz dorsal, e, portanto, uma pequena fração de pavilhões sensoriais cutâneos são rotulados com a placenta, fosfatase alcalina (AP) repórter humano. Os axónios marcados são visualizados com NBT / BCIP histoquímica. Brn3a equivalentemente referido como Pou4f1. C, D) da pele da cauda coradas com Oil Red O para visualizar a partir de glândulas sebáceasWT (esquerda) e Fz6 - / - ratos (direita) no P21. FZ6 - / - estruturas são desorganizados. P, proximal; . D, distal E, F) Dorsal pé pele do WT (esquerda) e Fz6 - / - (direita) ratos portadores Krt17-GFP. A pele foi colhida em P21 e coradas com Oil Red O. FZ6 - / - a pele tem uma espiral de cabelo no seu centro. P, proximal; . D, distal G, H) da pele dorsal de um rato WT no P21 mostrando folículos pilosos (visualizadas com um transgene Krt17-GFP e anti-GFP immunostaining; painel G) e músculo eretor de pêlos [visualizadas com a actina anti-músculo liso (SMA ) immunostaining; painel H]. Profundidade da imagem Z-stack confocal dentro de um código de cores. A, anterior; P, posterior. IL) aglomerado de células A Merkel (visualizado com imunocoloração cytokeratin8 ou AM11-43 corante captação) e seu folículo capilar central (visualizado em painéis K e L com Krt17-GFP). As imagens foram obtidas a partir de P1 pele dorsal a partir dos genótipos indicados. FZ6 - / - aglomerado de células de Merkel forma um círculo fechado, enquanto que o grupo de células WT Merkel está aberto para a anterior. A, anterior; P, posterior. Barras de escala: A e B, 300 mm; C e D, 500 mm; E e F, 500 mm; G e H, 200 mM; IL, 50 um. (Painéis A e B são reproduzidas a partir de eLife e Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, com a permissão 4,10) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Cabelo e folículos pilosos na pele dorsal em P1 e P7 visualizado com pigmentação melânica. A, B) P1 pele do WT e Fz6 - / -. camundongos C, D) da pele P7 de Fz6 - / - ratos. Barras de escala: A e B, 500 mm; C e D, em 1 mm.

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Discussion

Domínio dos métodos de dissecação descritos acima requer apenas paciência, uma mão firme, e algumas boas ferramentas de dissecação. A pele dissecção dorsal é relativamente fácil, mas a cauda e pele pé dissecações - especialmente em idades pós-natais - são mais exigentes. Em idades precoces pré-natal (por exemplo, antes de E15), a pele é difícil de remover, sem rasgá-la. Convenientemente, para muitos estudos de crescimento e padronização de estruturas da pele em ratos, os eventos de interesse ocorrer após o nascimento, como se vê, por exemplo, em estudos de crescimento de músculo eretor de pêlos 19.

Imagem profundamente na pele em uma configuração plana de montagem é um desafio, porque a pele é um tecido relativamente refractivo. Este desafio torna-se maior à medida que a pele amadurece devido à diferenciação, aumento da espessura das suas camadas constituintes. Uma solução parcial para este problema é a de separar da derme e da epiderme e analisar a epidermeé como uma estrutura separada ("epidérmicas montagens inteiras"). Esta abordagem é útil para a visualização de folículos pilosos e das suas estruturas associadas, especialmente para a pele da cauda do rato. No entanto, a obtenção de alta qualidade epidérmicas peças inteiras de pele dorsal do rato é difícil, presumivelmente devido a (1) a alta densidade de folículos de cabelo, que se estendem para dentro da derme profunda e (2) a espessura da epiderme interfoliculares 13.

Na nossa experiência, o tratamento BBBA é um método altamente eficaz para render pele opticamente transparente, preservando sinais imunofluorescentes, sem a necessidade de separar as camadas da epiderme e da derme. Benzil-benzoato foi usada para limpar os tecidos de décadas de 20 e é amplamente usada para limpar os embriões de rã e de peixes. No entanto, BBBA tem a desvantagem de que desnatura a GFP e outras proteínas fluorescentes, dissolve-se o óleo Vermelho O, e que podem contaminar o equipamento (por exemplo, microscópios). Seria de interest para comparar sistematicamente BBBA tratamento da pele com outros métodos de clarificação tais como SeeDB 21, ClearT 22, Escala 23, 3DISCO 24, 25 e clareza, alguns dos quais são compatíveis com as proteínas fluorescentes. Se BBBA amostras tratadas estão a ser visualizados utilizando um microscópio de dissecação, um microscópio óptico / fluorescente convencional, ou um microscópio confocal, as amostras devem ser colocados num prato de vidro ou entre duas grandes placas de vidro para minimizar a contaminação BBBA.

Não discutimos a análise de dados em detalhes, pois isso é mais idiossincrático para a questão biológica sob investigação. No entanto, como referido na introdução, a presença de muitas estruturas quase idênticas, como folículos pilosos, grupos de células de Merkel, e terminações nervosas, ea integridade com que estas estruturas podem ser espelhados em montagens planas oferece uma oportunidade para medir parâmetros estruturais ou morfológicas em uma ma estatisticamente rigorosonner, como se vê, por exemplo, em estudos recentes do cutâneas morfologias axônios sensitivos 10 e dos folículos pilosos e as estruturas associadas ao folículo em tipo selvagem e Fz6 ratos mutantes 4,8. Com o desenvolvimento de ferramentas de análise de imagem mais sofisticados, pode ser possível a automatização ou semi-automatizar algumas das análises que, no momento, são executadas manualmente, facilitando, assim, uma utilização mais ampla da pele plana de montagem de imagem, como um método para a pesquisa dos princípios subjacentes organização multicelular.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) Roche 11383221001
AM1-43 Biotium 70024
AM4-65 Biotium 70039
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma  B-6630
Confocal microscope Zeiss LSM700
Cy3-alpha smooth muscle actin antibody Sigma  C6198 1:400
Cytokeratin-8  Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-I-c 1:500
Dissecting microscope
Dissection tools  Fine Science Tools scissors and forceps
Electric razor
Fluoromount G EM Sciences 17984-25
Formalin Sigma HT501320
Glass dishes Pyrex  6 cm and 10 cm diameter
Glass plates Amersham Biosciences SE202P-10 10 cm x 8 cm x 1 mm
Hair remover  Nair
Horizontal rotating platform  Hoefer PR250 Orbital shaker
Insect pins Fine Science Tools  26002-20
Ketamine/xylazine Sigma K113
Nitroblue tetrazolium (NBT) Roche  11383213001
Oil Red O Sigma O0625
Paraformaldehyde Sigma  P6148
Razor Blades VWR 55411-055
Secondary antibodies  Invitrogen Alexa-dye conjugated 
Sylgard-184 Fisher Scientific NC9020938
Tissue culture plastic dishes 10 cm diameter
Tissue culture plates 6- and 12-well 

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References

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